经典液相色谱法

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1、第 二 十 章 经 典 液 相 色 谱 法 经 典 液 相 色 谱 法u 经 典 液 相 色 谱 法 包 括 经 典 柱 色 谱 法 和 平 面 色 谱 法 。u 经 典 色 谱 法 与 现 代 色 谱 法 的 区 别 主 要 在 于 输 送 流 动相 方 式 、 固 定 相 种 类 和 规 格 、 分 离 效 能 、 分 析 速 度和 检 测 灵 敏 度 等 方 面 。u 现 代 色 谱 法 灵 敏 度 高 ， 分 离 效 率 高 。 但 经 典 色 谱 法也 有 许 多 优 点 ， 设 备 简 单 ， 操 作 方 便 ， 分 析 速 度 快 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法 n 一 、

2、基 本 原 理 (一 )吸 附 与 吸 附 平 衡 吸 附 是 吸 附 剂 、 溶 质 、 溶 剂 分 子 三 者 之 间 的 复杂 相 互 作 用 。 吸 附 平 衡 常 数 K 不 同 的 溶 质 有 不 同 的 K值 ， 一 个 组 分 的 色 谱 特 性完 全 由 吸 附 平 衡 常 数 K决 定 。 msCCK 溶 质 在 流 动 相 中 的 浓 度溶 质 在 固 定 相 中 的 浓 度 第 一 节 吸 附 色 谱 法 K值 大 说 明 该 物 质 被 吸 附 得 牢 ， 在 固 定 相 中停 留 时 间 长 ， 在 柱 中 移 动 速 度 慢 ； 要 使 混 合 物 中 各 个 组

3、 分 实 现 相 互 分 离 ， 则 它们 的 K值 相 差 必 须 足 够 大 ， 且 K值 相 差 越 大 ， 各组 分 越 容 易 彼 此 分 离 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法(二 )吸 附 等 温 线 吸 咐 等 温 线 是 指 在 一 定 温 度 下 ， 某 一 组 分 在 固 定相 和 流 动 相 之 间 达 到 平 衡 时 ， 以 组 分 在 固 定 相 中 的 浓度 Cs为 纵 坐 标 ， 以 组 分 在 流 动 相 中 的 浓 度 Cm为 横 坐标 得 到 的 曲 线 。 等 温 线 的 形 状 是 重 要 的 色 谱 特 性 之 一 ， 它 有 三 种类 型 ： 线

4、型 、 凸 型 和 凹 型 。 通 常 在 低 浓 度 时 ， 每 种 等 温 线 均 呈 线 型 ， 而 高浓 度 时 ， 等 温 线 则 呈 凸 型 或 凹 型 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 1 线 型 吸 附 等 温 线 是 理 想 的 等 温 线 当 吸 附 平 衡 常 数 K一 定 时 ， 其 吸 附 等 温 线 为线 型 ， 即 达 到 平 衡 时 ， 组 分 在 固 定 相 中 的 浓 度Cs与 其 在 流 动 相 中 浓 度 Cm成 正 比 ， 直 线 的 斜 率为 K。 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 2 非 线 型 吸 附 等 温 线 在 几 乎 所 有 的 实

5、际 情 况 下 ， 吸 附 等 温 线 都 有些 弯 曲 而 呈 非 线 型 。 一 般 液 -固 吸 附 色 谱 系 统 大多 呈 现 凸 形 吸 附 等 温 线 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法 A. 线 型 B. 凸 型 C.凹 型 a. 吸 附 等 温 线 b. 相 应 的 洗 脱 峰 型 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 二 、 吸 附 剂吸 附 色 谱 法 对 吸 附 剂 有 下 面 几 点 基 本 要 求 ： 有 较 大 的 表 面 积 ， 有 足 够 的 吸 附 能 力 ， 但 对不 同 物 质 其 吸 附 能 力 又 不 一 样 ； 与 洗 脱 剂 、 溶 剂 及 样 品

6、不 起 化 学 反 应 ， 并 在所 用 溶 剂 和 洗 脱 剂 中 不 溶 解 ； 粒 度 均 匀 ， 粒 度 要 细 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法(一 )常 用 的 吸 附 剂 吸 附 剂 可 分 为 有 机 和 无 机 两 大 类 。 其 中 以 硅胶 和 氧 化 铝 、 聚 酰 胺 较 为 常 用 。 1.硅 胶 2. 氧 化 铝 第 一 节 吸 附 色 谱 法 1.硅 胶 其 骨 架 表 面 的 硅 醇 基 ， 能 吸 附 大 量 水 分 ， 这种 表 面 吸 附 水 称 为 “ 结 合 水 ” ， 加 热 至 105 110 左 右 能 除 去 ， 除 去 的 水 分 越 多

7、 ， 吸 附 能 力越 强 。 硅 胶 的 活 性 与 含 水 量 有 关 ， “ 结 合 水 ” 高 达17%以 上 时 ， 吸 附 能 力 降 低 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法 硅 醇 基 有 两 种 形 式 ， 一 种 是 游 离 羟 基 ( )， 另 一种 是 键 合 羟 基 ( )， 当 硅 胶 加 热 到 200 以 上 时 ， 失去 水 分 ， 使 表 面 羟 基 变 为 硅 醚 结 构 ( )， 后 者 为 非极 性 ， 不 再 对 极 性 化 合 物 有 选 择 性 保 留 作 用 而 失 去色 谱 活 性 。 ( ) ( ) ( ) 由 于 硅 胶 具 有 弱 酸 性

8、 ， 所 以 选 择 性 地 保 留 胺 类和 其 它 碱 性 化 合 物 。 H O Si H OSiO HSi SiSi O 第 一 节 吸 附 色 谱 法2. 氧 化 铝 色 谱 用 氧 化 铝 有 碱 性 、 中 性 和 酸 性 三 种 。 碱 性 氧 化 铝 (pH9 10)适 用 于 碱 性 和 中 性 化 合 物的 分 离 。 中 性 氧 化 铝 (pH7.5)适 用 范 围 广 ， 凡 是 酸 性 、 碱性 氧 化 铝 可 以 使 用 的 ， 中 性 氧 化 铝 也 都 适 用 。 酸 性 氧 化 铝 (pH5 4)适 用 于 分 离 酸 性 化 合 物 。 第 一 节 吸 附

