《蛋白质组学基础》PPT课件.ppt

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1、第 一 讲 ： 蛋 白 质 组 学 基 本 原 理 第 一 章 绪 论 15 February 2001 一 、 蛋 白 质 组 研 究 的 开 端 及 蛋 白 质 组 含 义 -2001年 ， 人 类 基 因 组 序 列 草 图 的 完 成 ， 宣 告 了 “ 后 基 因 组 时 代 ” 的 到 来 ， 其 主 体 是 功 能 基 因 组 学 （ functional genomics),而 蛋 白 质 是 基 因 功 能 的 执 行 体 ；2. 人 类 基 因 组 计 划 的 完 成 并 不 表 明 人 类 基 因 组 的 所 有 基 因 及 间 隔 序 列 已 完 全 确 定 ；3. 基

2、 因 组 计 划 即 使 已 确 定 某 生 物 基 因 组 内 的 全 部 基 因 ， 也 不 能 确 定 哪 些 基 因 在 何 时 、 何 地 、 以 何 种 程 度 表 达 ；4. 生 物 的 基 因 组 只 表 达 部 分 基 因 (3080%)， 表 达 的 基 因 类 型 及 其 表 达 程 度 随 生 物 生 存 环 境 及 内 在 状 态 的 变 化 而 表 现 极 大 的 差 别 ； 5. 基 因 虽 是 遗 传 信 息 的 源 头 ,而 蛋 白 质 是 基 因 功 能 的 执 行 体 ；6. 以 往 的 蛋 白 质 研 究 只 是 针 对 生 命 活 动 中 某 一 种

3、或 某 几 种 蛋 白 质 ， 难 以 系 统 透 彻 地 阐 释 生 命 活 动 的 基 本 机 制 ；因 此 ， 无 论 是 从 基 因 组 计 划 的 局 限 、 还 是 蛋 白 质 研 究 的 自 身 发 展 而 言 ， 大 规 模 、 全 方 位 的 蛋 白 质 研 究 均 是 势 在 必 行 。 Proteome : Protein +Genome （ 蛋 白 质 组 ）Genome: 一 个 细 胞 或 一 个 生 物 体 包 含 的 所 有 遗 传 信 息 ；Proteome： 一 种 细 胞 /组 织 /生 物 体 某 个 时 间 段 所 包 含 的 所 有 蛋 白 质 的

4、存 在 形 式 及 其 活 动 方 式 。蛋 白 质 组 及 蛋 白 质 组 学 的 含 义 Proteomics（ 蛋 白 质 组 学 ） ： 研 究 蛋 白 质 组 的 科 学 ， 阐 明 生 物 体 全 部 蛋 白 质 的 表 达 模 式 及 功 能 模 式 , 其 内 容 包 括 蛋 白 质 的 定 性 鉴 定 、 定 量 检 测 、 细 胞 内 定 位 、 相 互 作 用 研 究 等 ,最 终 揭 示 蛋 白 质 功 能 网 络 。 基 因 微 阵 列 （ microarray)提 供 了 细 胞 中 大 量 或全 部 基 因 表 达 的 快 速 检 测 手 段 ， 然 而 从 mR

5、NA水 平 不 一 定 能 预 测 细 胞 中 相 应 蛋 白 质 的 水 平 。因 为 ：1. 各 种 mRNA不 同 的 稳 定 性 和 不 同 的 翻 译 效 率 能 够 影 响 新 蛋 白 质 的 产 生 ；二 、 研 究 mRNA作 为 基 因 产 物 2. 蛋 白 质 形 成 后 在 稳 定 性 和 转 换 速 度 上 有 很 大 不 同 ，许 多 参 与 信 号 转 导 、 转 录 因 子 调 节 和 细 胞 周 期 控 制的 蛋 白 质 迅 速 转 换 ， 这 是 其 活 性 调 节 的 一 种 方 式 ；3. mRNA水 平 没 有 告 诉 我 们 相 应 蛋 白 质 的 调

6、 节 状 态 ，蛋 白 质 的 活 性 和 功 能 常 有 一 些 内 源 翻 译 后 的 改 变 ，也 会 因 环 境 因 素 而 改 变 。 三 、 蛋 白 质 组 学 研 究 的 内 容 结 构 蛋 白 质 组 学 ： 主 要 研 究 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 、 三 维 结 构 的 解 析 、 种 类 分 析 、 数 量 确 定 等 ； 蛋 白 质 结 构 测 定 主 要 是 应 用 X-光 衍 射 技 术 ， 蛋 白 质 种 类 和 数 量 测 定 主 要 是 应 用 双 向 电 泳 ， 蛋 白 质 鉴 定 的 手 段 是 质 谱 法 ； 功 能 蛋 白 质 组 学 ： 研

7、 究 蛋 白 质 的 功 能 ，确 定 蛋 白 质 在 亚 细 胞 结 构 中 的 定 位 ，蛋 白 质 -蛋 白 质 的 相 互 作 用 等 。蛋 白 质 组 学 比 较 注 重 研 究 蛋 白 质 类 型 与 数 量 在不 同 种 类 、 不 同 时 间 和 条 件 下 的 动 态 本 质 。 四 、 蛋 白 质 组 学 对 分 析 的 挑 战 用 DNA微 阵 列 和 相 关 方 法 分 析 基 因 表 达 依 赖 于 两 个重 要 工 具 ： PCR和 寡 核 苷 酸 与 互 补 序 列 的 杂 交 。 但是 没 有 类 似 的 工 具 用 于 蛋 白 质 分 析 。 1） 没 有 P

