《电生理研究方法》PPT课件.ppt

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1、 第二章 心肌电生理学研究方法 Methodology of Myocardium Electrophysiological Research 电生理学技术的发展 1825年 电流计发明与应用 1922年 电子管放大器和阴极射线示波器问世 20世纪 40年代 微电极技术产生 动作电位的 钠学说 20世纪 50年代 电压钳技术产生 20世纪 70年代 膜片钳技术 谢灵顿 ( Sherrington) （ 1857-1952） 英国神经生物学家。 发现中枢神经反射活动规律 艾德里安 (Adrian ) （ 1889-1977） 英国生理学家。 阐明动作电位及其传导规律 1932年获诺贝尔奖 厄兰格

2、 (Erlanger) （ 1874-1965） （美） 两人合作发明了阴极示波器，并研究了神经纤维的功能 加塞 (Gasser ) （ 1888-1963） （美） 1944年获诺贝尔奖 Bernstein膜学说 1902年， Bernstein提出生物电发生的膜学说： “神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透 性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性， 因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧 就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到 来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失， 动作电位因而产生。” 离子学说（动作电位的钠学说） 1940年前后，由于 Hodgkin和 Huxley在

3、枪 乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电 位的事实， Bernstein膜学说受到了有力 的打击。以后的研究证实， Bernstein膜 学说对于离子通透性的假设是不正确的。 其被后来的 离子学说（钠学说） 所代替。 Eccles 1976年德国马普生物物理化学研究所 Neher和 Sakmann首次 在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时 ， 记录到乙酰胆碱 （ Acetylcholine, ACh） 激活的单通道离子电流 ， 从而产生了 膜片钳技术 （ patch clamp technique） ； 1980年 Sigworth等获得 10-100G的高阻封接 （ Gigaseal） ，

4、1981年 Hamill和 Neher等对该技术进行了改进 ， 引进了全细胞 记录技术 ， 从而使该技术更趋完善； 1983年 10月 ， Single-Channel Recording 一书的问世 ， 奠 定了膜片钳技术的里程碑 。 Neher Sakmann （ 1944-） （ 1942-） （德国细胞生理学家） （德国细胞生理学家） 合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存 在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可 揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的 发病机理，并提供治疗的新途径。 二人共获 1991年诺贝尔奖。 内尔在实验室进行膜片箝

5、研究工作 1983年 10月第一版 Single-Channel Recording 封面 电生理获医学诺贝尔奖名单（截止到 2002年） 获奖时 间 获奖者 国别 获奖工作 获奖题目或著作 1924 埃因托芬 ( Einth oven) (1860 - 1927 ) 荷兰 研制成功记录心脏动作电位的 心电图机并命名心电图波。 “弦线式电流计和心脏动作电位的测量” 1932 艾德里安 ( Adria n) (1889 - 1977 ) 谢灵顿 (Sh errin gton) (1857 - 1952) 英国 英国 发现神经元的功能 “神经纤维的活动” 神经系统的整合作用 1944 加塞 ( G

6、asse r) (1888 - 1963) 厄兰格 (Er lange r) ( 1874 - 1965) 美国 美国 两人合作发明了示波器，并研 究神经纤维的功能 神经活动的电表现 1963 埃克尔斯 ( Eccle s ) （ 1903 - 1997 ） 霍奇金 (Ho dgkin ) （ 19 14 - 199 8 ） 赫克斯利 ( Huxle y ) （ 19 17 - ） 澳大利亚 英国 英国 用 1 微米尖端的微电极研究中 枢兴奋和抑制 两人合作揭示了神经元通过电 脉冲与其它神经元传递信息 “突触后抑制的离子机制” “神经传导的离子基础” “神经兴奋和传导的定量分析” 1967 哈

7、特兰 (Ha rtlin e) ( 1 90 2 - 1983 ) 格兰尼特 ( Grani t) (1900 - 1991 ) 美 瑞典 视觉神经生理（视觉神经元间 的抑制） 视觉神经生理（视网膜电图） “受体与感知” 1970 卡茨 ( Katz ) (1911 - ) 英国 提出神经递质释放的量子学说 “神经末梢的化学传递” 1981 休伯尔 (Hu bel) (1926 - ) 威塞尔 (Wi esel ) (1924 - ) 美国 瑞典 两人合作对视觉皮层的结构和 功能进行了重要研究 “视觉皮层的研究” “视皮层的发育和环境的影响” 1991 内尔 ( Neher ) (1944 -