9、 色 谱 法(二 )吸 附 剂 的 活 性 吸 附 剂 的 活 性 和 含 水 量 有 一 定 的 关 系 。 含 水 量愈 高 ， 其 吸 附 活 性 愈 低 ， 活 性 级 数 愈 大 ， 吸 附 力 就愈 弱 。 反 之 亦 然 ， 含 水 量 愈 低 ， 其 活 性 愈 高 ， 活 性级 数 愈 小 ， 吸 附 力 就 愈 强 。 吸 附 剂 使 用 前 必 须 先 经 过 活 化 处 理 。 在 一 定温 度 下 ， 加 热 除 去 水 分 以 增 强 活 性 的 过 程 称 之 为 活化 。 反 之 ， 加 入 一 定 量 水 分 便 可 使 其 活 性 降 低 ， 亦称 为 失

10、活 或 减 活 。 分 离 极 性 小 的 物 质 ， 一 般 选 用 吸 附 活 性 大 的 吸附 剂 ， 反 之 ， 分 离 极 性 大 的 物 质 则 应 选 用 活 性 小 的吸 附 剂 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 三 、 色 谱 条 件 的 选 择 选 择 色 谱 分 离 条 件 时 ，必 须 从 吸 附 剂 、 被 分 离物 质 、 流 动 相 （ 展 开 剂 ）三 方 面 综 合 考 虑 。 组 分 吸 附 剂 流 动 相 极 性 活 性 小 极 性 非 (弱 )极 性 活 性 大 非 极 性 或 弱 极 性 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 四 、 操 作 方 法 (

11、一 )柱 色 谱 1. 色 谱 柱 的 制 备(1)玻 璃 柱 干 装 法 湿 装 法 (2) 尼 龙 柱 用 于 色 谱 分 离 的 尼 龙 柱 ， 应 具 备 下 列 条 件 ： 应 有 一 定 的 强 度 ， 且 易 于 切 割 ； 对 有 机 溶 剂 呈 惰 性 ， 且 能 用 手 工 热 封 ； 能 透 过 紫 外 线 ， 便 于 将 无 色 物 质 在 柱 上 定 位 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法2. 加 样 与 洗 脱 首 先 将 被 分 离 样 品 溶 于 一 定 体 积 的 溶 剂 中 ， 选 用 的 溶剂 极 性 应 低 ， 体 积 要 小 。 上 样 前 ， 应 将

12、 柱 上 端 的 溶 剂 放 出 至 近 吸 附 剂 表 面 。 沿管 壁 加 入 样 品 溶 液 ， 溶 液 加 完 后 ， 打 开 活 塞 使 液 体 慢 慢 放出 。 在 洗 脱 时 ， 用 分 液 漏 斗 连 续 不 断 地 加 入 洗 脱 剂 ， 并 保持 一 定 高 度 的 液 面 。 在 收 集 洗 脱 液 时 ， 应 采 用 等 份 集 。3 检 出 可 以 通 过 分 段 收 集 流 出 液 ， 采 用 相 应 的 物 理 和 化 学 方法 进 行 检 出 。 常 用 的 检 出 方 法 很 多 ， 如 化 学 反 应 法 、 TLC及 其 它 方 法 。 第 一 节 吸 附

13、 色 谱 法n (二 )薄 层 色 谱 按 薄 板 的 分 离 效 能 ， 可 分 为 经 典 薄 层 色 谱 法 (TLC)及 高 效 薄 层 色 谱 法 (HPTLC)两 类 。 薄 层 色 谱 有 下 列 一 些 特 点 ： (1)展 开 时 间 短 ， 一 般 只 需 十 几 分 钟 到 几 十 分 钟 ； (2)分 离 能 力 较 强 ， 一 块 板 可 分 离 多 达 约 20个 组 分 ； (3)灵 敏 度 高 ， 通 常 使 用 的 样 品 量 为 几 至 几 十 微 克 ； (4)显 色 方 便 ， 可 直 接 喷 洒 腐 蚀 性 的 显 色 剂 ； (5)所 用 仪 器 简

14、 单 ， 操 作 方 便 ； (6)既 能 分 离 大 量 样 品 ， 也 能 分 离 微 量 样 品 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 1 薄 层 板 的 制 备 （ 1） 手 工 制 板 手 工 制 板 所 用 的 玻 璃 板 ， 除 另 有 规 定 外 ， 一 般为 10cm 10cm,10cm 15cm,20cm 10cm或20cm 20cm的 2mm厚 规 格 ， 要 求 板 面 平 整 ， 洗 净后 放 置 在 薄 层 板 放 置 架 上 备 用 。 然 后 用 手 动 或 自 动涂 布 器 将 已 调 好 的 固 定 相 均 匀 地 涂 铺 在 玻 璃 板 上 。最 好 用

15、自 动 涂 布 器 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法 制 备 含 粘 合 剂 的 硬 板 ， 要 先 制 备 固 定 相 的 匀 浆 ， 调制 固 定 相 的 匀 浆 时 可 将 一 定 量 的 固 定 相 按 上 表 比 例 加 入适 量 水 或 粘 合 剂 ， 在 研 钵 中 或 在 匀 浆 器 中 调 匀 ， 倒 入 手动 或 自 动 涂 布 器 中 涂 布 。 室 温 下 阴 干 后 ， 活 化 后 备 用 。 定 性 定 量 分 析 时 薄 层 厚 度 为 0.3 0.5mm， 制 备 薄层 厚 度 为 0.5 2mm。（ 2） 预 制 板 预 制 板 是 由 工 厂 生 产 出

16、来 的 商 品 板 ， 使 用 方 便 ， 涂布 均 匀 ， 薄 层 光 滑 ， 牢 固 结 实 ， 分 离 效 果 及 重 现 性 好 。品 种 繁 多 ， 规 格 齐 全 ， 能 满 足 不 同 的 分 析 要 求 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法2 点 样 点 样 体 积 ： 经 典 薄 层 一 般 为 1 10L， 高 效 薄 层 为 100 500nL； 点 样 形 状 ： 一 般 为 圆 形 点 ， 点 样 基 线 距 底 边 1.0 1.5cm， 样 点 直 径 为 2 3mm， 高 效 薄 层 原 点 直 径 约 为 1mm， 要 尽 可 能 避 免 多 次 点 样 ；点 间

