酵母双杂基础知识总结

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1、酵母双杂原理：酵母双杂基础知识总结酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录 激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它 所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两 结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过

2、激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有二类 载体:a含DNA -binding domain的载体;b含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合 基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物 只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如 GAL4-bd 具有核定位序列 (nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T航原的一段 序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-1

3、47); LexA (E coli转录抑制 因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编 码序列等。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组 质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 1 易于转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的 内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到 明确的转录调控因子的DNA结

4、合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构 域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白 间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。GAL Promoter-GAL4ADmRNA1.5。4将上述酵母细胞液离心后转接到新的YPDA液体培养基中，使OD600=0.2，300ml1L0.130C 200rpm 培养 4-6h，使 OD600=0.55. 700g离心5分钟收集酵母细胞，用无菌水或TE洗酵母细胞。25-50ml500ml6. 再次 700g 离心 5

5、分钟。7.弃上清，用l.IXTE/LiAc重悬酵母细胞。1.5ml8ml8. 往离心管里加入如下试剂及 DNA: DNA-BD/baita0.1 mg0.2-1.0 mg AD/library0.1 mg0.1-0.5 mg Herring testes carrier DNA0.1 mg20 mg9. 加入感受态细胞，吸打均匀0.1 ml8 mll0. 加入 PEG/LiAc 缓冲液，高速漩涡混合0.6 ml60 mlll. 200rpm,30 度孵育 30min12.加入DMSO，轻轻混合70 ml7.0 ml13. 42 度，40min 水浴14. 冰浴 1-2min15.室温高速离心(

6、14000g)5s5min16.弃上清，用1XTE重悬，进行涂皿操作0.5ml10ml酵母文库的筛选A 诱饵质粒自激活活性检测和毒性检测1.诱饵载体和对照空载体转化酵母Y2H细胞，取100 涂布SD/-Trp固体培养板，30OC倒 置培养3-4天待菌落长出。2. 挑(2-3 mm)单克隆至50 ml SD/-Trp液体培养基中，30C摇床230-260 rpm, 16-24 hr后，菌落 PCR检测目的基因是否转入Y2H中，-70乜保存阳性菌种。3. 将阳性克隆在 SD/-Trp/X-gal(SDO/X) SD/-Trp/X-gal/Aba(SDO/X/A)平板上划线,309 倒置培养2天。4

7、观察有无蓝色菌斑的出现，菌斑不显蓝色则表明无自我激活活性；若实验菌斑与对照 生长状况相同，则诱饵载体对酵母无毒。注：所需涂的皿及其生长结果如下表：sampleSelective agar plate2mm colonycolourY2HpGBKT7:baitSDOSD/-TrpYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/ X-GalYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/ X-Gal /AbaNOnoY2HpGBKT7:Lam+DDO/ X-Gal /AbaNONOY187pGADT7-TY2HpGBKT7:53+DDO/ X-Gal /AbaYesblueY187pGAD

8、T7-TB 结合实验及筛库1. 在冰上冻融1ml文库(酵母菌株n 2 x 107cells Y187文库)。2. 在2L三角瓶中，加入5ml含Y2H酵母菌(nl x 109cells/ ml目的蛋白bait)的培养基 和上述冻融的 1ml 文库。3. 加入45ml 2xYPDA/Kan (50g/ml), 30-50rpm，30C, mating 20-24 小时，mating 20 小时后可取5pl到显微镜下观察，如还没有结合子存在，再mating 4小时，否则停止 mating 进入下面操作。4. 准备SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp (QDO)培养基平板，约150个(涂皿前应

9、在超净工作 台上吹2-3小时)。5. 转移mating体系至2个50ml离心管中，1000g室温离心10分钟，弃上清液。然后 再加入2xYPDA洗一次酵母细胞，1000g室温离心10分钟，弃上清液。再用灭菌水 清洗酵母细胞，两管合并，1000g室温离心10分钟，弃上清液，加入约10 ml灭菌水 重悬酵母细胞。6. 涂皿，每平板加入150止述悬浮酵母细胞用玻璃珠涂开至无流动液体。7. 封皿后置于30C恒温生长箱，生长4-6天后，选取菌斑大于2mm的菌落，在QDO 平板皿上划线， 2-3d 后长出的菌落可挑出来做插入片段扩增 PCR。8. 将（7）中扩增片段大小不同（PCR验证3次，可大大降低假阳

10、性菌落（约40%）的 菌落于QDO、QDO/X-Gal和QDO/X-Gal/Aba培养基上划线（可适当增大X-GaI和Aba 的浓度，以提高筛选的严谨性），封皿后置于30C恒温生长箱，生长2-3d后观察生长状 况。若在QDO上生长，QDO/X-Gal菌落变蓝，QDO/X-Gal/Aba不生长，则存在互作。 将存在互作的菌落进行菌落PCR，将PCR产物送去测序，对测序结果进行分析，看是 否存在与花粉的发育、能量传递和合成、核酸结合或者剪切、毒性蛋白等相关的基因9. 挑互作酵母菌株至2ml 2xYPDA中，30oC摇床230-260 rpm, 16-24 hr，提取酵母质 粒，再转入大肠杆菌中扩增

11、含目的基因的载体，测序，到数据库中比对测序结果，标 记感兴趣的互作蛋白。10. 阳性克隆验证：抽出互作的酵母质粒后做点对点验证，注意排除自激活情况。 注：点对点验证涂皿情况及其对应生长情况：sampleDDOQDOQDO/ X-GalQDO/X-Gal/AbaY2HpGBKT7:bait+Y187pGADT7:preyYesYesBlueNoY2HpGBKT7+Y187pGADT7:preyYesNoNoNoY2HpGBKT7+Y187pGADT7YesNoNoNoY2HpGBKT7:Lam+Y187pGADT7-TYesNoNoNoY2HpGBKT7:53+Y187pGADT7-TYesYesBlueYes