8、 ) 萨克曼 (Sa kmann ) (1942 - ) 德国 德国 发明膜片箝技术，首次证实细 胞膜上存在离子通道 单通道记录 第一节 常规心肌电生理研究技术 在常规心肌电生理研究中 ， 主要是采用 玻璃微电极 插入在体或离体心肌细胞内 ， 记 录心肌细胞的跨膜电活动 ， 并研究各种因素 对其电活动的影响 。 一、常用电生理仪器 刺激系统（刺激器等） 检测系统（电极、换能器） 放大系统（前置、后置放大器） 记录显示系统 (示波器、记录仪、 计算机） 1.电子刺激器 （ Electronic stimulator） 电刺激不易损伤组织 ， 又能定量而准确 地重复使用 。 方波 （ 矩形波 ，

9、square wave） 的幅度 、 波宽和频率都可分别进行调节 ， 所 以矩形波电子刺激器可作为理想的刺激源 。 SEN-7203 方波刺激脉冲的参数要求： （ 1） 幅度 （强度， amplitude） 矩形脉冲电压的最大瞬时值 （ 2） 波宽 （刺激持续时间 time） （ 3） 频率 （ frequency） 一个脉冲循环所需的时间为 周期 ，周 期 的倒数（即 1S内所含的周期数目） 称为 频率 （ 4） 延迟 （ Delay） 从触发脉冲到刺激方波的出现，这 一段时间称为 延迟 。 （ 5） 刺激方式 （ Pattern of stimulation） 单刺激、连续刺激、双脉冲刺激

10、 （ 6） 同步输出 （ Synchronized output） 同步脉冲表示一次刺激的时间起点 （ 7） 刺激隔离器 （ Isolator） 当对实验动物同时进行刺激和记录生物电时， 刺激器输出和放大器输入具有公共接地线，使得 一部分刺激电流流入放大器的输入端，使记录器 记录到一个刺激电流产生的波形，即 刺激伪迹 。 隔离器切断了刺激电流从公共地线返回的可能， 减小伪迹并与电位分开。同时，消除 50周交流电 感应造成的干扰。 2.微电极放大器 （ microelectrode amplifier） 组成：精密稳压电源 、 高输入阻抗探 头 、 主放大器 、 电容补偿电路 、 校正电 路 、

11、 低通滤波电路等 Axopatch 200B （ AXON， USA） 要求： （ 1）足够高的放大能力 （ 2）频率响应范围大 0 100Hz （ 3） 低噪声 50uV （ 4） 高的辨差比（共模抑制比） 1000:1 （ 5） 高输入阻抗 1000M （ 6）低频与高频滤波 低频滤波 -用于变化速度快的生物电变化 高频滤波 -用于减少噪声，提高信噪比 3 示波器（ oscillograph） 要求： 高灵敏度 扫描速度快 频率高 类型： 双线示波器 多线示波器 长余辉慢扫描示波器 记忆示波器 VC-11 4 贮存和分析电生理实验结果的仪器 （ 1） 示波照相机 （ 2） 磁带记录仪 （

12、3） 电子计算机 A/D转换 - -把生物电（模拟 ）信号转换成 数字信号 D/A转换 - 把数字信号转换成模拟信号 二 细胞外记录（ Extracellular recording） 细胞外记录是把电极安放在心肌表面或 附近引导心肌组织或细胞的电活动。 适应范围： （ 1）长时间的实验； （ 2）对清醒的、能自由活动的动物研究； （ 3）从不同组织部位作同时的多导记录； （ 4）研究非常小的细胞，数量多而难于 孤立起来，接触和穿刺都易于损伤等； （ 5）研究器官的总的活动。 电极： （ 1） 玻璃微电极 （ 2）金属电极 （ 3）离子选择性电极 （ 4）单极电极 （ 5）多管电极 三 在体心

13、脏电活动的细胞内记录 （ intracellular recording in situ） 1 实验装置 包括浮置式玻璃微电极、 微电极推进器、微电极放大器、示波 器、照相装置、记录仪、计算机等 推进器 微放器 示波器 监听器 照相机 记录仪 计算机 打印机 微电极 心脏 2 动物手术 3 电极制作要求 4 插入 5 应用范围 生理、药理、心肌缺血等 6 优点 ：在近于生理状态下实验，可观察整 体因素对心肌电活动的影响，可研究药物及 其代谢产物的作用过程，更有利于阐明各种 调节因素、致病因素或药物对心肌电生理特 性的影响机制 7 缺点 ：记录不持久，影响因素多 四 离体心肌电活动的细胞内记录

14、（ intracellular recording in vitro） 1 实验装置 2 微电极、标准微电极、微推进器 3 浴槽与灌流装置 生理盐溶液、混合气体、摄氏 30 37度 4 刺激器 5 应用范围 6 优点 稳定、长时间记录，可任意改变溶液成分 7 观察指标 RP , APA, APD10, APD50, APD90, Vmax 第二节：电压钳制技术 (Voltage clamp technique) 利用微电极技术 ， 虽然记录到细胞内的电 变化过程 ， 但不能阐明这种变化的原因 。 要阐 明跨膜电变化机制 ， 必需应用电压钳制技术 。 这一技术首先是由 Cole及其同事设计 ，

