食品中致病菌和病毒

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1、第 八 章 食 品 中 致 病 菌 和 病 毒 8.1 肠 杆 菌 科肠 杆 菌 科 是 存 在 于 人 和 动 物 肠 道 或 自 然 界 中 的一 群 生 物 学 性 状 很 相 似 的 革 兰 氏 阴 性 短 小 杆 菌 。无 芽 孢 ， 多 数 有 周 身 鞭 毛 ， 能 运 动 。在 普 通 培 养 基 上 能 生 长 。培 养 温 度 为 35C。需 氧 或 兼 性 厌 氧 。能 还 原 硝 酸 盐 为 亚 硝 酸 盐 ， 氧 化 酶 试 验 阴 性 ，触 酶 试 验 阳 性 。 8.1.1大 肠 杆 菌大 肠 杆 菌 E. coli是 肠 道 正 常 菌 群 。 一 般 情 况

2、下 ，多 不 致 病 ， 是 人 和 动 物 肠 道 中 的 常 居 菌 。在 一 定 条 件 下 ， 可 引 起 肠 道 道 外 感 染 。致 病 性 大 肠 杆 菌 ： 肠 产 毒 性 大 肠 杆 菌（ Enterotoxigenic E. coli); 肠 致 病 性 大 肠 杆 菌（ Enteropathogenic E. coli); 肠 侵 袭 性 大 肠 杆 菌（ Enteroinvasive E. coli); 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌（ Enterohemorrhagic E. coli)。 引 起 腹 泻 、 出 血性 肠 炎 。 肠 产 毒 性 大 肠 杆 菌 （

3、Enterotoxigenic E. coli， ETEC)v引 起 婴 幼 儿 和 旅 游 者 腹 泻 ， 出 现 轻 度 水泻 ， 也 可 呈 严 重 霍 乱 样 症 状 。 腹 泻 常 为自 限 性 ， 一 般 23d即 愈 。v鉴 定 ETEC主 要 测 定 大 肠 杆 菌 肠 毒 素 ，血 清 型 有 一 定 的 参 考 意 义 。 v肠 致 病 性 大 肠 杆 菌 （ Enteropathogenic E. coli， EPEC)是 婴 儿 腹 泻 的 主 要 病 原 菌 ，具 有 高 度 传 染 性 ， 严 重 者 可 致 死 ， 成 人少 见 。 EPEC产 生 VT毒 素 。

4、 VT毒 素 具 有神 经 毒 素 、 细 胞 毒 素 和 肠 毒 素 性 。v鉴 定 EPEC根 据 临 床 表 现 和 血 清 型 。肠 致 病 性 大 肠 杆 菌 肠 侵 袭 性 大 肠 杆 菌 （ Enteroinvasive E. coli，EIEC)EIEC的 多 数 菌 株 无 动 力 ， 生 化 反 应 和 抗原 结 构 均 类 似 痢 疾 杆 菌 。EIEC可 引 起 豚 鼠 角 结 合 膜 炎 ， 临 床 上 可借 此 协 助 鉴 定 EIEC。 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 （ Enterohemorrhagic E. coli，EHEC)可 引 起 散 发 性 或 爆

5、 发 性 出 血 性 结 肠 炎 。 主要 菌 型 是 O157： H7， 还 可 有 O26、 O111、 O103、 O145等 。1996年 O157： H7在 日 本 引 起 万 人 的 食 物 中 毒 ， 此外 ， 美 国 、 加 拿 大 、 瑞 典 、 澳 大 利 亚 、 英 国 等 国家 和 地 区 相 继 报 道 了 EHEC O157： H7的 散 发 性 感染 和 爆 发 流 行 。我 国 于 1999年 在 苏 、 皖 、 鲁 、 豫 发 生 爆 发 流 行 。肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157: H7的 检 验 方 法 ：1、 培

6、养 基 制 备 改 良 EC新 生 霉 素 增 菌 肉 汤 （ mEC） ： EC肉 汤 灭 菌 后 添加 20mg/mL过 滤 除 菌 的 新 生 霉 素 ， 使 终 浓 度 为 20g/mL。 改 良 山 梨 醇 麦 康 凯 琼 脂 （ TC-SMAC） ： 山 梨 醇 麦 康 凯 琼脂 加 入 过 滤 除 菌 的 1%亚 碲 酸 钾 溶 液 ， 使 终 浓 度 2.5mg/L，头 孢 克 污 ， 使 终 浓 度 为 0.05mg/L。 MUG-LST肉 汤 ： LST肉 汤 中 添 加 4-甲 基 伞 形 酮 -D-葡 萄糖 醛 酸 苷 （ MUG） ， 使 终 浓 度 为 0.1g/L

7、。2、 增 菌 培 养 称 取 25克 样 品 放 入 225mL mEC中 ， 均 质 。 于 41 1 培 养18-24小 时 。 3、 分 离 将 mEC肉 汤 培 养 物 10倍 递 增 稀 释 。 从 10-4， 10-5， 10-6稀 释 度 ， 各 取0.1mL涂 布 于 TC-SMAC平 板 。 于 36 1 培 养 1824小 时 。 可 疑 EHEC O157:H7菌 落 扁 平 ， 透 明 或 半 透 明 ， 边 缘 光 滑 ， 呈 淡 褐 色 中心 ， 直 径 约 2mm。4、 鉴 定 挑 取 TC-SMAC上 的 可 疑 菌 落 ， 接 种 MUG-LST， 于 36

8、 1 培 养 1824小时 ， 出 现 产 气 ， 且 无 荧 光 者 ， 分 离 到 普 通 营 养 琼 脂 。 对 纯 菌 落 用 EHEC O 157:H7标 准 血 清 或 胶 乳 凝 集 试 剂 作 凝 集 试 验 ， 必 要 时进 行 生 化 试 验 。 在 检 测 过 程 中 ， 也 可 以 在 选 择 性 增 菌 后 ， 取 出 5mL增 菌 液 ， 经 100 水浴 15分 钟 灭 活 后 ， 供 自 动 酶 联 荧 光 免 疫 测 试 （ VIDAS） ， 迅 速 获 得 初 步结 果 ， 阳 性 反 应 者 需 作 进 一 步 证 实 。 EHEC O157:H7检 验

9、程 序 图 解 检 样 25g mEC225mL 酶 联 荧 光 免 疫 测 试 VIDAS快 速 筛 选 41 1 ， 18-24h 10-4， 10-5， 10-6稀 释 度 涂 布 TC-SMAC 36 1 ， 18-24h 挑 取 5-10个 可 疑 菌 落 接 种 MUG-LST 36 1 ， 18-24h MUG阴 性 培 养 物 转 种 普 通 营 养 琼 脂 生 化 反 应 鉴 定 血 清 凝 集 鉴 定 或 胶 乳 凝 集 试 验 生 化 试 验 ：将 斜 面 培 养 物 移 种 到 下 列 培 养 基 中 进 行 生 化 试 验 。 1 色 氨 酸 肉 汤 ： 在 36 1