8、CR等 价 物 。 目 前 不 可 能 有 多 肽 分 子 以 类似 于 核 苷 酸 通 过 PCR复 制 的 方 式 复 制 。 第 二 ， 蛋 白 质 不 能 专 一 地 与 互 补 氨 基 酸 序 列 杂 交 。 第 三 ， 细 胞 中 每 一 个 蛋 白 质 产 物 并 不 一 定 只 有 一 种分 子 实 体 。因 此 ， 蛋 白 质 组 的 分 析 需 要 一 套 不 同 于 基 因 表 达 分 析的 工 具 ， 能 够 对 修 饰 和 非 修 饰 的 蛋 白 质 进 行 检 测 和定 量 分 析 。 五 、 蛋 白 质 组 学 的 工 具 四 种 重 要 工 具 的 发 展 和

9、结 合 使 用 给 我 们 提 供 了 灵 敏性 和 专 一 性 较 高 的 识 别 和 鉴 定 蛋 白 质 的 方 法 。 1） 数 据 库 ： 蛋 白 质 、 EST（ expressed sequence tags)、 和 基 因 组 序 列 数 据 库 共 同 提 供 了生 物 表 达 全 部 蛋 白 质 的 完 整 数 据 库 目 录 。 2） 质 谱 （ MS） ： 目 前 认 为 MS是 肽 序 列 分 析 中 的最 新 技 术 。 MS数 据 为 蛋 白 质 鉴 定 提 供 了 最 有 力 和最 精 确 的 方 法 。 3） 对 数 据 库 中 特 定 蛋 白 质 序 列 与

10、MS数 据 进 行 比 对的 各 种 软 件 。 4） 蛋 白 质 的 分 析 分 离 技 术 ， 2D-SDS-PAGE是 最 广泛 用 于 蛋 白 质 组 学 的 技 术 ， 蛋 白 质 分 辨 率 达 到 成 千上 万 种 ， 完 全 可 以 用 于 组 织 与 细 胞 中 的 大 规 模 蛋 白质 分 离 。 EST (Expressed Sequence Tag)表 达 序 列 标 签EST(expressedsequencetags)是 cDNA克 隆 的 末 端 序 列 ,平均 长 度 为 300 500bp,称 为 表 达 序 列 标 签 ,通 常 是 从 已 有 的cDNA文

11、 库 中 随 机 取 出 几 百 到 几 千 个 克 隆 一 次 测 序 产 生 ,一 般使 用 载 体 多 克 隆 位 点 互 补 序 列 作 为 通 用 引 物 。 一 个 EST代 表生 物 体 某 种 组 织 在 某 一 时 期 的 一 个 表 达 基 因 。 采 用 生 物 信 息学 方 法 延 伸 表 达 序 列 标 签 （ ESTs） 序 列 ， 获 得 基 因 部 分 乃 至全 长 cDNAycg， 将 为 基 因 克 隆 和 表 达 分 析 提 供 空 前 的 动 力 ，并 为 生 物 信 息 学 功 能 的 充 分 发 挥 提 供 广 阔 的 空 间 。 The ident

12、ification of ESTs has proceeded rapidly, with approximately 52 million ESTs now available in public databases (e.g. GenBank 5/2008, all species) 六 、 蛋 白 质 组 学 的 应 用 范 围u 根 据 目 前 的 实 践 ， 蛋 白 质 组 学 包 括 三 项 主 要 应 用 ：1） 蛋 白 质 表 达 谱 ： 蛋 白 质 表 达 谱 是 鉴 定 生 物 或 细 胞特 定 状 态 下 蛋 白 质 的 表 达 或 药 物 、 化 学 或 物 理 刺 激

13、下 蛋 白 质 的 表 达 ， 获 得 蛋 白 质 组 图 、 蛋 白 质 组 成 成分 鉴 定 、 新 型 蛋 白 质 发 掘 、 蛋 白 质 差 异 显 示 。 2） 蛋 白 质 修 饰 谱 ： 蛋 白 质 修 饰 谱 是 鉴 定 蛋 白 质 在 何处 、 怎 样 被 修 饰 的 。 许 多 蛋 白 质 翻 译 后 的 修 饰 控 制着 蛋 白 质 的 靶 向 、 结 构 、 功 能 和 转 换 。 此 外 ， 许 多环 境 化 学 因 素 、 药 物 、 和 内 源 化 学 因 素 可 产 生 修 饰蛋 白 质 的 活 性 亲 电 体 。3） 蛋 白 质 网 络 谱 ： 蛋 白 质 网

14、络 谱 是 在 生 物 系 统 中 测定 蛋 白 质 之 间 相 互 作 用 的 蛋 白 质 组 学 方 法 。 这 些 相互 作 用 决 定 蛋 白 质 功 能 网 络 。 获 得 ： 阐 释 重 要 生 命 活 动 的 分 子 机 制 ， 包 括 细 胞 周 期 、 细 胞分 化 与 发 育 、 细 胞 凋 亡 、 肿 瘤 发 生 与 发 展 、 环 境 反 应 与调 节 ， 物 种 进 化 等 。 医 药 靶 分 子 寻 找 与 分 析 ， 包 括 新 型 药 物 靶 分 子 、 肿 瘤 恶 性 标 志 、 人 体 病 理 介 导 分 子 、 病 原 菌 毒 性 成 分等 。 每 种 疾