15、在经 Hodgkin等人加以改进 ， 用于神经电生理研究 ， 弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况 。 一 、 细胞膜的生物物理特性 (Biophysical properties of cell membrane) 细胞膜主要由脂质和蛋白质构成。以脂质 双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质颗 粒。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化 状态及其形成过程中等都是细胞膜 电缆性质 (cable properties)的反映。 (轴浆电阻与膜 电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响 起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用 神经的 “ 电缆 ” 性质 )。细胞膜的电缆特 性从定的等效电路及其时间常数

16、和空间常数及 例证实。 (一 ) 细胞膜的等效电路 从电学特点上分析 ， 细胞膜可等效地模拟为 电阻电容器 。 它具备 细胞浆电阻 （ 纵向电阻 ， ri） ， 膜电阻 （ 横向电阻 ， rm） ， 膜电容 （ Cm） 和 膜电位 （ Em） 四方面的电学特性 ， 根据这四 方面特性即可构成其等效电路 （ Equivalent Circuit） 。 outside inside 膜电位等效电路的简化图 Cm 膜电容 Rm 膜电阻 Em 离子平衡电位 Ro 细胞外液的纵向电阻（ /cm） Ri 轴浆的纵向电阻（ /cm） Ro Cm Rm Em + - 细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 路 ，

17、膜活动时既有电压的改变 ， 同时又有 电流的改变 。 电位的改变可引起电容器的 充 、 放电 ， 也可用于电阻器上的电流流动 。 通过电容器的电流为 Ic ， 通过电阻的电 流为 Ir。 1 纵向电阻（ Ro、 Ri） 由胞浆的性质所决定 ， 具有较高的电阻率 ， 它与直径是反比关系 （ 直径大 、 电阻小 ， 直 径小 ， 电阻大 ） 。 由于它的存在 ， 使生物电 的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行 。 它是单位长度的电阻 ， 单位是 /cm ， 细胞 外间质的容积很大 ， 其单位长度电阻 （ Ro） 较 Ri小 。 2.横向电阻 （ redial resistance） 即 细胞膜本

18、身具有的膜电阻 。 细胞膜 由双层硷脂构成 ， 厚度很薄 ， 但具有很高 的电阻 ， 即绝缘性 。 膜电阻表示离子通过 膜的有限能力 。 膜电阻反映了离子是否 容易通透膜的情况 。 膜电阻 （ Rm） 的大 小反映了膜结构电学方面的差异 。 3.膜电容 （ capacity） 表示膜的绝缘及储存电荷的性质 。 任何一 种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排 在一起 ， 称为电容器 。 细胞外液及细胞内液均 为含电解质的溶液 ， 可看作为两个导体；细胞 膜是含脂质的膜 ， 可视作为绝缘体 。 细胞外液 -细胞膜 -细胞内液三者组成了电容 。 4 膜电位 （ membrane potential

19、） 当膜上离子通道开放而引起带电离子跨 膜流动时，就相当于在电容器上充电或放 电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的 高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高 低与膜两侧的电荷成正比。 5 膜电流（ membrane current） 任何电流都是 电容电流（ Ic） 和 电阻电流（ Ii） 两种形式通过细胞膜，前 者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离 子携带流经细胞膜的。 I m = Ic + Ii (二 ) 细胞膜的时间常数 （ time constant） 时间常数是指膜电压随时间而改变的过程， 用一常数表示之。它反映 膜电位在细胞膜上随 时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通 过膜电阻和膜

20、电容充电到 63%或放电到 37 %所 需的时间。 = Rm Cm = 膜的时间常数 (ms） ;Rm=膜电阻（ k ） Cm=膜电容（ F ） (三 ) 细胞膜的空间常数（ space constant） 所谓空间常数，是度量电压的空 间衰减，即标志电压依距离而衰减的 程度的一个常数。 第二节 电压钳制技术 Voltage clamp technique 利用微电极技术 ， 虽然记录到细胞内的电 变化过程 ， 但不能阐明这种变化的原因 。 要阐 明跨膜电变化机制 ， 必须应用电压钳制技术 。 这一技术首先是由 Cole及其同事设计 ， 在经 Hodgkin等人加以改进 ， 用于神经电生理研究

21、 ， 弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况 。 一 、 细胞膜的生物物理特性 (Biophysical properties of cell membrane) 细胞膜上以脂质双分子层为支架 ， 镶嵌着不同 特性的蛋白质颗粒 。 细胞膜的电紧张及其扩布规律 ， 膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜 电缆性质 (cable properties)的反映 。 (轴浆电阻与膜电阻 、 膜电容的组合 ， 使电流对膜电位的影响起着依距离而 衰减以及在时间上的延缓作用 神经的 “ 电缆 ” 性 质 )。 细胞膜的电缆特性从定的等效电路及其时间常 数和空间常数及例证实 。 (一 ) 细胞膜的等效电路 从电学