10、 培 养 24 2h后 ,加 Kovacs氏 试 剂 0.2 0.3m L,上 层出 现 红 色 为 靛 基 质 阳 性 反 应 。2 MR-VP培 养 基 ： 在 36 1 培 养 48 2h。 以 无 菌 操 作 移 取 培 养 物 1 m L至 13m m 100m m 试 管 中 ,加 5 -萘 酚 乙 醇 溶 液 0.6m L,40 氢 氧 化 钾 溶液 0.2m L和 少 许 肌 酸 结 晶 ,振 摇 试 管 后 静 置 2h,如 出 现 伊 红 色 ,为 VP试 验阳 性 。将 MR-VP培 养 物 的 剩 余 部 分 再 培 养 48h滴 加 5 滴 甲 基 红 溶 液 。 如

11、 培 养物 变 红 色 ,为 甲 基 红 试 验 阳 性 ,若 变 黄 色 则 为 阴 性 反 应 。3 Koser氏 枸 椽 酸 盐 肉 汤 ： 于 36 1 培 养 96h记 录 有 无 生 长 。4 LST肉 汤 ： 于 36 1 培 养 48 2h,观 察 试 管 中 是 否 产 气 。 5 革 兰 氏 染 色 ： 取 18h营 养 琼 脂 斜 面 培 养 物 作 革 兰 氏 染 色 。 大 肠 杆 菌 为 革兰 氏 阴 性 。 靛 基 质 （ Indole） 试 验 ： 某 些 细 菌 能 分 解 蛋 白 胨 中 的 色 氨 酸 ， 生 成 吲 哚 。吲 哚 的 存 在 可 用 显

12、色 反 应 表 现 出 来 。 吲 哚 与 对 二甲 基 氨 基 苯 醛 结 合 ， 形 成 玫 瑰 吲 哚 ， 为 红 色 化 合物 。 试 验 方 法 ： 将 待 试 纯 培 养 物 小 量 接 种 于 试 验 培 养基 管 ， 于 36 1C培 养 24h时 后 ， 取 约 2ml培 养 液 ，加 入 Kovacs氏 试 剂 23滴 ， 轻 摇 试 管 ， 呈 红 色 为阳 性 ， 或 先 加 少 量 乙 醚 或 二 甲 苯 ， 摇 动 试 管 以 提取 和 浓 缩 靛 基 质 ， 待 其 浮 于 培 养 液 表 面 后 ， 再 沿试 管 壁 徐 缓 加 入 Kovacs氏 试 剂 数

13、滴 ， 在 接 触 面 呈红 色 ， 即 为 阳 性 。 甲 基 红 （ Methyl Red） 试 验 肠 杆 菌 科 各 菌 属 都 能 发 酵 葡 萄 糖 ， 在 分 解 葡 萄 糖 过 程中 产 生 丙 酮 酸 ， 进 一 步 分 解 中 ， 由 于 糖 代 谢 的 途 径 不同 ， 可 产 生 乳 酸 ， 琥 珀 酸 、 醋 酸 和 甲 酸 等 大 量 酸 性 产物 ， 可 使 培 养 基 PH值 下 降 至 pH4.5以 下 ， 使 甲 基 红 指示 剂 变 红 。V-P试 验 某 些 细 菌 在 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 中 能 分 解 葡 萄 糖 产生 丙 酮 酸

14、 ， 丙 酮 酸 缩 合 ， 脱 羧 成 乙 酰 甲 基 甲 醇 ， 后 者在 强 碱 环 境 下 ， 被 空 气 中 氧 氧 化 为 二 乙 酰 ， 二 乙 酰 与蛋 白 胨 中 的 胍 基 生 成 红 色 化 合 物 ， 称 V P（ +） 反 应 。 大 肠 杆 菌 ： MR + /VP - 枸 椽 酸 盐 试 验 ： 某 些 细 菌 能 利 用 枸 椽 酸 盐 作 为 碳 源 ， 及 磷 酸 铵作 为 氮 源 ， 将 枸 椽 酸 盐 分 解 为 二 氧 化 碳 ， 培 养基 反 应 后 成 碱 性 ， 由 于 指 示 剂 的 作 用 ， 培 养 基变 为 兰 色 。 用 上 述 方 法

15、 在 样 品 中 分 离 获 得 的 纯 菌 落 ，经 抗 E.coli O157:H7标 准 血 清 或 EHEC O157:H7胶 乳 凝 集 测 试 为 阳 性 者 ， 报 告 检 出肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157:H7。 如 需 要 进 一 步 检 测 Vero毒 素 基 因 的 存 在 ，可 通 过 接 种 Vero细 胞 或 Hela细 胞 ， 观 察 细胞 病 变 进 行 判 定 ， 或 可 使 用 基 因 探 针 检 测和 聚 合 酶 链 反 应 （ PCR） 检 测 法 。 大 肠 杆 菌 的 检 测（ 1） 常 规 检 测 方 法 国 家 标 准 ： 国 家 标

16、准 采 用 三 步 法 ， 即 ： 乳 糖 发 酵 试 验 、 分 离培 养 和 证 实 试 验 。 乳 糖 发 酵 试 验 ： 样 品 稀 释 后 ， 选 择 三 个 稀 释 度 ， 每 个 稀 释 度接 种 三 管 乳 糖 胆 盐 发 酵 管 。 36 1 培 养 48 2h， 观 察 是 否产 气 。 分 离 培 养 ： 将 产 气 发 酵 管 培 养 物 转 种 于 伊 红 美 蓝 琼 脂 平 板 上 ，36 1 培 养 18-24h， 观 察 菌 落 形 态 。 证 实 试 验 ： 挑 取 平 板 上 的 可 疑 菌 落 ， 进 行 革 兰 氏 染 色 观 察 。同 时 接 种 乳

17、糖 发 酵 管 36 1 培 养 24 2h， 观 察 产 气 情 况 。 报 告 ： 根 据 证 实 为 大 肠 杆 菌 阳 性 的 管 数 ， 查 MPN表 ， 报 告 每100ml（ g） 大 肠 菌 群 的 MPN值 。 原 国 家 商 检 局 制 订 的 行 业 标 准 ， 等 效 采 用 美 国 FDA的标 准 方 法 ， 用 于 对 出 口 食 品 中 的 大 肠 杆 菌 进 行 检 测 。本 方 法 采 用 两 步 法 ： 推 测 试 验 ： 样 品 稀 释 后 ， 选 择 三 个 稀 释 度 ， 每 个 稀 释度 接 种 三 管 LST肉 汤 。 36 1 培 养 48 2h