17、 距 离 ： 可 视 斑 点 扩 散 情 况 而 定 。 一 般 经 典 薄 层 为 1 2cm， 高 效 薄 层 为 0.5cm；常 用 的 点 样 器 具 ： 定 量 毛 细 管 （ 0.5、 1、 2、 3、 4、 5和 10L） 和 铂 铱 合 金 毛 细 管 （ 100nL和 200nL） ， 另 一 类 是 注 射 器 式 的 可 变 体 积 微 量 点 样 器 和 毫 微 点 样 器 ， 用 手 工 点 样 时 常 用 定 量 毛 细 管 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法 薄 层 点 样 示 意 图 S-对 照 品 溶 液 ； 1.2-样 品 溶 液 ； 原 点 ； d1-点

18、间 距 离 ； d2-原 点 与 板 底 边 距 离 ； d3-展 距 ； F-溶 剂 前 沿 F s 1 2 s 1 2 d3 d2d1 第 一 节 吸 附 色 谱 法3 展 开 点 样 后 的 薄 层 ， 置 密 闭 的 玻 璃 槽 中 ， 用 合 适 的展 开 剂 展 开 。 展 开 剂 浸 入 薄 层 下 端 高 度 不 应 超 过0.5cm。 点 样 处 不 可 接 触 展 开 剂 ， 展 距 一 般 为 815cm。 对 于 样 品 成 分 复 杂 的混 合 物 ， 可 采 用 双 向 展 开 法 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法 点 于 同 一 薄 层 的 同 一 物 质 的

19、斑 点 ， 在 色 谱 展 开过 程 中 ， 靠 薄 层 边 缘 处 斑 点 的 Rf值 与 中 心 区 域 斑 点的 Rf值 有 所 不 同 ， 此 称 边 缘 效 应 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法为 了 减 少 边 缘 效 应 ， 可 采 取 下 列 办 法 ：(1)最 好 用 较 小 体 积 的 展 开 缸 或 将 薄 层 在 缸 内 放 置 一定 时 间 ， 待 溶 剂 蒸 汽 达 到 饱 和 后 再 行 展 开 ；(2)在 展 开 缸 内 壁 贴 上 浸湿 展 开 剂 的 滤 纸 条 ；(3)如 采 用 3cm以 下 的 狭小 薄 板 ， 只 点 2 3个 点 。 第 一 节

20、吸 附 色 谱 法4 斑 点 的 检 出 （ 1） 光 学 检 出 法 化 合 物 本 身 有 色 ， 在 自 然 光 下 可 直 接 观 察 斑 点 。 有 些 化 合 物 在 可 见 光 下 不 显 色 ， 但 可 吸 收 紫 外 光 ， 且能 发 射 更 长 波 长 的 光 而 显 示 不 同 颜 色 的 荧 光 斑 点 ， 故在 紫 外 灯 下 显 现 不 同 颜 色 。 紫 外 分 析 仪 有 短 波 型(254nm)和 长 波 型 (366nm)两 种 灯 。 在 可 见 紫 外 光 下 都 不 显 色 ， 也 没 有 合 适 显 色 方 法 的 化合 物 ， 可 以 用 荧 光

21、薄 层 进 行 分 离 。 化 合 物 在 紫 外 光 灯下 可 在 发 亮 的 背 景 上 显 示 暗 斑 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法（ 2） 试 剂 显 色 法 喷 雾 显 色 将 显 色 剂 用 电 动 薄 层 喷 雾 器 直 接 喷 洒 于 硬 板 上 ， 根 据 显 色 剂 的 不 同 ， 可 直 接 显 色 或 加 热 显 色 。 浸 渍 显 色 也 可 用 浸 渍 法 处 理 薄 层 ， 使 生 成 颜 色 稳 定 、 轮 廓 清 楚 、 灵 敏 度 高 的 色 斑 。 利 用 某 些 物 质 的 蒸 气 与 样 品 作 用 生 成 不 同 颜 色 或 产 生 荧 光 ，

22、 也 可 用 于 斑 点 的 检 出 。 蒸 气 检 出 法 多 数 有 机 化 合 物 能 吸 附 碘 蒸 气 而 显 示 黄 色 斑 点 。 有 些 化 合 物 遇 碘 蒸 气 后 发 生 紫 外 吸 收 的 变 化 或 产 生 极 强 的 荧 光 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 五 、 定 性 与 定 量 分 析(一 )定 性 分 析 1.比 移 值 Rf 在 薄 层 色 谱 法 中 ， 常 用比 移 值 Rf来 表 示 各 组 分 在色 谱 中 的 位 置 。 R f 原 点 至 溶 剂 前 沿 的 距 离原 点 至 斑 点 中 心 的 距 离 Rf与 分 配 系 数 K及 容

23、量 因 子 k之 间 的 关 系 为 ： Rf Rf值 为 常 数 ， 其 值 在 0 1之 间 。 Rf =0， 表 示 化 合 物 在 薄 层 上 不 随 溶 剂 的 扩 散 而 移动 ， 仍 在 原 点 位 置 ； Rf =1， 表 示 溶 质 不 进 入 固 定 相 ， 即 表 示 溶 质 和 溶剂 同 步 移 动 。 一 般 要 求 R f值 在 0.2 0.8之 间 。 kVVK ms 1 11 1 第 一 节 吸 附 色 谱 法 影 响 Rf值 最 重 要 的 因 素 是 吸 附 剂 的 性 质 与 展 开剂 的 极 性 和 溶 解 能 力 。 当 应 用 同 一 种 吸 附 剂

24、 和 同 一 种 展 开 系 统 时 ， 被测 物 质 的 Rf值 又 受 下 列 因 素 的 影 响 ： 1 薄 层 厚 度 2 展 开 距 离 3 展 开 容 器 中 展 开 剂 蒸 气 的 饱 和 度 4 点 样 量 5 薄 层 含 水 量 第 一 节 吸 附 色 谱 法2.相 对 比 移 值 Rst 为 了 解 决 由 于 Rf值 重 现 性 差 ， 进 行 定 性 困 难 的问 题 ， 常 采 用 相 对 比 移 值 Rst来 定 性 。 相 对 比 移 值 Rst的 定 义 为 ： Rst值 是 相 对 Rf值 ， 是 样 品 与 参 考 物 移 动 距 离 之比 ， 可 消 除