22、特点上分析 ， 细胞膜可等效地模拟为 电阻电容器 。 它具备 细胞浆电阻 （ 纵向电阻 ， ri） ， 膜电阻 （ 横向电阻 ， rm） ， 膜电容 （ Cm） 和 膜电位 （ Em） 四方面的电学特性 ， 根据这四 方面特性即可构成其等效电路 （ Equivalent Circuit） 。 outside inside 膜电位等效电路的简化图 Cm 膜电容 Rm 膜电阻 Em 离子平衡电位 Ro 细胞外液的纵向电阻（ /cm ） Ri 轴浆的纵向电阻（ /cm ） Ro Cm Rm Em + - 离子通道等效于电导 细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 路 ， 膜活动时既有电压的改变 ， 同时又

23、有 电流的改变 。 电位的改变可引起电容器的 充 、 放电 ， 也可用于电阻器上的电流流动 。 通过电容器的电流为 Ic ， 通过电阻的电 流为 Ir。 1 纵向电阻 （ Ro、 Ri） 由胞浆的性质所决定 ， 具有较高的电阻率 ， 它与直径是反比关系 （ 直径大 、 电阻小 ， 直 径小 ， 电阻大 ） 。 由于它的存在 ， 使生物电 的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行 。 它是单位长度的电阻 ， 单位是 /cm ， 细胞 外间质的容积很大 ， 其单位长度电阻 （ Ro） 较 Ri小 。 2.横向电阻 （ redial resistance） 即 细胞膜本身具有的膜电阻 。 细胞膜 由双

24、层硷脂构成 ， 厚度很薄 ， 但具有很高 的电阻 ， 即绝缘性 。 膜电阻表示离子通过 膜的有限能力 。 膜电阻反映了离子是否 容易通透膜的情况 。 膜电阻 （ Rm） 的大小 反映了膜结构电学方面的差异 。 3.膜电容 （ capacity） 表示膜的绝缘及储存电荷的性质 。 任何一 种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排 在一起 ， 称为电容器 。 细胞外液及细胞内液均 为含电解质的溶液 ， 可看作为两个导体；细胞 膜是含脂质的膜 ， 可视作为绝缘体 。 细胞外液 -细胞膜 -细胞内液三者组成了电容 。 4 膜电位 （ membrane potential） 当膜上离子通道开放而引起带电

25、离子跨 膜流动时，就相当于在电容器上充电或放 电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的 高低决定于跨膜电化学梯度；膜电位的高 低与膜两侧的电荷成正比。 5 膜电流 （ membrane current） 任何电流都是电容电流（ Ic）和电阻 电流（ Ii）两种形式通过细胞膜， 前者导 致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携 带流经细胞膜的。 I m = Ic + Ii (二 ) 细胞膜的时间常数 （ time constant） 时间常数是指膜电压随时间而改变的过程， 用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随 时间而改变的（缓慢）程度。也就是 膜电位通 过膜电阻和膜电容充电到 63%或放电到 37

26、%所 需的时间。 = Rm Cm = 膜的时间常数 (ms） ;Rm=膜电阻（ k ） Cm=膜电容（ F ） (三 ) 细胞膜的空间常数 （ space constant） 所谓空间常数，是度量电压的空 间衰减，即标志电压依距离而衰减的 程度的一个常数。 (一 )、 定义 利用负反馈原理将膜电位在空间和 时间上固定于某一恒定的测定值，以研 究动作电位产生过程中的离子通透性与 膜电位之间的依从关系的技术。 二、电压钳制技术的方法原理 电压钳制术是利用负反馈电路 ， 在一定时 间内将跨膜电位 （ Transmembrane Potential， Vm） ， 保持在某个选定的电位水平 ， 此电位称

27、 为保持电位 （ Holding potential， Vh） ， 或 者使保持电位突然变到某个特定的幅值的方波 电位 ， 称为钳制电位 （ Clamping potential） 或指令电位 （ Command potential， Vc） 。 (二 )电压钳方法 电容器电流 Ic=d（ CmV） /dt 电阻器上电流 IR 流过膜的电流总量 I dv / dt = 0 所有的电流将都是流过 膜电阻的，这种电流将能反 映离子的流动。 电压钳技术的基本原理 电压源（ SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放 大器（ AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（ AFB）连 接，这一反馈电流通过膜，正好