18、， 观 察 是 否产 气 。 证 实 试 验 ： 将 产 气 管 培 养 物 接 种 煌 绿 乳 糖 胆 盐（ BGLB） 肉 汤 管 中 ， 36 1 培 养 48 2h， 观 察 是 否产 气 。 以 BGLB产 气 为 阳 性 。 查 MPN表 ， 报 告 每 ml(g)样 品 中 大 肠 菌 群 的 MPN值 。 (2) PCR方 法大 肠 杆 菌 是 食 品 和 水 源 污 染 粪 便 的 指 示 菌 。Gene-TARK研 制 出 用 浸 染 棒 检 测 大 肠 杆 菌 中16SrRNA的 探 针 ， 样 品 需 前 增 菌 处 理 ， 以 异 硫氰 荧 光 素 （ FITC） 标

19、 记 探 针 ， 再 用 辣 根 过 氧化 物 酶 标 记 抗 FITC抗 体 检 测 杂 交 复 合 物 。Hsu等 报 导 此 方 法 特 异 性 （ 除 相 近 的 志 贺 氏 菌外 ） 达 100 ， 假 阳 性 率 达 1.2 。 8.1.2 沙 门 氏 菌 属 （ Salmonella)v沙 门 氏 菌 是 引 起 食 物 中 毒 的 重 要 病 原 菌 。 在 世 界 各国 各 类 细 菌 性 的 食 物 中 毒 中 ， 沙 门 氏 菌 常 居 前 列 。因 此 ， 沙 门 氏 菌 的 检 测 是 各 国 检 验 机 构 对 多 种 进 出口 食 品 的 必 检 项 目 之 一

20、。v沙 门 氏 菌 属 是 肠 杆 菌 科 中 最 复 杂 的 菌 属 。 它 属 于 革兰 氏 阴 性 杆 菌 。 可 根 据 沙 门 氏 菌 的 菌 体 抗 原 （ O抗原 ） 分 群 （ A, B, C等 ） ， 再 根 据 其 鞭 毛 抗 原 （ H抗原 ） 分 血 清 型 （ 1、 2等 ） 。 沙 门 氏 菌 不 产 生 外 毒 素 ， 但 能 产 生 毒 力 较 强 的内 毒 素 。 沙 门 氏 菌 主 要 通 过 食 物 、 饮 水 经 口 感 染 。 可 存在 多 种 食 物 中 ， 包 括 生 肉 、 禽 、 蛋 、 奶 制 品 、虾 、 鱼 和 田 鸡 腿 等 。 沙 门

21、 氏 菌 主 要 通 过 食 物 、 饮 水 经 口 感 染 。 根 据侵 入 机 体 沙 门 氏 菌 菌 种 的 不 同 ， 在 临 床 上 引 起四 种 不 同 的 疾 病 。 （ 1） 伤 寒 、 副 伤 寒 由 沙 门 氏 属 中 的 伤 寒 杆 菌 和 甲 、 乙 、 丙 型 副 伤 寒 杆 菌 引起 。（ 2） 食 物 中 毒 沙 门 氏 菌 属 引 起 的 食 物 中 毒 ， 主 要 以 肠 炎 杆 菌 、 鼠 伤 寒杆 菌 、 猪 霍 乱 杆 菌 、 丙 型 副 伤 寒 杆 菌 和 汤 普 逊 杆 菌 等 最为 多 见 。 临 床 症 状 主 要 是 胃 肠 炎 。 病 程 较

22、 短 ， 一 般 24d, 可 完 全 恢 复 。（ 3） 败 血 症 多 为 猪 霍 乱 杆 菌 引 起 ， 甲 、 乙 、 丙 型 副 伤 寒 杆 菌 和 肠 炎杆 菌 亦 可 引 起 败 血 症 。（ 4） 慢 性 肠 炎 沙 门 氏 杆 菌 可 引 起 慢 性 、 持 久 性 肠 炎 。 从 食 品 中 分 离 沙 门 氏 菌 样 品 制 备 由 于 食 品 种 类 繁 多 ， 且 每 类 中 包 括 许 多 品 种 。 因 其 加 工 方式 不 同 ， 导 致 性 状 各 异 。 故 在 进 行 微 生 物 学 检 验 时 ， 应 按不 同 的 形 状 、 加 工 方 式 及 检 验

23、 目 的 合 理 进 行 检 样 处 理 。检 样 处 理 冷 冻 的 检 样 在 检 样 前 最 好 不 要 解 冻 ， 将 沙 门 氏 菌 的 损 伤 降低 到 最 低 限 度 。 粉 状 样 品 应 将 225ml增 菌 液 分 数 次 加 入 ， 并 用 灭 菌 玻 棒 搅 拌成 均 匀 悬 液 。 带 壳 蛋 类 在 流 水 下 用 刷 子 刷 洗 蛋 类 ， 并 沥 干 。 将 蛋 类 在 含0.1 十 二 烷 基 磺 酸 钠 的 200mg/kg Cl -溶 液 中 浸 泡 30min后 方可 破 壳 取 蛋 。 检 测 方 法 从 食 品 中 分 离 和 鉴 定 沙 门 氏 菌

24、 ， 当 前 通 常 采 用 的 方 法 共 分5个 步 骤 ： 前 增 菌 ： 食 品 样 品 在 含 有 营 养 的 非 选 择 性 培 养 基 中 增 菌 ，使 受 损 伤 的 沙 门 氏 菌 细 胞 恢 复 到 稳 定 的 生 理 状 态 。 选 择 性 增 菌 ： 此 培 养 基 允 许 沙 门 氏 菌 持 续 增 菌 ， 同 时 阻 止大 多 数 其 他 细 菌 的 增 殖 。 选 择 性 平 板 分 离 ： 采 用 固 体 选 择 培 养 基 ， 抑 制 非 沙 门 氏 菌的 生 长 ， 提 供 肉 眼 可 见 的 疑 似 沙 门 氏 菌 纯 菌 落 的 识 别 。 生 物 化

25、学 筛 选 ： 排 除 大 多 数 非 沙 门 氏 菌 ， 也 提 供 了 沙 门 氏菌 培 养 物 菌 属 的 初 步 鉴 定 。 血 清 学 技 术 鉴 定 培 养 物 菌 种 。 （ 1） 沙 门 氏 菌 的 增 菌 和 分 离 预 增 菌 将 制 备 好 的 预 增 菌 试 液 于 35 培 养 24h后 ，轻 轻 振 摇 培 养 液 。 选 择 性 增 菌 选 择 性 平 板 分 离 混 匀 培 养 物 ， 用 直 径 3mm的 接 种环 ， 1满 环 （ 10ul） 分 别 划 线 接 种 于 亚 硫 酸 铋 （ BS）琼 脂 、 木 糖 赖 氨 酸 去 氧 胆 酸 盐 （ XLD