15、 病 与 10个 基 因 相 关 ； 每 个 基 因 又 与 310个 蛋 白 质 相 关 ； 人 类 主 要 的 100150种 疾 病 ， 则应 该 有 300015000种 蛋 白 质 具 有 成 为 药 靶 的 可 能 性 。因 此 ， 可 能 有 几 千 或 上 万 种 新 的 药 物 靶 标 将 被 发 现 ， 将 是功 能 基 因 组 学 有 可 能 带 来 一 笔 巨 大 的 科 学 和 经 济 财 富 。 Outline一 、 概 述二 、 蛋 白 质 的 提 取 与 样 品 制 备三 、 蛋 白 质 的 分 离 与 二 维 电 泳 技 术四 、 蛋 白 质 的 检 测 技

16、术五 、 生 物 质 谱 技 术 与 蛋 白 质 的 鉴 定六 、 蛋 白 质 构 象 解 析 技 术 1、 蛋 白 质 组 学 研 究 远 比 基 因 组 学 研 究 复 杂（ 1） 一 个 生 物 对 象 的 蛋 白 质 数 量 远 大 于 基 因 数 量 如 人 的 基 因 组 有 3-5万 个 基 因 而 蛋 白 质 则 有 30-100万 ； （ 2） 基 因 组 的 组 成 是 固 定 的 ， 蛋 白 质 组 组 成 是 动 态 的 ；（ 3） 细 胞 内 蛋 白 质 的 拷 贝 数 （ 108） 远 比 基 因 拷 贝 数 大 （ 最 多 105）（ 4） 基 因 可 采 用 P

17、CR扩 增 和 自 动 测 序 ， 而 蛋 白 质 还 没 有 扩增 和 自 动 测 序 技 术 2、 蛋 白 质 组 学 研 究 技 术 进 展（ 1） 1975年 ， 2-DE技 术 建 立 ,上 世 纪 80年 代 ， 固相 化 pH梯 度 凝 胶 问 世 ， 使 2-DE的 重 复 性 和 加 样量 改 善 ；（ 2） 上 世 纪 末 期 ， MALDI-TOF-MS和 ESI-MS可 精 确测 定 相 对 分 子 量 和 微 量 蛋 白 质 的 测 定 ； （ 3） 快 速 多 肽 序 列 分 析 ；（ 4） 90年 代 ,多 图 象 分 析 与 大 规 模 数 据 处 理 软 件问

18、 世 ， 复 杂 蛋 白 质 图 谱 处 理 成 为 现 实 ； MALDI-TOF MS: matrix assisted laser desorption ionization-time of flight Mass Spectrometry;ESI/MS/MS: electrospray ionization 3、 蛋 白 质 组 分 析 的 首 要 要 求 将 来 自 于 全 细 胞 、 组 织 或 生 物 体 中 所 包 含 的 多 达 几千 种 混 合 蛋 白 质 进 行 分 离 、 检 测 、 分 析 ； 2-DE技 术 依 然 是 大 多 数 蛋 白 质 组 研 究 中 分 离

19、 复 杂 蛋白 质 混 合 物 的 首 选 技 术 。 生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得 4.蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 二 、 蛋 白 质 的 提 取 与 样 品 制 备 二 维 电 泳 分 析 中 的 样 品 制 备制

20、 备 原 则 ： 应 使 所 有 待 分 析 的 蛋 白 样 品 全 部 处 于 溶 解 状 态 （ 包 括多 数 疏 水 性 蛋 白 ） ， 且 制 备 方 法 应 具 有 可 重 现 性 。 防 止 样 品 在 聚 焦 时 发 生 蛋 白 质 的 聚 集 和 沉 淀 。 防 止 在 样 品 制 备 过 程 中 发 生 样 品 的 抽 提 后 化 学 修 饰（ 如 酶 性 或 化 学 性 降 解 等 ） 。 完 全 去 除 样 品 中 的 核 酸 和 某 些 干 扰 因 素 。 尽 量 去 除 起 干 扰 作 用 的 高 丰 度 或 无 关 蛋 白 质 ， 从 而 保证 待 研 究 蛋 白

21、质 的 可 检 测 性 。 样 品 制 备 原 则1、 尽 可 能 采 用 简 单 方 法 进 行 样 品 处 理 ， 以 避 免 蛋 白 质的 损 失 。（ 1） 明 确 研 究 目 标 ， 获 得 尽 可 能 多 的 感 兴 趣 蛋 白 质 ；（ 2） 不 同 类 型 的 蛋 白 质 需 要 不 同 的 方 法 ；（ 3） 考 虑 目 标 蛋 白 性 质 ， 细 胞 破 碎 选 择 温 和 和 激 烈 两种 方 法 ；2、 细 胞 和 组 织 样 品 的 制 备 应 尽 可 能 减 少 蛋 白 质 的 降 解 ，从 特 殊 亚 细 胞 器 提 取 蛋 白 还 需 分 级 分 离 。 3、

22、样 品 裂 解 液 新 鲜 制 备 ， 并 且 分 装 冻 存 于 -80 C， 不 要 反 复 冻 融 样 品 ；4、 通 过 超 速 离 心 清 除 所 有 的 杂 质 ， 主 要 去 除 盐 、 小 分 子 化 合 物 、 脂 类 、 离 子 去 污 剂 、 核 酸 、 多 糖 、 脂 类 、 酚 类 等5、 加 入 尿 素 之 后 ， 加 温 不 要 超 过 37 C， 以 防 蛋 白 质 氨 甲 酰 化 。 （ 一 ） 细 胞 裂 解 的 方 法 1、 温 和 裂 解 的 方 法 ： 适 用 于 组 成 比 较 简 单 的 样 品 或 分 析 特 定 的 细 胞 器（ 1） 渗 透