28、抵消因加电压而引起的离 子电流，通过电流监视器测量电流。 （三）电压钳技术的优缺点 ： 很容易将膜电容电流与离子电流分开； 可将膜电流分成不同的成分一 INa、 IK、 Ica 等（在灌流液中加入或去除某种离子） 能精确反映由离子通道的开放和关闭 ， 引起 的膜电导的改变 ， 能把离子通透性变化的时间关 系加以描述 。 能分析离子通透性变化与膜电位的关系 ， 在 研究电压调节通道的行为方面有很大价值 。 1 优点 必须在细胞内插入两个电极 ， 对细胞 损伤很大； 对体积小的细胞 ， 实验难以实现； 对形态复杂的细胞 ， 很维保持细胞 膜各处电位一致； 只研究一个细胞上众多通道的综合活 动规律

29、， 无法反映单个通道活动的特点 。 2 缺点 : 蛙坐骨神经元单个 Ranvier结的电压钳记录 （四）几种电压钳方法 双微电极法 单蔗糖间隙（ Singe Sucrose Gap ）法 双蔗糖间隙（ Double Sucrose Gap）法 电极接触细胞 负压吸引形成 形膜囊泡 提起电极，囊泡与细胞脱离 A B C D 第三节 膜片钳制技术 膜片钳制技术（ patch clamp technique) 是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的 电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子 通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电 压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术 记到

30、的最小电流可达到 pA级 (10-12 A)。 一 基本原理 膜片钳的本质属于电压钳范畴 ， 其基本 工作原理是： 采用经典的负反馈放大技术作 电压固定 ， 但改用细胞外微吸管作电极 ， 将 微电极管尖端与细胞膜表面接触 ， 经负压抽 吸 ， 形成具极高阻抗的紧密封接 ， 其电阻值 高达 10-100千欧 （ 即 G= 109 ） 。 只有在这 种封接存在时 ， 通过膜电极引导记录的电流 才是通过该膜的离子通道电流 。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻 （ 输入阻抗 ） ， Rseal是 封接阻抗 。 Rs通常为 1 5M， 如果 Rseal高达 10G（ 1010）

31、以 上时 ， IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。 此 Ip可为在 I V转换器 （ 点线 ） 内的高阻抗负反馈电阻 (Rf)的电压降而被检测出 。 膜片钳与电压钳的区别 膜电位钳制的方法不同； 电位固定的细胞面积不同； 研究的离子通道数目不同； (1) 测量部分： (2) 串联电阻补偿部分： (3) 电容补偿部分： (4) 指令信号控制部分： (5) 电源部分： 膜片钳放大器主要组成 : 电极电流监视器 、 灵敏度开关 、 滤 波器开关 、 方式选择开关 。 用于校正全细胞记录时 ， 由 于电极和细胞内之间的通路 电阻所造成的膜电位误差 。 用 来 补 偿 电 压 突 然 改

32、变 时引起的电容电流 。 将一定的电压加入到刺激信 号中 ， 形成一指令信号的保 持电压 。 进行电压钳制时 ， 它决定膜电位值 ， 作电流钳 制时 ， 则决定电流值 。 提供放大器各部分的电源 。 贴附式 全细胞记录模式 负压吸 内面向外式 外面向外式 拉 细胞 细胞 细胞 细胞 拉并暴露于空气中 四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode) 细胞贴附式膜片（ cell-attached patch） 优点 ： 不破坏细胞的完整性 ， 不需要胞内灌流 ， 不 影响细胞质且调制系统完整 。 可研究通过细胞对单 通道的调制 ， 也可在正常离子环境中研究递质和电

33、 压激活的单通道活动 。 缺点： 不能改变细胞内成分 ， 也不能精确测定膜电 位 。 同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通 道 ， 细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录 的背景噪声 。 由于细胞牢固贴附于微管电极的尖端 而得名 。 它可用于记录各种细胞的单通 道电流 ， 而且是在细胞完整无损的状态 下研究通道的活动 。 贴附式记录 （ Cell-attached recording） 细胞 电极 细胞膜 胞外液 胞内液 内面向外式膜片 (inside-out patch) 细胞贴附式膜片形后 ， 提起电极时 ， 与电极尖端相 接的细胞膜被撕脱下来开成小泡 ， 将电极尖端在空气 中暴

34、露几秒钟后小泡很快破裂 ， 形成胞浆侧向外的内 面向外式膜片 。 特点： 较易改变细胞内的离子或物质浓度 ， 也能把 酶等直接加入膜的内侧面 ， 适宜研究胞内物质对通道 活动的影响 。 但实验中改变膜外侧物质困难 ， 且需侵 入低钙液中 ， 以免小泡形成 。 应用： 可研究胞内信使物质 cAMP、 cGMP、 Ca2+， 三磷酸肌醇 （ IP3） 等对受体型通道的调节 ， 以及 胞内激素对通道的调节 。 这种方式可使通道与细胞 的调节机制脱耦联 ， 使第二信使直接作用于膜内 ， 引起通道开闭 。 内面向外记录 （ Inside-out recording） 电极 脂质双分子层的 内 面面向浴液