26、） 琼 脂 和HEKTONE氏 肠 道 菌 （ HE） 琼 脂 平 板 上 ， 于 35培 养 24h后 ， 根 据 沙 门 氏 菌 在 不 同 选 择 性 琼 脂 平 板上 的 菌 落 特 征 挑 取 典 型 或 可 疑 菌 落 。 （ 2） 沙 门 氏 菌 的 筛 选 和 生 化 、 血 清 学 鉴 定 筛 选 用 灭 菌 接 种 针 挑 取 每 个 典 型 或 可 疑 菌 落 的 中 心 部 位 ，分 别 接 种 三 糖 铁 （ TSI） 、 赖 氨 酸 铁 琼 脂 斜 面 ， 于 35 培养 24h。 在 TSI琼 脂 中 ， 典 型 的 沙 门 氏 菌 培 养 物 可 使 斜 面 呈

27、 碱 色（ 红 色 ） ， 底 层 呈 酸 色 （ 黄 色 ） ， 产 生 H2S（ 琼 脂 变 为 黑色 ） 或 不 产 生 H2S。 生 化 学 、 血 清 学 鉴 定 混 杂 培 养 物 对 呈 混 杂 的 TSI琼 脂 培 养 物 ， 皆 应 划 线 于 MC、HE或 XLD琼 脂 上 ， 于 35 培 养 24h后 ， 进 行 重 新 分 离 并至 少 挑 取 2个 可 疑 菌 落 接 种 到 斜 面 上 进 行 鉴 定 。 纯 培 养 物 将 每 个 可 疑 阳 性 的 TSI琼 脂 斜 面 培 养 物 ，分 别 接 种 于 尿 素 肉 汤 中 ， 35 培 养 24h， 获 取

28、多 量 的琼 脂 斜 面 培 养 物 接 种 于 快 速 尿 素 肉 汤 中 ， 于 37 水浴 培 养 2h。 弃 去 所 有 呈 阳 性 结 果 的 培 养 物 ， 保 留 所有 呈 阴 性 反 应 的 培 养 物 作 进 一 步 鉴 定 。 血 清 学 多 价 鞭 毛 （ H） 试 验 血 清 学 多 价 菌 体 （ O） 试 验 菌 体 （ O） 群 试 验 鞭 毛 （ H） 试 验 阴 性 培 养 物 的 诱 导（ 3） 结 果 判 定 8.3 弯 曲 菌 弯 曲 菌 是 一 组 人 畜 共 患 的 病 原 微 生 物 ， 能 引 起 人的 腹 泻 和 食 物 中 毒 ， 在 国 外

29、 已 被 广 泛 的 重 视 ， 同时 也 被 公 认 为 新 发 现 的 病 原 菌 之 一 。 弯 曲 菌 是 革 兰 氏 阴 性 菌 ， 呈 弧 形 和 S型 。 弯 曲 菌 以 病 原 菌 和 共 生 菌 广 泛 存 在 于 动 物 中 ， 家禽 家 畜 是 主 要 的 贮 存 宿 主 和 传 染 源 ， 在 传 染 或 带菌 动 物 的 肠 道 和 生 殖 道 内 容 物 中 含 有 大 量 的 弯 曲菌 。 食 用 被 污 染 的 食 物 、 水 ， 尤 其 是 鸡 、 鸭 、 蛋 ，未 消 毒 或 消 毒 不 完 全 的 牛 奶 ， 均 可 致 病 。 检 验 方 法（ 1） 常

30、 规 方 法 （ 2） 现 代 检 验 技 术 基 因 探 针 法 核 酸 杂 交 试 验 是 以 互 补 核 酸 链 能 够 特 异 性 结 合 并形 成 稳 定 的 双 链 复 合 物 为 基 础 。 基 因 探 针 系 统采 用 的 是 发 光 剂 标 记 的 单 链 DNA探 针 ， 该 探 针与 核 糖 体 RNA结 合 形 成 稳 定 的 DNA:RNA杂 交 体 。选 择 试 剂 将 未 杂 交 和 杂 交 探 针 分 开 。 标 记 的DNA:RNA杂 交 作 用 GEN-PROBE发 光 仪 检 测 。发 光 仪 读 数 大 于 或 等 于 CUT-OFF值 的 为 阳 性

31、，低 于 CUT-OFF值 的 为 阴 性 。 PCR法 根 据 弯 曲 菌 属 16sRNA高 保 守 序 列 设 计 一 对 引 物 ；在 合 适 的 反 应 条 件 和 反 应 体 系 下 进 行 反 应 ； 最 后 利用 电 泳 观 察 结 果 。 荧 光 酶 标 试 剂 盒 检 测 弯 曲 杆 菌 的 探 针 是 用 非 放 射 性 物 质 标 记 的 。 标记 物 为 发 光 素 。 靶 顺 序 为 rRNA。 近 年 来 用 碱 性 磷酸 酶 人 工 合 成 的 寡 核 苷 酸 检 测 人 工 污 染 的 粪 便 样 品 ，检 测 量 为 一 百 万 个 菌 落 形 成 单 位

32、（ CFU)， 敏 感 性 和特 异 性 达 100 。 此 方 法 只 在 临 床 检 测 中 应 用 ， 尚 未 用 于 食 品 检 测 。 8.4 金 黄 色 葡 萄 球 菌 葡 萄 球 菌 是 一 类 革 兰 氏 阳 性 菌 。 它 的 致 病 力 的强 弱 与 其 产 生 的 毒 素 及 酶 类 有 关 。 人 一 旦 感 染该 菌 ， 当 机 体 抵 抗 力 减 弱 或 皮 肤 受 损 时 ， 易 被感 染 ， 引 起 伤 口 化 脓 、 中 耳 炎 、 毛 囊 炎 等 。 产生 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 的 还 可 引 起 食 物 中 毒 。 对 人 有 致 病 性 的 葡 萄

33、 球 菌 多 产 生 -溶 血 素 ；对 动 物 有 致 病 性 的 葡 萄 球 菌 多 产 生 -溶 血 毒 素 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 某 些 菌 株 能 产 生 一 种 能 引 起 急性 肠 胃 炎 的 肠 毒 素 ， 当 这 些 菌 株 污 染 了 食 物 ，在 温 度 条 件 适 宜 时 ， 即 可 产 生 相 当 数 量 的 肠 毒素 ， 根 据 肠 毒 素 的 血 清 型 别 不 同 ， 分 为 A、 B、C、 D、 E五 型 。 其 中 以 A型 引 起 的 食 物 中 毒 最多 ， B和 C型 次 之 。 肠 毒 素 是 一 种 可 溶 性 蛋 白 质纯 化 的 肠