23、裂 解 ： 通 常 用 于 血 细 胞 、 组 织 培 养 细 胞 等 低 渗 溶 液 细 胞 ；（ 2） 冻 融 裂 解 ： 液 氮 快 冻 融 ， 然 后 在 37 C融 化 , 反 复 几 次 ,适 合 于 细 菌 、 组 织 培 养 细 胞 ；（ 3） 去 污 剂 裂 解 ： 溶 解 细 胞 膜 释 放 内 含 蛋 白 质 ， 主 要 针 对 组 织 培 养 细 胞 ；（ 4） 酶 裂 解 ： 在 等 渗 溶 液 中 用 酶 去 细 胞 壁 ， 常 用 的 酶 有 溶 菌 酶 (细 菌 )、 纤 维 素 酶 + 果 胶 酶 (植 物 )、 溶 细 胞 酶 （ 酵 母 ） 。 2、 剧

24、烈 的 细 胞 裂 解 方 法 主 要 针 对 难 破 碎 的 细 胞 、 酵 母 细 胞 和 细 胞 亚 组 织（ 1） 超 声 裂 解 法 ： 利 用 超 声 波 产 生 的 切 应 力 破 碎 细 胞 ， 但 要 注 意 产 生 热 量 和 气 泡 ；（ 2） 研 磨 法 :加 液 氮 和 沙 进 行 研 磨 ， 适 合 于 固 体 组 织 和 微 生 物 细 胞 ；（ 3） 机 械 匀 浆 法 ： 破 碎 固 体 软 组 织 和 动 物 组 织 （ 切 成 小 片 ） ， 同 时 要 加 入 预 冷 的 匀 浆 溶 液 ；（ 4） 玻 璃 珠 匀 浆 法 ： 适 用 细 胞 悬 液 或

25、 微 生 物 ， 目 的 在 于 破 碎 细 胞 ， 提 取 内 含 蛋 白 质 。 3、 蛋 白 酶 抑 制 剂 防 止 蛋 白 酶 裂 解 防 止 细 胞 裂 解 时 蛋 白 酶 释 放 出 来 降 解 蛋 白 质 。 低 温 、pH9的 裂 解 液 可 降 低 蛋 白 酶 活 性 ， 但 不 能 真 正 消 除 ，故 得 加 酶 抑 制 剂 （ 以 下 一 种 或 数 种 的 混 合 物 ） （ 1） PMSF： 苯 甲 磺 酰 氟 ， 工 作 浓 度 1mM， 能 不 可逆 灭 活 丝 氨 酸 蛋 白 酶 、 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 ， 但 在 水 溶 液中 失 活 。（ 2） A

26、EBSF： 可 在 水 溶 液 中 使 用 ， 工 作 浓 度 4mM，能 不 可 逆 灭 活 丝 氨 酸 蛋 白 酶 、 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 ， 但 可能 改 变 蛋 白 质 的 等 电 点 。（ 3） EDTA、 EGTA： 乙 二 氨 四 乙 酸 和 乙 二 醇 双 四 乙酸 的 工 作 浓 度 为 1mM， 作 用 对 象 为 金 属 蛋 白 酶 。 4、 蛋 白 质 沉 淀 步 骤（ 1） 硫 酸 铵 盐 析 原 理 ： 高 盐 将 蛋 白 质 沉 淀 出 来 ， 从 而 与 核 酸 分 离 ； 步 骤 ： 蛋 白 质 浓 度 1mg/ml， 缓 冲 溶 液 浓 度50mM(

27、含 EDTA),缓 慢 加 入 (NH4)2SO4,搅 拌 10-30min， 离心 分 离 。 注 意 点 ： 只 用 作 预 分 离 和 富 集 ， 且 (NH4)2SO4会 干 扰IEF（ 2） TCA沉 淀 三 氯 乙 酸 （ 终 浓 度 10-20%） 加 到 提 取 液 中 混 均 ， 置冰 上 30min， 最 后 用 丙 酮 或 乙 醇 清 洗 沉 淀 除 TCA。 该 法不 易 造 成 蛋 白 质 变 性 和 化 学 修 饰 。 （ 3） 丙 酮 沉 淀 提 取 物 加 入 3倍 体 积 的 冰 丙 酮 ， -20 沉 淀 2小 时 ， 离 心 空 气 干 燥 去 丙 酮 。

28、（ 4） 丙 酮 /TCA沉 淀 用 丙 酮 在 10%的 TCA中 重 悬 样 品 溶 液 （ 含 有 0.01的 -巯 基 乙 醇 或 20mmol/L),-20 沉 淀 45min,离 心 分 离 ,丙 酮 清 洗 沉 淀 ,空 气 干 燥 。（ 5） 苯 酚 提 取 蛋 白 质 提 取 到 饱 和 酚 中 ， 加 到 甲 醇 溶 液 中 NH 4CA沉 淀 ， 然 后 先 用 NH4CA洗 涤 ， 再 用 丙 酮 洗 涤 ， 空 气 干 燥 去 丙 酮 。 本 法 适 合 于 高 杂 质 的 植 物 样 品 。 5、 清 除 影 响 二 维 电 泳 图 谱 的 杂 质（ 1） 盐 、