25、许 多 系 统 误 差 。 参 考 物 是 另 外 加 入 也 可以 直 接 以 样 品 中 某 一 组 分 作 为 参 考 物 。 R st值 可 以 大 于 1。 的 距 离原 点 至 参 考 物 斑 点 中 心 距 离原 点 至 样 品 斑 点 中 心 的stR 第 一 节 吸 附 色 谱 法n （ 二 ） 定 量 分 析 1 间 接 定 量 法 (洗 脱 测 定 法 ) 薄 层 展 开 后 ， 将 被 测 物斑 点 或 区 带 捕 集 ， 用 溶 剂 洗脱 ， 然 后 再 用 适 当 的 分 析 方法 (比 色 法 、 分 光 光 度 法 、气 相 色 谱 、 荧 光 分 析 法 等

26、)测 定 含 量 。 2 薄 层 扫 描 法 该 法 快 速 、 简 便 ， 结 果 灵 敏 、 准 确 ， 适 用 于 多组 分 物 质 和 微 量 组 分 的 定 量 。（ 1） 薄 层 扫 描 仪 薄 层 扫 描 仪 光 学 系 统 结 构 示 意 图 第 一 节 吸 附 色 谱 法 测 定 方 式 及 原 理A 吸 收 测 定 法 可 见 区 (370 700 nm)用 钨 灯 ， 紫 外 区(200 370nm)用 氘 灯 为 光 源 。 B 反 射 测 定 法 光 束 照 到 薄 层 斑 点 上 测 量 ， 反 射 光 强 度 。 C 透 射 测 定 法 光 束 照 到 薄 层 斑

27、 点 上 ， 测 量 透 射 光 强 度 。 D 荧 光 测 定 法 用 汞 灯 或 氙 灯 (200 700 nm)为 光 源 。 吸 收 参 数 （ KX） 与 样 品 浓 度 成 正 比 ， 所 以 无 论 是 反射 法 还 是 透 射 法 ， 测 得 值 与 样 品 之 间 都 不 呈 线 性 。 透 射 法 测 定 时 ， SX值 越 大 ， 吸 光 度 越 大 ； 反 射 法 测定 时 ， SX值 越 大 ， 反 射 度 越 小 。 SX值 取 决 于 薄 层 吸 附 剂 的 性 能 、 粒 度 和 分 布 情 况 。SX值 要 预 先 测 定 ， 通 过 仪 器 的 线 性 补

28、偿 器 ， 用 电 路 系 统将 弯 曲 的 曲 线 校 正 为 直 线 后 用 于 定 量 。 线 形 校 正 1-校 正 前 的 标 准 曲 线 2-校 正 后 的 标 准 曲 线 第 一 节 吸 附 色 谱 法 扫 描 方 式 扫 描 方 式 分 线 性 (直 线 )扫 描 和 锯 齿 (曲 折 )扫 描 法 。 F 锯 齿 形 扫 描 方 式 能 消 除 展 开 后 斑 点 形 状 不 规 则 而 引起 的 误 差 ， 可 获 得 满 意 的 定 量 结 果 。 双 波 长 法 扫 描 光 源 的 光 分 两 路 ， 通 过 两 个 分 光 器 出 来 两 束 不 同 波长 的 光 。

29、 一 路 用 于 测 量 样 品 ， 称 样 品 波 长 S； 另 一 路做 为 对 照 ， 称 参 比 波 长 R。F 双 波 长 法 可 以 消 除 斑 点 处 薄 层 本 身 的 干 扰 ， 消 除 薄层 厚 度 不 均 匀 引 起 的 基 线 波 动 ， 能 可 靠 地 检 测 痕 量 组 分 . 第 一 节 吸 附 色 谱 法（ 2） 定 量 方 法 外 标 法 分 为 外 标 一 点 法 和 外 标 二 点 法 。A 外 标 一 点 法 工 作 曲 线 通 过 原 点 （ 截 距 为 零 ）时 可 用 外 标 一 点 法 定 量 ， 需 点 一 种浓 度 的 对 照 品 溶 液 。

30、 C F 1A C为 样 品 的 浓 度 或 重 量 ， A为 样 品 的 峰 面 积 ， F1为 直 线 的 斜 率 或 比 例 常 数 B 外 标 二 点 法 工 作 曲 线 不 通 过 原 点 时 ， 只 能 用 外 标 二 点 法 定量 ， 至 少 要 点 在 同 一 薄 层 板 上 二 种 不 同 浓 度 的 对 照品 溶 液 (或 一 种 浓 度 两 种 点 样 量 ) 。F 1 和 F2都 是 通 过 测 量 随 行 的 对 照 品 溶 液 的 浓 度 （ C1和 C2） 和峰 面 积 （ A1和 A2） 求 出 ， 所 以 这 种 方 法 又 叫 随 行 标 准 法 。21 F

31、AFC 第 一 节 吸 附 色 谱 法 内 标 法 本 法 与 外 标 法 的 主 要 区 别 ， 在 于 用 内 标 法 时 面积 累 计 值 为 被 测 样 品 和 内 际 物 的 面 积 之 比 。 由 于 内标 物 与 被 测 物 的 测 定 是 在 同 通 道 上 ， 因 此 要 求 内标 物 的 吸 收 波 长 接 近 被 测 物 质 的 吸 收 波 长 ， 并 与 被测 物 质 的 斑 点 要 完 全 分 开 。 因 而 ， 内 标 物 的 选 择 比较 困 难 。 外 标 法 是 更 为 常 用 的 定 量 方 法 。 第 一 节 吸 附 色 谱 法n 六 、 高 效 薄 层

32、色 谱 (HPTLC) 高 效 薄 层 色 谱 法 是 在 七 十 年 代 中 期 由 常 规 TLC发 展 形 成 的 ， 也 称 毫 微 (克 )量 薄 层 色 谱 (nanoTLC)。 高 效 薄 层 色 谱 法 具 有 快 速 、 高 效 、 灵 敏 的 特 点 。 高 效 薄 层 色 谱 之 所 以 能 达 到 高 效 ， 主 要 取 决 于吸 附 剂 的 性 能 及 涂 板 、 点 样 和 展 开 等 微 量 操 作 技 术 。 高 效 薄 层 色 谱 法 定 量 多 用 薄 层 扫 描 法 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 n 一 、 基 本 原 理 将 某 种 溶 剂 涂 布