34、毒 素 ， 能 耐 高 温 。 血 浆 凝 固 酶 是 鉴 别 葡 萄 球 菌 有 无 致 病 性的 重 要 指 标 。 血 浆 凝 固 酶 具 有 抗 原 性 ，可 分 为 8型 。 大 多 数 致 病 性 葡 萄 球 菌 能 产生 此 酶 ， 而 非 致 病 菌 不 产 生 。 可 应 用 8个型 的 凝 固 酶 抗 血 清 进 行 分 型 试 验 ， 用 来研 究 葡 萄 球 菌 的 流 行 病 学 情 况 。 检 验 方 法（ 1） 常 规 检 验 方 法 （ 2） 现 代 检 验 技 术 利 用 mini Vidas全 自 动 免 疫 分 析 仪 ， 它 是 应 用酶 联 免 疫 技

35、 术 ， 用 荧 光 分 析 技 术 通 过 固 相 吸 附 器 ，用 已 知 抗 体 来 捕 捉 目 标 生 物 体 ， 然 后 以 带 荧 光 的酶 联 抗 体 再 次 结 合 ， 经 充 分 冲 洗 ， 通 过 激 发 光 源检 测 ， 即 能 自 动 读 出 发 光 的 阳 性 标 本 ， 其 优 点 是检 测 灵 敏 度 高 、 速 度 快 ， 可 在 48h的 时 间 内 快 速 筛选 鉴 定 出 金 黄 色 葡 萄 球 菌 及 金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒素 。 美 国 3M公 司 ， 利 用 耐 热 核 酸 酶 特 性 ， 设 计 出 纸片 法 ， 能 在 24h快 速

36、检 测 出 金 黄 色 葡 萄 球 菌 。 大 多 数 检 测 葡 萄 球 菌 的 探 针 是 针 对 肠 毒 素 的 。 它们 能 同 编 码 肠 毒 素 有 关 的 基 因 序 列 杂 交 ， 这 类 探针 能 检 测 肠 毒 素 A、 B、 C和 E。 PCR法 ： 设 计 特 异 性 引 物 根 据 产 生 肠 毒 素 A-E基因 （ entA, entB, entC, entD和 entE),检 测 葡 萄 球 菌exfoliative基 因 ， 检 测 中 毒 休 克 毒 素 基 因 (tst)。 8.5 肉 毒 梭 菌 肉 毒 梭 菌 是 严 重 食 物 中 毒 的 病 原 菌

37、之 一 ，在 厌 氧 的 环 境 下 能 产 生 强 烈 的 外 毒 素 。 这种 毒 素 毒 性 强 烈 ， 是 一 种 独 特 的 神 经 麻 痹毒 素 ， 即 肉 毒 毒 素 。 该 毒 素 性 质 稳 定 ， 是目 前 已 知 化 学 毒 物 和 生 物 毒 素 中 毒 性 最 强烈 者 ， 对 人 的 致 死 剂 量 为 0. 1ug。 肉 毒 梭 菌 在 自 然 界 的 分 布 具 有 某 种 区 域 性 差 异 ，显 示 出 生 态 上 的 差 异 倾 向 。 根 据 抗 原 特 异 性 ，可 分 为 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G七 个 型 别 。 肉 毒 梭 菌 一

38、年 四 季 均 可 发 生 ， 发 病 主 要 与 饮 食习 惯 有 密 切 的 关 系 。 欧 美 国 家 ： 肉 类 食 品 、 罐 头 食 品 ； 日 本 等 沿 海 国 家 ： 进 食 水 产 品 ； 我 国 内 地 ： 进 食 发 酵 食 品 （ 如 臭 豆 腐 、 豆 瓣 酱 、 豆 豉等 ） 。 检 验 方 法1） 常 规 肉 毒 梭菌 的 检 出GB/T 4789.12-20032） PCR法 报 告 （ 一 ） ： 检 样 含 某 型 肉 毒 毒 素报 告 （ 二 ） ： 检 样 含 某 型 肉 毒 梭 菌报 告 （ 三 ） ： 由 样 品 分 离 的 菌 株 为 某 型 肉

39、 毒 梭 菌 8.6 致 病 性 弧 菌 弧 菌 属 共 有 37个 种 （ 变 种 ） ， 其 中 已 明 确 又 12个 种 对 人类 有 致 病 作 用 。 在 这 12种 致 病 菌 种 ， 最 重 要 的 ， 也 是 问题 最 多 的 是 O1型 霍 乱 弧 菌 、 非 O1型 霍 乱 弧 菌 、 副 溶 血 性弧 菌 和 创 伤 弧 菌 。霍 乱 弧 菌 (Vibrionaceae cholerae) 霍 乱 弧 菌 是 由 O1血 清 群 和 O139血 清 群 引 起 的 烈 性 消 化 道传 染 病 。 该 病 传 播 快 , 波 及 面 广 ， 是 属 于 国 际 检 疫

40、的 传染 病 。 水 是 传 播 霍 乱 的 主 要 媒 介 。 与 霍 乱 有 关 的 食 品 主 要 是 海 产 品 、 有 壳 的 水 生 动 物 和 甲壳 动 物 ， 主 要 有 鱼 、 虾 、 贝 类 、 甲 鱼 、 牛 蛙 、 蟹 等 。 霍 乱 弧 菌 引 起 的 疾 病 叫 霍 乱 。 由 霍 乱 弧 菌 E1 Tor生 物 型 引 起 的 症 状 较 轻 ， 病程 也 短 。 霍 乱 弧 菌 肠 毒 素 会 引 起 机 体 严 重 的 呕 吐 、 腹 泻等 临 床 症 状 。霍 乱 弧 菌 的 检 测 方 法 生 物 学 检 测 方 法 ， 作 霍 乱 弧 菌 O1+O139

41、多 价 血清 凝 集 试 验 （ 水 、 食 品 ） 。 PCR（ 对 毒 力 基 因 ctxAB、 tcpA进 行 扩 增 ） 。 致 病 性 弧 菌 的 检 测 方 法1、 具 有 代 表 性 检 验 方 法 简 介（ 1） FDA的 细 菌 学 分 析 手 册 霍 乱 、 付 弧 、 创 伤 弧 菌 和 其 他 弧 菌 （ 1995 1998修 订 ） 分 别着 重 介 绍 了 霍 乱 弧 菌 、 副 溶 血 弧 菌 、 创 伤 弧 菌 的 方 法 。 用 PCR方 法 检 测 产 肠 毒 素 的 霍 乱 弧 菌 叙 述 了 霍 乱 肠 毒 素cholera Toxin (T)基 因（

42、2） AOAC官 方 分 析 方 法 牡 蛎 中 的 霍 乱 弧 菌 ： 升 温 富 集 法 （ 1995.a） 创 伤 弧 菌 的 脂 肪 酸 气 相 色 谱 鉴 定 法 AOAC.(1995.b） 美 国 midi公 司 生 产 的 shelock微 生 物 鉴 定 系 统 。 （ 3） ISO方 法 副 溶 血 弧 菌 的 检 测 方 法 （ ISO8914： 1990E）（ 4） NMKL 食 品 中 致 病 性 弧 菌 的 检 测 和 计 数 （ NMKL N0156） 介 绍 了霍 乱 弧 菌 、 副 溶 血 弧 菌 、 创 伤 弧 菌 、 溶 藻 弧 菌 的 检 测 程 序 。（