29、残 留 的 缓 冲 液 和 电 性 小 分 子盐 等 带 电 物 质 会 干 扰 电 泳 过 程 、 增 大 溶 液 电 导 率 ， 通常 用 透 析 、 凝 胶 过 滤 、 沉 淀 /重 悬 的 方 法 脱 盐 ， 但 易使 样 品 丢 失 。 （ 2） 内 源 性 小 分 子这 些 物 质 通 常 带 负 电 ， 使 阳 极 侧 的 聚 焦 不 全 ， 可 采 用丙 酮 /TCA沉 淀 去 除 。（ 3） 离 子 去 污 剂SDS等 离 子 去 污 剂 ， 易 和 多 肽 形 成 复 合 物 而 干 扰 IEF，-20 0C的 丙 酮 溶 液 可 除 去 。 （ 4） 核 酸核 酸 增 加

30、 样 品 黏 度 ， 导 致 二 维 电 泳 背 景 发 散 ； 能 与 蛋白 质 结 合 ， 阻 碍 聚 焦 ； 银 染 时 出 现 高 背 景 。 加 0.1V的核 酸 酶 溶 液 (1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMgCl2)冰 上 孵 育 ,但 要 注 意 核 酸 酶 本 身会 出 现 在 图 谱 中 。 （ 5） 多 糖 多 糖 能 阻 碍 凝 胶 孔 径 、 与 蛋 白 质 形 成 复 合 物 ， 可用 (NH4)2SO4或 苯 酚 - NH4CA沉 淀 后 离 心 ， 或 用 超 速 离心 去 多 糖 。 （ 6） 脂 类 脂 类 易

31、 和 膜 蛋 白 结 合 成 复 合 物 ， 改 变 蛋 白 溶 解 性 、等 电 点 和 分 子 量 ， 采 用 大 量 去 污 剂 可 除 去 。 （ 7） 酚 类 通 常 出 现 在 植 物 组 织 中 ， 通 过 氧 化 反 应 修 饰 蛋 白 质 ，可 用 沉 淀 法 去 除 ， 或 加 抑 制 剂 灭 活 多 酚 氧 化 酶 。 目 的 ： 加 入 裂 解 液 主 要 是 确 保 一 向 等 电 聚 焦 之 前 样 品 的 完 全 溶 解 和 变 性组 成 ： 尿 素 +去 污 剂 +（ 有 时 ） 还 原 剂 原 理 ：（ 1） 尿 素 能 溶 解 和 解 折 叠 蛋 白 ， 最

32、 低 作 用 浓 度 为8M， 硫 脲 可 增 加 膜 蛋 白 质 的 溶 解（ 2） 去 污 剂 防 止 疏 水 相 互 作 用 蛋 白 质 聚 合 ， 常 用的 去 污 剂 有 NP-40、 Triton-X100， 同 时 加 4%CHAPS或 0.25%SDS效 果 更 好 。6、 裂 解 液 的 组 成 （ 3） 还 原 剂 用 于 断 裂 二 硫 键 ， 常 用 的 有 DTT （ 二 硫 苏 糖 醇 ） 、 TDF （ 二 硫 赤 藓 糖 ） 和 TBP（ 三 丁 基 膦 ） 使 用 注 意 点 ： 样 品 离 心 前 在 室 温 下 至 少 保 持 1小 时 ， 使 完 全 变

33、 性 和 溶 解 ； 样 品 含 尿 素 不 可 加 热 ， 以 防 蛋 白 质 修 饰 ； 样 品 类 型 不 同 ， 选 择 裂 解 液 的 组 成 也 不 同 。 三 、 蛋 白 质 的 分 离 与 二 维 电 泳 技 术 (一 ) 二 维 电 泳 的 基 本 原 理 根 据 蛋 白 质 的 两 个 一 级 属 性 等 电 点 和 相 对 分 子 量的 特 异 性 ， 将 蛋 白 质 混 合 物 在 第 一 方 向 按 等 电 点 高 低进 行 等 电 聚 焦 分 离 （ IEF） ， 在 第 二 方 向 按 照 分 子 量 大小 进 行 SDS-PAGE分 离 （ 十 二 烷 基 硫

34、酸 钠 -聚 丙 烯 酰 胺 凝胶 电 泳 ） 。 1D-SDS-PAGE一 原 理 在 1D-SDS-PAGE中 ， 蛋 白 质 样 品 溶 解 在 通 常 含 有 巯 基还 原 剂 （ 巯 基 乙 醇 或 DDT)和 SDS的 上 样 缓 冲 液 中 。 SDS与 蛋 白 质 结 合 ， 以 与 分 子 质 量 约 恒 定 的 比 例 将负 电 荷 （ 来 自 SDS硫 酸 基 团 ） 传 递 给 蛋 白 质 。 高 电压 下 ， 蛋 白 质 - SDS复 合 物 在 交 联 的 聚 丙 烯 酰 胺 凝胶 上 迁 移 ， 其 速 度 取 决 于 它 们 穿 越 凝 胶 孔 基 质 的 能力

35、 。 蛋 白 质 按 照 分 子 质 量 次 序 分 离 形 成 条 带 。 二 1D-SDS-PAGE的 局 限 性 用 1D-SDS-PAGE得 到 的 分 离 度 是 相 当 有 限 的 ， 显 示 含 有 单 一 蛋 白 质 的 条 带 实 际 上 可 能 含 有 多 种 蛋 白 质 分 子 。 2D-SDS-PAGE一 两 种 分 离 方 法 的 结 合 1） 根 据 等 电 点 用 IEF分 离 蛋 白 质 ； 2） 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 上 电 泳 进 一 步 分 离 聚 焦 的 蛋 白 质 。 2D-SDS-PAGE在 第 一 向 电 泳 根 据 等 电 点 的 不