33、 在 吸 附 剂 颗 粒 表 面 或 纸 纤 维上 ， 形 成 一 层 液 膜 ， 称 为 固 定 相 ; 吸 附 剂 颗 粒 或 纸 纤 维 称 为 支 持 剂 或 载 体 、 担 体 ; 溶 质 在 固 定 相 和 流 动 相 之 间 发 生 分 配 ,各 组 分 因分 配 的 不 同 而 获 得 分 离 。 色 谱 过 程 是 物 质 在 相 对 运 动 的 两 相 间 平 衡 分 布过 程 ， 若 混 合 物 中 各 组 分 的 分 配 系 数 K不 同 ， 那 么被 流 动 相 携 带 移 动 的 速 度 就 不 等 ， 由 于 差 速 迁 移 而被 分 离 。 第 二 节 分 配

34、色 谱 法 在 分 配 色 谱 中 ， 是 用 溶 剂 极 性 来 描 述 分 配 作 用的 。 极 性 溶 剂 与 极 性 溶 质 之 间 有 较 强 的 分 子 间 作 用力 ， 而 非 极 性 溶 剂 与 非 极 性 溶 质 之 间 也 有 较 强 的 分子 间 作 用 力 ， 因 此 溶 解 度 的 “ 相 似 者 相 溶 ” 经 验 规则可 用 于 分 配 色 谱 中 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 n 二 、 载 体 在 分 配 色 谱 法 中 载 体 只 起 负 载 固 定 相 的 作 用 。 对 它 的 要 求 是 惰 性 ， 没 有 吸 附 能 力 ， 能 吸 留 较 大

35、量 的 固 定 相 液 体 。 载 体 必 须 纯 净 ， 颗 粒 大 小 均 匀 。 常 用 的 载 体 有 ： (1) 硅 胶 (2) 硅 藻 土 是 现 在 应 用 最 多 的 载 体 。 (3) 纤 维 素 是 纸 色 谱 的 载 体 ， 也 是 分 配 柱 色 谱 常用 的 载 体 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 n 三 、 固 定 相 及 其 选 择 分 配 色 谱 根 据 固 定 相 和 流 动 相 的 相 对 极 性 ， 可 以 分 为 两 类 ： 一 类 称 为 正 相 分 配 色 谱 ， 其 固 定 相 的 极 性 大 于 流 动 相 ，即 以 强 极 性 溶 剂 作

36、为 固 定 相 ， 而 以 弱 极 性 的 有 机 溶 剂 作 为 流动 相 ； 在 正 相 分 配 色 谱 中 ， 被 分 离 成 分 中 极 性 大 的 亲 水 性 成分 移 动 慢 ,而 极 性 小 的 亲 脂 性 成 分 移 动 快 。 另 一 类 为 反 相 分 配 色 谱 则 相 反 ， 其 固 定 液 具 有 较 小 的 极性 ， 而 流 动 相 则 极 性 较 大 。 在 反 相 分 配 色 谱 中 ， 被 分 离 成 分的 移 动 情 况 与 正 相 分 配 色 谱 相 反 ， 即 亲 脂 性 成 分 移 动 慢 ， 在水 中 溶 解 度 大 的 成 分 移 动 快 。 第

37、二 节 分 配 色 谱 法 n 四 、 流 动 相 及 其 选 择 一 般 正 相 色 谱 法 常 用 的 流 动 相 有 石 油 醚 、 醇 类 、 酮类 、 酯 类 、 卤 代 烷 类 、 苯 等 或 它 们 的 混 合 物 。 反 相 色 谱 法 常 用 的 流 动 相 则 为 正 相 色 谱 法 中 的 固 定液 如 水 、 各 种 水 溶 液 、 低 级 醇 类 等 。 固 定 相 与 流 动 相 的 选 择 ， 要 根 据 被 分 离 物 中 各 组 分在 两 相 中 的 溶 解 度 之 比 即 分 配 系 数 而 定 。 可 先 使 用 对 各组 分 溶 解 度 大 的 溶 剂

38、为 洗 脱 剂 ， 再 根 据 分 离 情 况 改 变 洗脱 剂 的 组 成 ， 即 在 流 动 相 中 加 入 一 些 别 的 溶 剂 ， 以 改 变各 组 分 被 分 离 的 情 况 与 洗 脱 速 率 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 n 五 、 操 作 方 法 (一 )柱 色 谱 1.固 定 相 的 涂 布 与 装 柱 用 硅 胶 、 纤 维 素 等 作 载 体 时 ， 可 直 接 称 出 一 定 量 的载 体 ， 再 加 入 一 定 比 例 的 固 定 液 ， 混 匀 后 按 吸 附 剂 装 柱法 装 入 柱 内 ， 也 分 干 法 和 湿 法 两 种 。 以 硅 藻 土 为 载

39、体 ， 先 把 硅 藻 土 放 在 大 量 的 流 动 相中 ， 在 不 断 搅 拌 下 ， 逐 渐 加 入 固 定 液 ， 加 入 不 宜 太 快 ，加 完 后 继 续 搅 拌 片 刻 。 然 后 填 充 柱 ， 分 批 小 量 地 倒 入 柱中 ， 用 一 端 平 整 的 玻 璃 棒 把 硅 藻 土 压 实 压 平 ， 随 时 把 过量 的 溶 剂 放 出 。 待 全 部 装 完 后 应 得 到 一 个 均 匀 填 好 的 色谱 柱 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 2.加 样 和 洗 脱 加 样 的 方 法 有 三 种 ：(1)被 分 离 物 配 成 浓 溶 液 ， 用 吸 管 轻 轻