35、 外面向外式膜片 (outside out patch) 细胞贴附式膜片形成后 ， 向微管电极内给予 较强的负压将膜片吸破 ， 再将电极从细胞膜上 拔起 ， 但不暴露于空气中 ， 被撕脱下来的膜便 形成外面向外式膜片 。 优点： 缺点： 应用： 可以任意改变胞外物质的浓度 ， 有利于研 究递质对膜离子通道外侧面的作用 。 实验中难以改变胞内成分 ， 电极管必须充 以低钙溶液以防小泡形成 。 可研究腺苷酸环化酶 、 蛋白激酶 C等活性变 化 ， 以及细胞膜上信使物质二酰甘油 、 花 生四稀酸 、 GABA、 Ach等对受体型的离子 通道研究 。 外面向外记录 （ Outside-out reco

36、rding） Patch-pipette 脂质双分子层的 外 面面向浴液 全细胞记录构型 (whole cell recording) 记录的电流属于宏观电 （ macroscopical current） ， 是整个细胞离子通道活动形成的总和电流 。 若采用膜 片钳放大器内的电流钳模式 ， 还可以记录细胞的静息 电位和动作电位 。 特点： 电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快 ， 因 而容易控制细胞内液的成分； 记录的是许多通道的 综合电流 ， 需改变内部介质以分离电流； 适合于对 小细胞的电压钳位 ， 对直径大于 30m的细胞很难实现 钳制； 该方法使电生理研究的重点从无脊椎动物大 细胞中解

37、脱出来 ， 而向人类和哺乳类细胞发展 。 全细胞记录 （ Whole-cell recording） 细胞 电极 细胞膜 膜片钳制技术记录方式 穿孔膜片记录技术 （ perforated patch recording technique） Hom和 Marty于 1988年首次建立了一种对 传统全细胞记录法改进的方法 ， 该方法是基 于某些抗生素如制霉菌素 （ Nystatin） ， 两性 霉素 B（ Amphotericin B） 等具有在生物膜上 形成通透性孔道的特性 ， 将这类抗生素充灌 在电极液中 ， 在形成高阻封接后 ， 可使电极 液与细胞内液在电学上相通 ， 因而称作穿孔 膜片记

38、录技术 。 穿孔膜片及穿孔囊泡记录模式 （ Perforated patch and perforated vesicle mode） 制霉菌素 形成的孔道 电极 受体 离子通道 提起电极 胞浆 穿孔囊泡 (外面向外式 ) 穿孔膜片 (缓慢全细胞式 ) 技术的优缺点 优点： 与全细胞记录相比 ， 该技术相比有 如下优点 由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡 萄糖的分子均不能通过 。 因此 ， 在全细胞记 录时可避免对胞内重要物质的渗析影响 ， 通 道电流衰减现象显著减慢 ， 那些对细胞内通 讯及通道调控具有重要作用的第二信使物质 仍可正常运行 。 因抗生素形成的孔道对多价离子不通 透 ， 故胞内

39、的这些离子的浓度就不受电极 液的影响 。 因此可在全细胞电流记录的同 时用 Ca2+染料测定胞内游离的 Ca2+水平 对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内 记 录及膜片钳全细胞记录 ， 记录时间可持续 3 小时 。 高阻封接不易被破坏 ， 而全细胞记录的负 压脉动式抽吸和电压脉冲易致高阻封接破坏 。 电极串联电阻较低 ， 膜电容更易补偿 。 缺点： 无法使电极液中的大分子与胞内物质交换 。 因此研究大分子物质对胞内机制的作用就不 能进行 。 由于电极液与胞内液之间存在 Donnan平衡 ， 因此电极液内必须有与细胞内相同浓度的不 通透阴离子和 Cl-， 否则将导致 Cl-流出或流入 细胞 ，

40、使阴离子和水重新平衡 ， 最终导致细 胞体液变化 。 穿孔所需时间较全细胞法长 。 浓度钳 （ concentration clamp） 用改变灌流液的方法来改变细胞内液或外液 中某种化学成分和浓度 。 人工地控制膜内或 膜外的溶液成分 ， 并在瞬间阶梯式地改变某 种化学物质的浓度 ， 这种技术就是浓度钳 ， 也称为化学钳 （ chemical clamip） ,或称浓度 跳变 (concentration jump)。 人工脂膜的膜电流记录 把构成细胞膜的脂质分子散布于水表面 时 ， 很容易形成亲水端向下脂质单分子层 ， 将单分子层背靠背地折叠起来 ， 就形成类似 细胞膜结构的人工脂质双层