36、同 ， 第 二 向 电 泳 根 据 分 子 质 量 的 不 同 分 离 蛋 白 质 。 二 新 式 2D-SDS-PAGE 新 系 统 使 用 固 相 PH梯 度 （ IPG)胶 条 和 相 对 简 单的 硬 件 ， 能 很 容 易 的 从 IPG胶 条 将 蛋 白 质 转 移 到SDS-PAGE平 板 凝 胶 中 。 在 固 相 PH梯 度 中 ， 聚 羧 酸两 性 电 解 质 固 定 在 支 持 物 上 ， 产 生 可 重 复 的 PH梯度 。 三 、 2D凝 胶 分 离 蛋 白 质 的 染 色 通 过 2D凝 胶 分 离 蛋 白 质 的 显 色 使 用 通 常 的 染 色技 术 ， 包

37、括 银 染 、 考 马 斯 亮 蓝 和 酰 胺 黑 染 色 。 银染 和 新 的 荧 光 染 料 是 最 灵 敏 的 。 五 2D-SDS-PAGE存 在 的 问 题 1） 进 行 可 完 全 重 复 的 2D-SDS-PAGE分 析 是 困 难 的 。 2） 某 些 蛋 白 质 不 适 于 进 行 第 一 维 IEF步 骤 。 许 多 较 大 的 疏 水 蛋 白 质 在 这 种 类 型 的 分 析 中 结 果 不 理 想 ；由 于 蛋 白 质 存 在 不 同 等 电 点 的 多 种 形 式 ， 蛋 白 质 的IEF常 把 蛋 白 质 分 离 成 许 多 不 连 续 的 条 带 。 3） 作

38、为 检 测 技 术 的 蛋 白 质 染 色 的 动 态 范 围 相 对 较 小 。点 密 度 最 多 能 反 映 100倍 的 蛋 白 质 浓 度 范 围 。 2、 二 维 电 泳 分 辨 能 力传 统 的 二 维 电 泳 最 好 条 件 下 20cm 20cm的 胶 理 论 上可 分 辨 10,000个 蛋 白 点 （ 各 个 方 向 100点 ） ,实 际 上 只能 分 辨 3000个 点 . 3、 二 维 电 泳 可 提 供 的 数 据 二 维 电 泳 分 离 后 的 蛋 白 质 经 染 色 （ 考 马 氏 亮 蓝 染 、银 染 、 负 染 、 荧 光 染 色 、 放 射 标 记 染 色

39、 ） 、 通 过 图 象标 志 扫 描 存 档 ， 最 后 显 现 的 是 二 维 排 列 的 “ 满 天 星 ” ，每 个 星 点 代 表 一 个 蛋 白 质 。 最 终 获 得 蛋 白 质 相 对 分 子量 、 等 电 点 和 相 对 丰 度 三 方 面 的 数 据 。 4、 二 维 电 泳 结 果 说 明二 维 电 泳 得 到 的 实 验 结 果 并 非 功 能 蛋 白 ，由 于 样 品 处 理 过 程 中 涉 及 亚 基 间 的 二 硫 键还 原 和 烷 基 化 处 理 ， 即 蛋 白 质 的 高 级 结 构 已 被 消 除 ，最 终 得 到 的 是 蛋 白 质 的 亚 基 。 Cel

40、l cultureProtein extraction2-DE Silver staining Image analysisScanning 四 、 蛋 白 质 的 检 测 技 术 （ 一 ） 考 马 氏 亮 蓝 染 色 考 马 氏 亮 蓝 （ Coomassie brilliant blue） 是 一 类三 苯 基 甲 烷 衍 生 物 。 分 为 R-250（ 红 兰 色 ） 、 R-350 （ 红 兰 色 ） 、 G-250（ 蓝 绿 色 ） ， 它 们 与 蛋 白质 结 合 生 成 深 蓝 色 复 合 物 ， 在 464-595nm有 吸 收峰 （ 595nm 最 大 ） ， 且 在 比

41、 较 宽 的 范 围 内 （ 15-20 mg ） 扫 描 峰 的 面 积 与 蛋 白 质 量 成 线 性 关 系 ， 因 此可 在 595nm对 蛋 白 质 进 行 定 量 检 测 ， 而 且 在 一 定 pH条 件 下 ， 这 种 染 料 -蛋 白 质 复 合 物 被 完 全 解 聚 。 （ 二 ） 银 染1、 原 理 ： 二 维 凝 胶 在 固 定 液 中 固 定 后 ， 在 含 戊 二 醛 的 溶液 中 增 敏 ， 然 后 浸 泡 在 银 盐 溶 液 中 ， 蛋 白 与 Ag+络 合 ， 凝胶 空 白 背 景 中 Ag+结 合 不 牢 而 被 冲 洗 ， 然 后 在 酸 碱 环 境 中

42、络 合 的 Ag+被 还 原 成 金 属 银 ， 蛋 白 点 上 金 属 银 被 曝 光 显 示棕 黄 色 或 棕 黑 色 。 2、 特 点（ 1） 银 染 分 酸 性 （ AgNO3） 与 碱 性 （ Ag(NH3)2+） 两 种 ,酸 性 染 色 背 景 浅 、 容 易 控 制 ， 碱 性 灵 敏 度 稍 高 ， 但 背 景 深 、 不 容 易 控 制 。（ 2） 相 对 于 考 染 ， 灵 敏 度 高 ， 可 达 200pg。（ 3） 但 由 于 存 在 戊 二 醛 的 特 异 性 反 应 ， 对 下 一 步 的 酶 切 肽 谱 提 取 存 在 困 难 , 增 敏 过 程 蛋 白 质 被