40、 沿 管 壁 加 到 含固 定 液 载 体 的 上 端 ， 然 后 加 流 动 相 洗 脱 ；(2) 被 分 离 物 溶 液 用 少 量 含 固 定 液 的 载 体 吸 附 ， 待 溶剂 挥 发 后 ， 加 在 色 谱 柱 载 体 的 上 端 ， 然 后 加 流 动 相洗 脱 ；(3)用 一 块 比 色 谱 柱 内 径 略 小 的 圆 形 滤 纸 吸 附 被 分 离物 质 溶 液 ， 待 溶 剂 挥 发 后 ， 再 加 在 色 谱 柱 载 体 上 ，然 后 加 流 动 相 洗 脱 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 (二 )纸 色 谱 以 滤 纸 作 为 载 体 ， 以 构 成 滤 纸 的 纤

41、 维 素 所 结 合水 分 为 固 定 相 ， 以 水 饱 和 的 有 机 溶 剂 为 展 开 剂 的 色谱 分 析 方 法 。 1. 色 谱 纸 的 选 择 和 处 理 (1)滤 纸 的 选 择 滤 纸 的 质 地 要 均 匀 ， 厚 薄 均 一 ， 纸 面 必 须 平 整 ； 具 有 一 定 的 机 械 强 度 ， 被 溶 剂 润 湿 后 仍 能 悬 挂 ； 具 有 足 够 的 纯 度 ； 要 选 择 纤 维 松 紧 适 宜 ， 厚 薄 适 当 ， 展 开 剂 移 动 的速 度 适 中 的 滤 纸 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 (2)滤 纸 的 处 理 有 时 为 了 适 应 某 些

42、 特 殊 化 合 物 分 离的 需 要 ， 可 对 滤 纸 进 行 处 理 ， 使 滤 纸 具 有 新 的 性能 。 例 如 多 数 生 物 碱 在 中 性 溶 剂 系 统 中 分 离 ， 往 往产 生 拖 尾 现 象 ， 如 将 滤 纸 预 先 用 一 定 pH值 的 缓 冲 溶液 处 理 就 能 克 服 。 反 相 纸 色 谱 ： 将 亲 脂 性 液 层 固 定 在 滤 纸 上 作 为固 定 相 ， 水 或 亲 水 性 液 层 为 流 动 相 ， 即 为 反 相 纸 色谱 。 适 用 于 一 些 亲 脂 性 强 、 水 溶 性 小 的 化 合 物 的 分离 。 第 二 节 分 配 色 谱

43、法 2 点 样 纸 色 谱 的 点 样 方 法 与 薄 层 色 谱 相 似 。 3 展 开 剂 的 选 择 纸 色 谱 最 常 用 的 展 开 剂 是 水 饱 和 的 正 丁 醇 、 正戊 醇 、 酚 等 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 4. 展 开 在 展 开 前 ， 先 用 溶 剂 蒸 气 饱 和 容 器 内 部 ， 或 用浸 有 展 开 剂 的 滤 纸 条 贴 在 容 器 内 壁 ， 下 端 浸 入 溶 剂中 ， 使 容 器 尽 快 地 被 展 开 剂 所 饱 和 。 然 后 再 将 滤 纸浸 入 溶 剂 中 进 行 展 开 。 纸 色 谱 的 展 开 方 式 ， 通 常 采 用 上

44、 行 法 ， 让 展 开剂 借 毛 细 管 效 应 自 下 向 上 移 动 。 对 于 Rf值 较 小 的 样 品 ， 可 以 用 下 行 法 ， 借 助 于重 力 使 溶 剂 由 毛 细 孔 向 下 移 动 ， 第 二 节 分 配 色 谱 法 上 行 展 开 装 置5 检 出 纸 色 谱 的 检 出 方 法 和 TLC基 本 相 同 ， 但 纸 色 谱 不 能用 腐 蚀 性 显 色 剂 如 硫 酸 等 ， 对 有 抗 菌 作 用 的 成 分 ， 可 应用 生 物 检 定 法 ， 也 可 以 用 酶 解 方 法 。 第 二 节 分 配 色 谱 法 n 六 、 应 用 吸 附 色 谱 主 要 适

45、 用 于 亲 脂 性 物 质 的 分 离 ， 对 于强 极 性 物 质 ， 如 脂 肪 酸 和 多 元 醇 等 ， 在 极 性 吸 附 剂上 分 离 很 不 理 想 ， 分 配 色 谱 的 产 生 ， 使 这 些 强 极 性亲 水 性 物 质 得 到 了 很 好 的 分 离 。 分 配 色 谱 法 的 优 点 在 于 有 较 好 的 重 现 性 ， 并 可根 据 K值 预 示 分 离 结 果 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 n 概 念 ： 以 离 子 交 换 剂 为 固 定 相 ， 用 水 或 与 水 混 合的 溶 剂 作 为 流 动 相 ， 利 用 它 在 水 溶 液 中 能 与

46、 溶 液中 离 子 进 行 交 换 的 性 质 ， 根 据 离 子 交 换 剂 对 各 组分 离 子 亲 合 力 的 不 同 而 使 其 分 离 的 方 法 。n 离 子 交 换 剂 可 分 为 无 机 离 子 交 换 剂 和 有 机 离 子 交换 剂 ， 其 中 以 有 机 离 子 交 换 剂 在 分 离 分 析 中 应 用最 广 泛 ， 种 类 也 较 多 ， 目 前 国 内 生 产 和 应 用 最 多的 是 离 子 交 换 树 脂 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 n 一 、 离 子 交 换 树 脂 及 其 特 性 (一 )离 子 交 换 树 脂 离 子 交 换 树 脂 主 要

47、 由 高 分 子 聚 合 物 的 骨 架 和 活性 基 因 所 组 成 ， 它 的 骨 架 具 有 特 殊 的 网 状 结 构 。 以 聚 苯 乙 烯 型 比 较 普 遍 ， 化 学 性 质 稳 定 ， 交 换容 量 大 。 根 据 树 脂 所 含 活 性 基 团 的 性 质 ， 以 及 所 交 换 离子 的 电 荷 可 分 为 阳 离 子 交 换 树 脂 和 阴 离 子 交 换 树 脂 。 n 1. 阳 离 子 交 换 树 脂 以 阳 离 子 作 为 交 换 离 子 的 树 脂 ， 其 中 可 电 离 的H+离 子 与 溶 液 中 某 些 阳 离 子 进 行 交 换 。 苯 乙 烯 树 脂