41、。 纯的脂质双层 几乎是绝缘的 ， 但是将含有通道蛋白的脂质 小泡融入人工脂膜或将水溶性通道蛋白直接 插入人工脂质双层 ， 便可利用膜片钳技术记 录到单通道电流 。 三 膜片钳记录的基本步骤 （一）、液体配制 主要根据研究通道的不同 ， 所用细胞的 不同 ， 配制相应的液体 ， 基本原则是保持 2个 平衡 ， 渗透压平衡和酸碱平衡 。 另外 ， 所有 液体在使用前必须过滤 ， 以保持液体洁净 。 （ 二 ） 、 标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行 。 实 验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的 细胞 ， 也可来自脑片细胞中的原位细胞 。 常用 的酶是胶原酶和蛋白酶 ， 单独或联合使用

42、 ， 有 些组织还要加用其它酶 ， 如弹性纤维酶等 。 豚鼠心室肌细胞急性酶分离方法 肠系膜动脉平滑肌细胞分离 （ 三 ） 、 微管电极的制备 一般采用常规二步法完成 ， 电极 尖端直径在 12m之间 ， 抛光与涂布液 体硅酮树酯后 ， 充灌电极液 。 1、微管电极拉制 2、电极热抛光 3、缘树脂涂抹 4、电极液充灌 （四）、高阻抗封接形成 1 在恒温条件下 ， 将细胞贴壁良好的载玻片 移入有浴液的浴槽中 。 浴槽不能太深 ， 以尽量 减少电极进入浴液的深度 ， 从而减少浮游电容； 2 倒置相差显微镜下选择立体感强 、 活性好 的细胞进行实验； 3 使用新拉制的微管电极 ， 用细塑料管以反 充

43、灌方式灌电极液入电极尖端 ， 若含有气泡 ， 可手持微电极使其尖端朝下 ， 用手指敲弹几下 管壁即可排除 ， 然后再将微电极安装在探头上 。 4 当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时 ， 用注射器向电极施加一正压 （ 12cm H2O） ， 以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放 大器上 pipette offset旋钮 ， 将电极电压补偿到 零 。 同时由膜片钳放大器向微管电极发放 电 压为 5mV、 波宽 40ms的方波脉冲信号 ， 用于观 察封接过程； 5 微推进器将微管电极送入到即将接触细胞 时 ， 撤去正压 ， 并继续向选定的细胞表面推进 ， 当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变

44、小 ， 这时只要给微管电极尖端管腔内施加一负压 （ 1020cm H2O） ， 若在计算机屏幕上看到应 变电流突然下降至零 ， 电流噪声随之减少 ， 则 提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘 ， 其 阻抗约 10100G， 说明高阻抗封接 （ giga seal） 形成 ， 这时的膜片为细胞贴附式膜片 。 在此基 础上 ， 根据不同的实验要求 ， 再制成不同类型 的膜片构型 。 保证高阻封接要点： 电极电阻适当； 电极尖端清洁； 负压抽吸系统密闭； 电极与细胞相贴适度； 细胞膜清洁，活性好。 膜片钳记录系统示意图 灌流槽 In bath Pushed against cell More pre

45、ssure against cell Seal Go whole cell （五）、数据采集与分析 实验中通道电流信号经膜片钳放大器放大 后再经 12位 A/D、 D/A转换器输入计算机用于 电流信号采集，系统连接如下图所示： 分析的内容有： 1、 宏观电流的分析 宏观电流 （ macroscopical current） 是指膜上 许多通道同时开放形成的离子电流 ， 是由许 多单通道电流总和形成的 。 应用电压钳技术 在单细胞或多细胞标本上记录的电流和膜片 钳全细胞模式记录的电流都属宏观电流 。 （ 1） 、 通道的药理学特性 通道的药理学特性是通道分类的重要依据 ， 许 多通道具有 特异性

46、阻滞剂 和 激动剂 （ 或开放剂 ） 。 TTX 钠通道特异性阻滞剂 ， TEA 钾通道特异性阻滞剂 ， Cromakailm ATP敏感钾通道特异性开放剂 利用它们可以区分膜电流的成分 ， 有助于确认通 道的种类 。 （ 2）、通道的门控特性 通道的门控性主要是指电压门控通道的激活与失 活对电压和时间的依赖性 。 典型的电压门控通道的 活动包括激活过程和失活过程 。 钠通道门控 的 H-H模型 （ 3） 、 通道的电流 电压关系 利用通道的电流 电压关系 （ current- voltage relationship, 简称 I-V曲线 ） 可分析通 道的整流特性和离子选择性 。 、 通道整