43、 部 分 提 取 至 胶 外 。 (三 )负 染 1、 原 理 （ 锌 -咪 唑 染 料 ） 咪 唑 存 在 时 ， 自 由 或 弱 结 合 的 锌 离 子 以 锌 -咪 唑 形式 沉 淀 下 来 ， 而 大 部 分 锌 离 子 因 与 蛋 白 质 结 合 牢 固 ， 留 在 胶 上 ， 从 而 导 致 半 透 明 背 景 上 的 空 白 区 域 ， 就 是 负 染 过 程 。 2、 特 点（ 1） 负 染 能 提 高 SDS-PAGE胶 上 蛋 白 质 的 回 收 率 ， 负 染 色 结 果 在 凝 胶 表 面 产 生 半 透 明 背 景 ， 而 凝 胶 显 示 黑 色 背 景 或 相 应

44、底 色 ， 蛋 白 质 以 透 明 形 式 被 检 测 出 来 ， 而 且 蛋 白 质 被 很 好 地 保 存 下 来 。（ 2） 显 色 过 程 仅 需 5-15min（ 3） 蛋 白 质 易 从 胶 上 取 出 ， 一 般 用 EDTA络 合 金 属 离 子 就 可 转 移 出 蛋 白 质 。（ 4） 灵 敏 度 15ng。 （ 四 ） 荧 光 染 色1、 原 理 ： 利 用 荧 光 染 料 对 蛋 白 质 进 行 标 记 ， 在 光 激发 下 产 生 荧 光 ， 通 过 扫 描 得 到 图 象 。 比 如 用 甲 基 Cy3与 甲 基 Cy5两 种 染 料 分 别 对 两 个 不 同 蛋

45、 白 样 品 进 行 荧光 标 记 ， 并 在 一 块 2-DE胶 上 进 行 运 行 ， 由 于 两 种 染 料激 发 波 长 不 同 ， 扫 描 时 可 得 到 两 张 有 差 异 的 图 象 ， 因此 可 用 于 差 异 蛋 白 质 组 学 研 究 。 2、 特 点（ 1） 灵 敏 度 250pg与 银 染 相 近 ， 但 线 性 范 围 高 于 银 染 。（ 2） 蛋 白 质 被 荧 光 共 价 修 饰 ， 改 变 了 移 动 性 能 ， 降 低 了 溶 解 性 ， 导 致 质 谱 鉴 定 出 现 偏 差 。（ 3） 不 同 样 品 由 于 所 含 蛋 白 质 可 被 荧 光 修 饰

46、的 功 能 基 团 数 不 一 样 ， 灵 敏 度 变 化 不 一 样 。 二 维 电 泳 荧 光 检 测 染 色 方 法 灵 敏 度 线 性 范 围 与 质 谱 兼 容 性 费 用 硬 件 要 求考 染 10ng 3 + + +银 染 200pg 7 + + +负 染 15ng 3 + + +荧 光 标 记 250pg 104 + + + （ 五 ） 总 结 五 、 蛋 白 质 序 列 测 定 和 生 物 质 谱 技 术 质 谱 分 析 法 ：质 谱 分 析 法 (mass spectrometry)是 将 化 合 物 形 成离 子 和 碎 片 离 子 ， 按 其 质 荷 比 ( / 值 )

47、的 不 同 进 行分 离 测 定 ， 来 进 行 成 分 和 结 构 分 析 的 一 种 分 析 方 法 。 蛋 白 质 、 多 肽 质 谱 是 通 过 电 离 源 将 蛋 白 质 分 子转 化 为 气 相 离 子 ， 然 后 利 用 质 谱 分 析 仪 的 电 场 、磁 场 将 具 有 特 定 质 量 与 电 荷 比 值 ( / 值 )的 蛋 白 质离 子 分 离 开 来 ， 经 过 离 子 检 测 器 收 集 分 离 的离 子 ， 确 定 离 子 的 / 值 ， 分 析 鉴 定 未 知 蛋 白 质 。 ESI： electrospray ionization， 电 喷 雾 电 离MALDI

48、： matrix-assisted laser desorption ionization， 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离MALDI-TOF-MS： matrix-assisted laser desorption ionization and Time of Flight, 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 这 两 种 电 离 技 术 可 以 使 核 酸 或 蛋 白 质 、 多 肽 等 不 易挥 发 的 生 物 大 分 子 产 生 汽 化 的 带 单 电 荷 或 多 电 荷 的分 子 离 子 ， 从 而 能 够 测 定 其 分 子 量 ， 同 时 它

49、们 所 具 有 的高 灵 敏 度 和 高 质 量 检 测 范 围 使 生 物 大 分 子 的 微 量 分 析成 为 可 能 。 灵 敏 度 可 达 ： fmol(10-15)乃 至 amol(10-18) Instrumentation of MS Source: produce ions from the sample； Mass analyzer（ 质 谱 仪 ） : resolve ions based on mass/charge (m/z) ratio； Detector（ 检 测 器 ） : detect the ions resolved by the mass analyzer

50、； Data acquisition system（ 数 据 采 集 系 统 ） : control the operation and record the MS data 。 How MS Instruments Work What Do We Want from MS Data? Sensitivity: routinely obtain data on femtomole (10-15 mole) of peptides or less Resolution: reliably distinguish ions that differ in m/z values of at least