48、是 由 苯 乙 烯 和 二 乙 烯 苯 经 聚 合 ， 磺化 而 成 ， 是 最 常 用 的 阳 离 子 交 换 树 脂 。 CH CH2 CH CH2 CH2CH CH CH CHCH2CH2 CH2 CHCH CH CH CH2 CH2 SO3H SO3HSO3HSO3HSO3H SO3H SO3H SO3H SO3H 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 n 2. 阴 离 子 交 换 树 脂 树 脂 的 母 体 和 苯 乙 烯 型 树 脂 相 同 ， 但 在 母 体 上 连 接 NH2， NHR， NR2， 或 N+R3X-等 活 性 基 团 。 此 类 树 脂 在 水 溶 液 中 形

49、 成 羟 基 型 ， 商 品 一 般 为 氯 型 强 碱 性 阴 离 子 交 换 树 脂 在 酸 、 碱 和 有 机 溶 剂 中 较 稳定 ， 可 在 酸 性 、 碱 性 和 中 性 溶 液 中 进 行 阴 离 子 交 换 。 弱 碱 性 阴 离 子 交 换 树 脂 对 HO-离 子 的 亲 合 力 大 ， 故 只能 在 酸 性 介 质 中 与 阴 离 子 交 换 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 (二 )离 子 交 换 树 脂 的 特 性1 交 联 度 表 示 离 子 交 换 树 脂 中 交 联 剂 的 含 量 ， 通 常 以 重 量 百分 比 来 表 示 。 即 在 合 成 树

50、脂 时 ， 二 乙 烯 苯 在 原 料 中 所 占总 重 量 的 百 分 比 。 例 如 ， 上 海 树 脂 厂 生 产 的 聚 苯 乙 烯 型 强 酸 性 阳 离 子交 换 树 脂 ， 产 品 牌 号 为 732(强 酸 1 7)， 其 中 1 7表 示交 联 度 为 7%。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 2 交 换 容 量 是 指 每 克 干 树 脂 中 真 正 参 加 交 换 反 应 的 基 团数 。 常 用 单 位 为 mmol/g， 也 有 用 mmol/mL表 示 的 ，即 每 1毫 升 干 树 脂 中 真 正 参 加 交 换 反 应 的 基 团 数 。 对 于 离 子

51、交 换 色 谱 而 言 ， 交 换 容 量 是 一 个 重 要的 实 验 参 数 ， 它 表 示 离 子 交 换 树 脂 进 行 离 子 交 换 的能 力 大 小 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 3 溶 胀 树 脂 存 在 着 大 量 的 极 性 基 团 ， 具 有 很 强 的 吸 湿性 。 因 此 ， 当 将 树 脂 浸 入 水 中 后 ， 有 大 量 水 进 入 树脂 内 部 ， 引 起 树 脂 膨 胀 ， 此 现 象 称 为 溶 胀 。 溶 胀 的 程 度 取 决 于 交 联 度 的 高 低 ， 交 联 度 高 ，溶 胀 小 ； 反 之 ， 溶 胀 大 。 4 粒 度 离 子

52、 交 换 树 脂 的 颗 粒 大 小 ， 一 般 是 以 溶 胀 状 态所 能 通 过 的 筛 孔 来 表 示 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 n 二 、 离 子 交 换 平 衡 和 分 离 机 理 (一 )离 子 交 换 平 衡 离 子 交 换 反 应 可 用 下 式 表 示 ： 树 脂 的 离 子 交 换 反 应 是 可 逆 的 ， 完 全 符 合 化 学计 量 原 则 和 质 量 作 用 定 律 。 当 达 到 平 衡 时 ， 其 平 衡常 数 。 BAR ABR / BAR ARK BA 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 R-A+ R-B+ 分 别 表 示 在 树 脂

53、 相 中 A+、 B+的 离 子 浓 度 ， A+、 B+分 别 表 示 A+、 B+离 子 在 溶 液中 的 浓 度 。 KA/B为 常 数 ， 或 称 平 衡 常 数 。 KA/B是 树 脂 对 A+、B+两 种 离 子 的 相 对 选 择 性 系 数 亦 称 交 换 系 数 。 若 KA/B 1， 说 明 树 脂 对 B比 对 A有 更 大 的 亲 合力 ， 各 种 阴 阳 离 子 交 换 性 质 的 不 同 ， 可 由 离 子 水 合理 论 来 解 释 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 各 种 离 子 在 大 多 数 交 换 体 系 中 其 交 换 能 力 的 顺 序 基本

54、一 致 ， 根 据 已 有 的 研 究 成 果 ， 可 以 总 结 出 以 下 经 验 规律 ： 在 低 浓 度 水 溶 液 中 和 常 温 下 ， 阳 离 子 的 交 换 亲 和力 随 其 电 荷 的 升 高 而 增 大 。 常 温 下 ， 在 低 浓 度 水 溶 液 中 ， 等 价 阳 离 子 的 交 换亲 合 力 随 水 合 离 子 半 径 增 大 而 变 小 ， 随 其 裸 离 子 半 径 增大 而 变 大 。 阴 离 子 的 亲 合 力 受 阴 离 子 的 电 荷 数 ， 离 子 的 大小 ， 交 换 离 子 的 浓 度 ， 以 及 树 脂 的 性 质 所 影 响 。 第 三 节 离

55、 子 交 换 色 谱 法 在 高 浓 度 的 水 溶 液 中 和 常 温 下 ， 由 于 离 子 失 去 水 合 分子 ， 其 交 换 亲 和 力 的 差 异 可 能 变 小 或 顺 序 颠 倒 。 在 高 温 和 非 水 溶 液 中 ， 同 价 离 子 对 树 脂 的 亲 合 力 并 不随 其 离 子 半 径 增 大 而 增 大 ， 而 是 彼 此 相 似 ， 甚 至 变 小 。 H+离 子 和 OH 离 子 的 亲 合 力 随 树 脂 的 交 换 基 团 的 性 质不 同 而 有 很 大 的 差 异 ， 这 取 决 于 H+离 子 和 OH 离 子 与 交 换 基团 所 形 成 的 酸 和