43、 5） 不 同 国 家 的 方 法 日 本 、 瑞 士 等 国 均 有 相 应 检 验 方 法 。2、 致 病 性 弧 菌 的 检 测 方 法 以 上 介 绍 的 方 法 均 是 以 单 一 或 少 数 目 标 菌 （ NMKL为 四 种 ）为 目 的 的 设 计 的 程 序 。 鉴 于 国 外 对 出 口 食 品 中 多 种 致 病 性 弧菌 的 要 求 和 重 视 ， 有 必 要 探 讨 “ 同 一 程 序 同 时 检 测 多 种 弧 菌 ”方 法 。 检 验 程 序 25g样 品 +225mL APW(1% NaCl pH9.0) 增 菌 37 8-16h 取 10mL加 入 双 倍 A

44、PW 37 6-8h 选 择 选 择 培 养 基 TCBS（ 霍 利 斯 用 非 选 择 性 的 羊 血 球 琼 脂 ） 37 24h 定 弧 菌 取 黄 色 或 绿 色 菌 落 做 G染 色 、 氧 化 酶 、 动 力 O/129(150ug)、 D-甘 露 糖 分 组 初 步 鉴 定 ： 0% NaCl , 1% NaCl、 硝 酸 盐 还 原 、 精 氨 酸双 水 解 酶 、 赖 氨 酸 脱 羧 、 鸟 氨 酸 脱 羧 、 (氧 化 酶 ) 分 成 5组 确 证 最 后 鉴 定 8.7 病 毒8.7.1 诺 瓦 科 病 毒 （ Norwalk virus）l1972年 首 次 发 现 。

45、l诺 瓦 科 病 毒 是 直 径 27nm的 圆 形 结 构 的 病 毒 ，无 包 膜 ， 尚 不 能 在 实 验 室 培 养 。lNorwalk病 毒 是 最 重 要 的 引 起 腹 泻 的 肠 道 病 毒 。食 品 （ 包 括 水 ） 被 诺 瓦 科 病 毒 感 染 后 ， 出 现 以急 性 肠 胃 炎 为 主 的 临 床 症 状 。 目 前 ， 这 类 病 毒尚 无 特 效 治 疗 药 物 。 20世 纪 70年 代 在 澳 大 利 亚 爆 发 了 有 2000多 人 感 染 诺 瓦科 病 毒 。 另 一 起 病 例 原 因 是 运 垃 圾 船 将 垃 圾 倒 在 正 在捕 捞 贝 类

46、的 区 域 。 2006年 11月 ， 美 国 一 艘 名 为 “ 海 洋 自 由 ” 号 的 豪 华 邮轮 ， 遭 到 了 诺 瓦 克 病 毒 的 袭 击 ， 在 为 期 一 周 的 航 行 中 ，300多 名 乘 客 和 船 员 感 染 了 诺 瓦 克 病 毒 ， 受 感 染 的 人 数是 这 艘 船 搭 载 的 总 人 数 的 7%。 诺 瓦 科 病 毒 的 毒 力 较 强 ， 发 病 有 明 显 的 季 节 性 （ 秋 冬季 ） ， 一 般 不 造 成 爆 发 流 行 。 在 2006年 底 的 一 周 内 ， 日 本 各 地 小 儿 科 医 疗 机构 上 报 的 诺 瓦 克 病 毒

47、腹 泻 人 数 ， 达 到 了 6万 多人 ， 发 病 率 超 过 了 有 相 关 统 计 25年 来 的 历 年 最高 纪 录 。 根 据 推 算 ， 日 本 境 内 已 经 有 超 过 300万 人 感 染 诺 瓦 克 病 毒 。 自 2002年 以 来 ， 日 本 每 年 冬 季 都 会 爆 发 诺 瓦 克病 毒 ， 其 中 一 些 和 牡 蛎 (生 蚝 )和 生 海 鲜 有 关 。2006年 ， 日 本 媒 体 关 注 诺 瓦 克 病 毒 和 感 染 者 在疗 养 院 死 亡 的 情 况 。 2006年 到 2007年 ， 诺 瓦 克感 染 例 子 几 乎 是 之 前 的 3倍 。 检

48、 测 方 法（ 1） 免 疫 电 镜 法 （ IEM） NV被 发 现 后 很 长 一 段 时 间 内 ， 电 镜 一 直 是 检 测的 主 要 手 段 ， 具 有 直 接 、 可 靠 的 优 点 。 电 镜 观 察需 要 的 样 品 量 为 106 107个 病 毒 颗 粒 /mL排 泄 物 。这 个 技 术 仅 在 发 病 早 期 适 用 。 免 疫 电 镜 能 使 电 镜 的 灵 敏 度 提 高 10-100倍 。 在 显微 镜 下 包 被 康 复 病 人 的 血 清 。 血 清 抗 体 玉 同 源 病毒 相 结 合 ， 因 此 提 高 了 诊 断 效 率 。 但 IEM不 适 合大 规

49、 模 流 行 病 学 调 查 。 （ 2） 放 射 免 疫 和 生 物 素 亲 和 素 法 （ RIA法 ） 检 测 抗 原 与 IEM法 相 比 在 灵 敏 度 上 没 有 明 显 差 异 ， 但 用RIA法 能 检 测 出 急 性 期 和 恢 复 期 之 间 抗 体 升 高 4倍 以 上 ，对 流 行 病 学 调 查 更 有 意 义 。 实 验 需 6d， 同 时 还 需 要 放 射 性同 位 素 标 记 。（ 3） 酶 链 免 疫 法 （ ELISA) 此 法 特 异 性 强 ， 灵 敏 度 高 ， 诊 断 迅 速 ， 且 较 经 济 ， 是 目 前可 广 泛 应 用 的 检 测 方 法

50、 。 这 种 技 术 的 检 测 样 品 量 要 求 10410 6病 毒 颗 粒 /mL排 泄 物 。 （ 4） 杂 交 技 术 和 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 （ RT-PCR） RT-PCR方 法 是 检 测 病 人 排 泄 物 和 环 境 中 样 品 的 诺 瓦科 病 毒 基 因 的 特 异 手 段 。 这 个 方 法 的 灵 敏 度 为 102 104病 毒 颗 粒 /mL排 泄 物 。 高 敏 感 的 RT-PCR方 法 依 赖 于PCR引 物 的 设 计 。 依 赖 RNA的 RNA聚 合 酶 区 域 被 认 为是 诺 瓦 科 病 毒 基 因 组 的 最 保 守 的 区