51、 1 Da Mass accuracy: the measured values close to their real values Ion Sources Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 Electrospray ionization (ESI)电 喷 雾 电 离 MALDI Since discovered by Tanaka, Karas and Hillenkamp in 1987, MALDI has become a powerful tool for protein a

52、nd peptide analysis； The MALDI process is characterized by the use of matrix molecules which minimize analyte fragmentation and increase sensitivity； MALDI allows the desorption and ionization of analytes with very high molecular mass in excess of 100,000 Da MALDI : Principle 分 析 物 （ analyte） 分 散 在

53、基 质 分 子 中 ， 并 形 成 晶 体 ； The pulsed laser beam is directed at the matrix containing the sample； The matrix molecules emit the absorbed energy in the form of heat, causing crystals and sample to vaporize into the gas phase； The charged ions are then extracted into the TOF mass analyzer, and sent down

54、to the detector. MALDI: Practical Considerations Laser wavelength and power density Nitrogen lasers (337 nm) are standard but other lasers are also used High laser power induces more fragmentation and loss of mass resolution Matrix selection and optimization Strong absorbance at the laser wavelength

55、 Low enough mass to be sublimable Vacuum stability Lack of chemical reactivity Sample preparation (“dried-droplet”) MALDI Spectrum of Peptide Mixture ESI: Principle A strong electric field is applied to a liquid stream passing through a capillary tube； The field induces a charge accumulation at the

56、liquid surface located at the end of the capillary, causing formation of highly charged droplets； These droplets then pass through a heated gas curtain to remove the last solvent molecules。 N2 (80 oC)N 2 (80 oC) ESI: Practical Considerations To observe a stable spray, a minimum amount of electrolyte

57、 in the solvent is required, but this is so low that normal solvents contain enough electrolytes for this purpose. The maximum tolerable total concentration of electrolytes to still have good sensitivity is about 10-3 M Typical ESI Spectrum Mass Analyzers Time-of-flight (TOF) analyzer（ 飞 行 时 间 质 量 分

58、 析 器 ） Quadrupole analyzer （ 四 级 杆 分 析 器 ） Triple Quadrupole analyzer（ 三 级 四 级 杆 分 析 器 ） Quadrupole ion trap analyzer（ 四 级 离 子 阱 分 析 器 ） Objective: Generate a unique set of numbers For any protein1. Peptide Mass Fingerprint (PMF)2. Peptide Fragmentation (MS/MS)AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRS

59、RGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSERDVSTPPTVLPDNFPRYPVGKFFQYDTWKQST QRLRRGLPALLRARRGHVLAKELEAFREAKRHRPLIALPTQDPAHGGAPPEMASNRK 563.32619.32624.38739.48764.391053.451134.531187.60YPVGKQSTQRGHVLAKGLPALLRELEAFRGIVEECCFRFFQYDTWKGFYFSRPASRDVSTPPTVLPDNFPR 1654.84Protein sequence Enzyme specific peptides Peptidema

60、ssesEnzymatic hydrolysis GIVEECCFR Fragmentation in MS Enzyme specificpeptide G I V E E C C F R 58171 270 399 528630 732879175322424526655784883996Masses of fragment ions 肽 质 量 指 纹 谱 (Peptide Mass Fingerprinting)：蛋 白 质 被 酶 切 位 点 专 一 的 的 蛋 白 酶 水 解 后 得 到 的 肽 片 断质 量 图 谱 。 由 于 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 不 同 ， 其

61、肽 混 合 物质 量 数 也 具 特 征 性 ， 所 以 称 为 肽 质 量 指 纹 谱 ，用 于 蛋 白 质 的 鉴 定 。 Peptide Mass Fingerprinting:Overview Protein identification technique involves the use of MS to measure the masses of proteolytic peptide fragments； The measured peptide masses are searched against corresponding peptide masses from prot

62、ein sequence databases； The protein is identified if there is a good match between the experimental and theoretical masses. Peptide Mass Fingerprinting:Dual-Track Approach Experimental Computational Protein sequence databases or nucleotide sequence databases1） Perform virtual digestion of all the pr

63、oteins in a database into peptides with a chosen protease；2） Calculate the peptide masses under given digestion conditions and generate a list of theoretical peptides；3） Correlate the measured peptide masses with those in the list；4） Report the best matched peptides in the order of decreasing signif

64、icance.Intact protein from 2D-SDS-PAGE or HPLCPeptide mixtureMALDI-TOF MS determination of peptide massesDigestion 750 1300 1850 2400 2950 3500Mass (m/z)20406080100% Intensity1. Acquire mass spectrum with good calibration 1607.742 2211.1021005.564 2873.3021471.766973.577 1162.653 1635.739 2225.124 2

65、299.1741805.848 3259.4692. Generate a list of monoisotopic masses4. Evaluate results based on scores Matches are made easy by search engines3. Submit mass list to search engine Characteristics of various search enginesSearch engine Key features Scoring methodMascothttp:/ MS and MS/MS modes combinedA

66、utomated searches are available Probability basedMS-Fit/MS-Taghttp:/prospector.ucsf.edu MS or MS/MS modesAutomated searches not available MOWSE in MS modematch count in MS/MS modePeptIdent http:/www.expasy.ch/tools/peptident.html MS mode onlyAutomated searches not available Genetic algorithm based on the characteristics of TOF MS spectraProFound/Sonarshttp:/ MS or MS/MS modesAutomated searches available Bayesian approachSEQUESThttp:/fields.scripps.edu MS/MS mode onlyAutomated searches available