47、流特性的分析 通道 I-V关系曲线与横坐标的交点是该通道电流 的 反转电位 Vrev或称 零电流电位 。 通道的整流特性 则是指通道电流对膜电位的依赖性 ， 通常可用 I-V关 系予以判断 。 通道的电流电 压关系曲线 整流（ Rectification） 电流和电压的关系不满足欧姆定律的直线关系。原因 是离子通道的开放导致膜电阻发生了变化。 有整流 无整流 V=IRc V=IRv 离子通道不开放时 膜的被动反应 离子通道开放时 膜的主动反应 外向整流 随膜电位的去极化 ， I-V曲线明显向 Y轴 （ 电流轴 ） 靠 近 。 如 IK电流 。 内向整流 随膜电位的去极化 ， I-V曲线明显向

48、X轴 （ 电压轴 ） 靠 近 。 如烟碱电流 。 IK电流的外向整流 烟碱电流的内向整流 去极化方向 去极化方向 、 通道离子选择性的分析 如果通道的离子选择性很高 ， 只能或主要 通过一种离子 ， 则 Vrev应等于或接近该离子的 平衡电位 。 如果通道通过多种离子 ， 则可利用 改变膜两侧某种离子浓度差以后的 Vrev变化来 判断膜电流中是否的该离子成分 。 例如 If通道 的 I-V曲线随 Na。 的增高而右移 ， Vrev相应变 正 ， 说明 If通道对钠离子有通透性 。 2、 单通道电流的分析 （ 1）、通道门控动力学的分析 典型的单通道电流 （ single channel cur

49、rent） 呈 一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化 。 它 有两个电导水平 ， 即 0和 1， 分别对应关闭和开放 状态 。 A：豚鼠心室肌内 向整流钾通道的 单通道电流 ； B：同一膜片上通 道开放（上）和 关闭（下）时间 频数分布直方图。 （ 2）、单通道电导的测定 在几个不同的钳制电位下记录膜片上单 通道电流，右得到单通道的 I-V曲线，曲线斜 率即单通道电导。 蛙骨骼肌细胞贴附式 膜片的记录 A：不同 钳制电位下记录的 N2 型乙酰胆碱受体阳 离子通道电流，左侧 数字为膜电位（ mV）。 B：单通道电流的 I V关系，膜电导 32pS。 I-V曲线（ Current-voltage

50、 curve） 电流 -电压关系曲线。可反映通道的如下动力学参数： 激活过程 阈电位 反转电位 整流特性 I( nA ) Ca 2+ o =5. 0m M -8 -6 -4 -2 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 2.5 mM 5.0 mM 7.5 mM Vh = -90mV D Vm (mV ) 50 ms 1 nA -60 mV 0 mV C A B Ca 2+ o =7. 5m M Ca 2+ o =2. 5m M （ 六 ） 、 主要仪器设备 超净工作台 （ YJ-1450， 苏州净化设备公司 ， China） 二氧化碳孵箱 （ 1815Tc， SHEL-LAB， U

51、.S.A） 数字式超级恒渐浴槽 （ HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） 微管电极拉制器 （ PP-83 NARISHIGE Japan） 微管电极抛光仪 （ ME-83 NAEISHIFE Japan） 电子刺激器 （ SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） 膜片钳放大器 （ AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） 倒置相差显微镜 （ AXIOVERT 135 ZEISS Germany） 计算机 （ P 800） A/D 、 D/A 转 换 器 （ DIGIDATA-1200 Axon Instruments

52、 U.S.A） pClamp软件 （ 7.0） Axon Instruments U.S.A ) 喷墨打印机 (HP DESKJET 500 U.S.A ) (七 )、 注意事项 （ 1） 电极尖端抛光： 未抛光的玻璃微电极尖端较粗 糙 ， 容易损伤细胞膜 ， 玻璃微电极尖端抛光后的口径 大小要适宜 。 抛光后玻璃微电极阻抗应在 4-7M之间 ， 随着细胞直径增大或减小 ， 电极阻抗相应减小或增大 。 (2)装玻璃微电极时 ， 手不要接触银丝电极 ， 银丝电极 接通膜片钳放大器 ， 能检测 0.06pA电流 ， 若手上带电 荷 （ 静电 ） 将可能击穿微电极放大器而造成很大损失 。 （ 3） 动手操作要慢： 由于该操作大多在镜下 进行 ， 放大倍数约 400左右 ， 因此操作幅度过 大易造成扎伤 、 扎死细胞 ， 甚至将电极尖端折 断 。 （ 4） 挑选状态好的细胞作为记录对象： 细胞 状态不好 ， 不易封接成功或维持较长的时间而 浪费时间和实验材料 ， 一般首选圆而亮且色泽 好的细胞 。 （ 5）实验台和所有实验仪器要良好接地。 （ 6）实验操作台尽可能振动可用减振台或网 球置于实验操作台台板下以及将操作台和屏蔽 分开，以减缓外界的振动。