51、域 。 尽 管 用 于 扩 增的 RdRp区 域 基 因 的 引 物 能 扩 增 大 多 数 的 诺 瓦 科 病 毒 ，但 由 于 诺 瓦 科 病 毒 遗 传 多 样 性 使 这 些 引 物 很 难 扩 增 所有 的 诺 瓦 科 病 毒 。 8.7.2 甲 肝 病 毒 （ HAV） 病 毒 性 肝 炎 是 当 前 危 害 人 类 健 康 的 疾 病 之 一 。 目 前 认 为 病 毒 性 肝 炎 病 原 体 至 少 有 五 种 ， 包 括甲 型 肝 炎 病 毒 （ HAV） 、 乙 型 肝 炎 病 毒（ HBV） 、 丙 型 肝 炎 病 毒 （ HCV） 、 丁 型 肝炎 病 毒 （ HDV）

52、 、 戌 型 肝 炎 病 毒 （ HEV） ，它 们 的 特 性 、 传 播 途 径 、 临 床 经 过 均 不 完 全 相同 ， 但 它 们 均 能 引 起 肝 炎 病 变 。 项 目 甲 型 肝 炎 乙 型 肝 炎 丙 型 肝 炎 丁 型 肝 炎 戌 型 肝 炎病 毒 HAV HBV HCV HDV HEV病 毒 分 类 微 小 核 糖 核酸 病 毒 嗜 肝 脱 氧 核 糖 核酸 病 毒 黄 病 毒 （ 缺 陷 病 毒 ） 杯 状 病 毒病 毒 大 小 27nm 42nm 30 60nm 40nm 27 34nm 基 因 ss RNA（ +）7.8kb dsDNA3,2kb ssRNA(+

53、)10.5kb ssRNA(-)1.7kb ssRNA(+)3.5kb 抗 原 HAVAg（ VP1 4） HBsAgHBcAgHBeAg HCVAg HDVAg HEVAg 传 播 途 径 肠 道 传 播 肠 道 外 及 性 传 播 多 数 肠 道 外传 播 多 数 和 肠 道外 传 播 肠 道 传 播潜 伏 期 （ 范围 ） 25天 （ 1545天 ） 75天 （ 40 120天 ） 50天 （ 1590天 ） 50天 （ 2575天 ） 40天 （ 2030天 ）慢 性 化 无 3 10% 40 70% 2 70% 无 暴 发 性 肝 炎 0.2% 0.2% 0.2% 2 20% 0.2

54、 10% 1973年 Feinslone 首 先 用 免 疫 电 镜 技 术 在 急 性 期 患者 的 粪 便 中 发 现 甲 型 肝 炎 病 毒 (Hepatitis A virus,HAV ) 。 属 微 小 RNA病 毒 科 ， 新 型 肠 道 病 毒72型 。 人 类 感 染 HAV后 ， 大 多 表 现 为 亚 临 床 或 隐 性感 染 ， 仅 少 数 人 表 现 为 急 性 甲 型 肝 炎 。 一 般 可 完 全恢 复 ， 不 转 为 慢 性 肝 炎 ， 亦 无 慢 性 携 带 者 。 HAV 甲 型 肝 炎 病 毒 主 要 的 传 染 病 源 是 甲 肝 病 人 。 可通 过 污

55、 染 水 源 、 食 物 、 食 具 和 手 等 方 式 进 行 传播 ， 特 别 是 经 水 和 食 物 ， 可 引 起 爆 发 性 流 行 。另 外 ， 通 过 血 液 也 可 传 播 。 病 人 的 潜 伏 期 为 一 个 月 ， 在 潜 伏 后 期 和 急 性 期 ，患 者 的 粪 便 和 血 液 均 具 有 传 染 性 。 检 验 方 法（ 1） 免 疫 电 镜 敏 感 性 高 ， 标 本 中 含 有 104106颗 粒 /mL可 被 检 出 。 将 标 本 加 入 特 异 性 抗 体 HAV血 清 ， 经 孵 育 后 ， HAV颗 粒 与抗 血 清 发 生 凝 集 ， 再 用 超

56、速 离 心 加 以 浓 缩 ， 取 其 免 疫 复 合物 ， 用 磷 钨 酸 盐 进 行 染 色 ， 于 电 镜 下 检 查 HAV球 形 颗 粒 。（ 2） 固 相 放 射 免 疫 测 定 法 将 放 射 性 同 位 素 与 免 疫 化 学 相 结 合 的 体 外 测 定 超 微 量 物 质的 实 验 方 法 ， 具 有 同 位 素 技 术 的 高 灵 敏 性 、 准 确 性 的 优 点 ，同 时 又 兼 有 抗 原 抗 体 反 应 的 专 一 性 。 另 外 ， 检 查 方 法 还 有 补 体 结 合 试 验 、 酶 联 免 疫吸 附 和 免 疫 黏 附 血 凝 试 验 等 方 法 。 通

57、 过 利 用 葡萄 糖 球 菌 A蛋 白 可 吸 附 IgG的 方 法 ， 在 单 份 血清 中 可 区 别 甲 肝 抗 体 为 IgM和 IgG， 根 据 急 性期 病 人 血 清 抗 体 为 IgM， 而 恢 复 期 病 人 的 血 清抗 体 为 主 要 是 IgG， 可 对 甲 肝 急 性 期 病 人 进 行早 期 诊 断 。 8.7.3 疯 牛 病 朊 病 毒p疯 牛 病 (“mad cow” disease) 学 名 为 “ 牛 海 绵 状脑 病 ” (Bovine Spongiform Encephalopath - BSE) ， 是 一 种 发 生 在 牛 身 上 的 进 行 性

58、 中 枢 神 经系 统 病 变 ， 症 状 与 羊 瘙 痒 症 类 似 ， 俗 称 “ 疯 牛病 ” 。 病 牛 脑 组 织 呈 海 绵 状 病 变 ， 并 出 现 步 态不 稳 、 平 衡 失 调 、 搔 痒 、 烦 燥 不 安 等 症 状 ， 通常 在 14至 90天 内 死 亡 。 由 于 种 类 的 不 同 ， 疯 牛病 的 潜 伏 期 长 短 不 同 ， 一 般 在 2到 30年 之 间 。 n 20世 纪 80年 代 中 期 至 90年 代 中 期 是 疯 牛 病 暴 发 流 行 期 ，主 要 的 发 病 国 家 如 英 国 及 其 他 欧 洲 国 家 有 大 量 的 牛 患 病并

59、 被 宰 杀 ， 发 生 疯 牛 病 国 家 的 牛 肉 及 牛 肉 制 品 的 出 口 受到 了 严 格 的 限 制 。n 尽 管 欧 洲 各 国 纷 纷 采 取 预 防 措 施 ， 但 是 到 了 1989年 ， 疯牛 病 还 是 攻 破 了 英 国 的 近 邻 爱 尔 兰 的 大 门 。 瑞 士 和 法 国1990年 也 各 自 发 现 了 第 一 例 疯 牛 病 。 到 1997年 11月 ， 葡萄 牙 、 丹 麦 、 德 国 、 荷 兰 、 比 利 时 也 相 继 出 现 疯 牛 病 。1998年 疯 牛 病 又 跨 出 了 欧 洲 ， 来 到 南 美 洲 的 厄 瓜 多 尔 。20

60、00年 后 ， 西 班 牙 、 瑞 典 、 捷 克 、 希 腊 、 斯 洛 伐 克 、 芬兰 、 奥 地 利 先 后 “ 陷 落 ” 。 值 得 注 意 的 是 远 隔 千 山 万 水的 日 本 ， 在 2001年 也 报 告 了 亚 洲 首 例 疯 牛 病 。 2002年 ，以 色 列 和 波 兰 相 继 出 现 了 国 内 首 例 疯 牛 病 。 2003年 5月 ， 加 拿 大 发 现 一 例 疯 牛 病 ， 这 是 近 10年 来 北美 大 陆 发 现 的 首 例 疯 牛 病 。 2003年 12月 ， 美 国 发 现 首例 疯 牛 病 。 不 到 20年 工 夫 ， 疯 牛 病 就

61、已 扩 散 到 了 欧 洲 、美 洲 和 亚 洲 的 几 十 个 国 家 。 英 国 是 发 生 疯 牛 病 最 多 的国 家 ， 1999年 统 计 占 总 发 病 数 的 99 。 到 2000年 7月 ，在 英 国 有 超 过 34000个 牧 场 的 17.6万 多 头 牛 感 染 了 此 病 ，最 高 发 病 时 间 是 在 1993年 1月 ， 每 月 至 少 有 1000头 牛发 病 。 截 至 到 2002年 ， 英 国 共 屠 宰 病 牛 1100多 万 头 ，经 济 损 失 达 数 百 亿 英 镑 。截 至 2003年 12月 底 ， 中 国 尚 未 发 现 疯 牛 病 。

62、 受 疯 牛 病 危 害 的 不 仅 是 牛 ， 人 若 食 用 了 被 污 染了 的 牛 肉 、 牛 脊 髓 等 ， 也 有 可 能 染 上 致 命 的 新型 克 雅 氏 症 。 患 者 脑 部 会 出 现 海 绵 状 空 洞 ，先 是 表 现 为 焦 躁 不 安 ， 后 导 致 记 忆 丧 失 ， 身 体功 能 失 调 ， 最 终 精 神 错 乱 甚 至 死 亡 。 新 型 克 雅 氏 症 患 者 以 年 轻 人 为 主 ， 发 病 时 间 平 均 为 14个 月 。 截 至 2003年 底 累 计 已 有 至 少 137人 死 于新 型 克 雅 氏 症 ， 其 中 多 数 在 英 国 。

63、 疯 牛 病 是 1985年 4月 最 早 在 英 国 出 现 的 一 种 新 病 。 1996年 确 诊 ， 1997年 Weels等 正 式 报 道 ， 疯 牛 病 的 致 病 因 子是 朊 蛋 白 （ Prion） 。 朊 蛋 白 是 一 种 以 糖 蛋 白 为 主 体 的 特 殊 病 原 因 子 ， 其 分 子量 很 小 。 它 是 一 种 传 染 性 蛋 白 因 子 ， 主 要 成 分 是 一 种 蛋白 酶 抗 性 蛋 白 （ PrP） 。生 物 学 特 性 ： 可 滤 过 性 ， 增 殖 非 常 缓 慢 ； 与 已 知 病 毒 特 征 明 显 不 同 ， 不 具 有 病 毒 结 构

64、 ， 未 检 出 核酸 ； 对 福 尔 马 林 、 蛋 白 酶 、 加 热 、 电 离 辐 射 、 紫 外 线 抵 抗 力强 ； 分 子 量 2700030000D， 由 220257个 氨 基酸 组 成 ， 形 成 螺 旋 折 叠 ， 在 油 镜 下 ， 呈纤 维 状 2股 或 4股 缠 在 一 起 的 蛋 白 丝 ， 即prp蛋 白 。 沉 降 系 数 40200S， 不 含 DNA或 RNA。 羊 瘙 痒 病 PrPC与 PrPSC的 三 维 结 构 折 叠PrPC（ 正 常 ） PrPSC（ 致 病 ） 疯 牛 病 的 检 测 根 据 临 床 症 状 和 流 行 病 学 资 料 可 建

65、 立 初 步 诊 断 ，确 诊 必 须 采 用 脑 组 织 病 理 学 检 查 、 PrPSC检 测（ 细 胞 免 疫 化 学 检 查 、 免 疫 印 迹 、 组 织 印 迹 、ELISA等 ） 及 PrP基 因 分 析 。 1998年 爱 尔 兰 报 道 了 一 种 BSE免 疫 学 检 测 ， 2h可 报 告 结 果 ， 1d可 检 测 1.4万 头 牛 。 1999年 7月 Moynagh等 报 道 了 三 种 理 想 的 方 法 ：1、 单 抗 检 测 PrPSC的 免 疫 印 迹 法 （ Prionics)2、 多 克 隆 抗 体 检 测 PrPSC的 化 学 发 光 ELISA（

66、Enfer)法3、 在 变 性 和 浓 缩 后 用 两 种 单 抗 检 测 PrPSC的 夹心 免 疫 法 （ CEA） 8.7.4 禽 流 感 病 毒 禽 流 感 是 禽 流 行 性 感 冒 的 简 称 ， 它 是 一 种 由 甲型 流 感 病 毒 的 一 种 亚 型 （ 也 称 禽 流 感 病 毒 ） 引起 的 传 染 性 疾 病 ， 被 国 际 兽 疫 局 定 为 甲 类 传 染病 ， 又 称 真 性 鸡 瘟 或 欧 洲 鸡 瘟 。 按 病 原 体 类 型的 不 同 ， 禽 流 感 可 分 为 高 致 病 性 、 低 致 病 性 和非 致 病 性 禽 流 感 三 大 类 。 非 致 病 性 禽 流 感 不 会 引 起 明 显 症 状 ， 仅 使 染 病的 禽 鸟 体 内 产 生 病 毒 抗 体 。 低 致 病 性 禽 流 感 可使 禽 类 出 现 轻 度 呼 吸 道 症 状 ， 食 量 减 少 ， 产 蛋量 下 降 ， 出 现 零 星 死 亡 。 高 致 病 性 禽 流 感 最 为严 重 ， 发 病 率 和 死 亡 率 均 高 ， 感 染 的 鸡 群 常 常“ 全 军 覆 没 ”