56、 碱 的 强 度 ， 酸 碱 强 度 愈 大 ， 其 亲 合 力 愈 小 。 高 分 子 量 的 有 机 离 子 和 金 属 配 离 子 ， 对 树 脂 有 较 大 的亲 合 力 。 能 与 树 脂 的 交 换 基 团 生 成 配 合 物 或 难 溶 化 合 物 的 离 子都 对 树 脂 具 有 较 大 的 亲 合 力 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 (二 )分 离 机 理 1. 利 用 样 品 组 分 的 选 择 性 系 数 不 同 而 进 行 分 离 。 主 要 用 于 金 属 离 子 的 分 离 2. 利 用 各 组 分 离 解 度 的 差 别 而 进 行 分 离 3. 形

57、成 配 离 子 后 进 行 离 子 交 换 分 离 对 于 选 择 性 系 数 相 同 的 两 个 组 分 ， 如 A与 B， 可使 其 与 适 当 的 配 合 剂 形 成 络 离 子 ， 然 后 利 用 不 同 配离 子 与 离 子 交 换 树 脂 的 亲 合 力 不 同 而 进 行 分 离 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱 法 n 三 、 操 作 方 法 及 应 用 (一 )树 脂 的 处 理 和 再 生 阳 离 子 交 换 树 脂 一 般 在 使 用 前 将 其 转 变 为 氢 型 ， 阴离 子 交 换 树 脂 通 常 将 其 转 变 为 氯 型 或 羟 基 型 。 具 体 操 作

58、 ： 先 将 树 脂 浸 于 蒸 馏 水 中 使 其 溶 胀 ， 然 后 用 5 10%盐 酸 处 理 阳 离 子 交 换 树 脂 使 其 变 为 氢 型 ； 对 阴 离 子 交 换树 脂 用 10%NaOH或 10%NaCl溶 液 处 理 ， 使 其 变 为 羟 基型 或 氯 型 。 最 后 用 蒸 馏 水 洗 去 多 余 的 酸 或 碱 并 洗 至 中性 ， 即 可 使 用 。 (二 )装 柱 ： 把 已 处 理 好 的 树 脂 放 在 烧 杯 中 ， 加 水 充 分 搅 拌 ， 将气 泡 全 部 赶 掉 ， 放 置 几 分 钟 使 大 部 分 树 脂 沉 降 ， 倾 去 上面 泥 状 微

59、 粒 ， 反 复 上 述 操 作 到 上 层 液 透 明 为 止 。 先 在 色 谱 柱 底 部 放 一 些 玻 璃 丝 ， 用 玻 璃 棒 压 平 ， 再将 上 述 准 备 好 的 树 脂 加 少 量 水 搅 拌 后 倒 入 保 持 垂 直 的 色谱 柱 中 ， 使 树 脂 沉 降 ， 让 水 流 出 ， 注 意 不 要 让 气 泡 进 入树 脂 层 中 ， 并 且 在 操 作 过 程 中 还 要 注 意 把 液 面 保 持 在 树脂 层 的 上 面 ， 最 后 在 树 脂 层 上 面 盖 一 层 玻 璃 丝 ， 以 免 在加 样 时 树 脂 冲 起 。 第 三 节 离 子 交 换 色 谱

60、法 (三 )洗 脱 大 多 数 用 离 子 交 换 色 谱进 行 分 离 时 ， 都 是 在 水 溶 液中 进 行 的 。 有 时 也 加 入 少 量的 有 机 溶 剂 ， 如 甲 醇 、 乙 醇 、乙 腈 等 ， 也 可 用 弱 酸 弱 碱 和缓 冲 溶 液 。 第 四 节 尺 寸 排 阻 色 谱 法 尺 寸 排 阻 色 谱 法 又 称 为 凝 胶 色 谱 法 、 分 子 排 阻色 谱 法 、 凝 胶 过 滤 色 谱 法 、 分 子 筛 色 谱 法 和 凝 胶 渗透 色 谱 法 等 。 主 要 用 于 大 分 子 物 质 如 蛋 白 质 等 的 分 离 。 固 定 相 凝 胶 为 化 学 惰

61、 性 、 具 有 多 孔 网 状 结 构 的物 质 ， 凝 胶 的 每 个 颗 粒 的 结 构 ， 尤 如 一 个 筛 子 ， 小的 分 子 可 以 进 入 胶 粒 内 部 ， 而 大 的 分 子 则 排 阻 于 胶粒 之 外 ， 从 而 达 到 分 离 的 目 的 。 n 一 、 基 本 原 理 (一 )分 子 筛 效 应 根 据 溶 质 分 子 大 小 不 同 即 分 子 筛 效 应 而 进 行 分 离 大 分 子 的 流 程 短 ， 移 动 速 度 快 ， 先 流 出 色 谱 柱 ；小 分 子 的 流 程 长 ， 移 动 速 度 慢 ， 后 流 出 色 谱 柱 ；中 等 分 子 居 两

62、者 之 间 。 这 种 现 象 叫 分 子 筛 效 应 。 (二 )分 配 系 数 保 留 体 积 VR V0+KVi 如 果 溶 质 分 子 足 够 小 ， 能 自 由 进 出 凝 胶 颗 粒内 部 ， 而 且 对 凝 胶 的 内 水 和 外 水 亲 合 力 相 等 ， 此时 洗 脱 体 积 就 等 于 外 水 体 积 和 内 水 体 积 之 和 。 即VR V0+Vi， 则 K 1； 如 果 溶 质 分 子 足 够 大 ， 以 致 完 全 排 阻 于 凝 胶颗 粒 之 外 ， 此 时 洗 脱 体 积 就 等 于 外 水 体 积 。 即VR V0， 则 K 0。 在 通 常 的 工 作 范

63、围 内 ， 对 一 切 溶 质 来 说 ， K是 一 个 常 数 (0K1)。 第 四 节 尺 寸 排 阻 色 谱 法 分 子 排 阻 色 谱 的 洗 脱 顺 序 1.VR V0,完 全 不 能 进 凝 胶 颗 粒 内 部 的 物 质 2.不 同 程 度 进 入 凝 胶 颗 粒 内 部 的 物 质 3.V R V0+Vi， 能 自 由 进 出 颗 粒 内 部 的 物 质 4.VR V0+Vi， 具 有 特 殊 吸 附 作 用 的 物 质 第 四 节 尺 寸 排 阻 色 谱 法 n 二 、 凝 胶 的 分 类(一 )葡 聚 糖 凝 胶 葡 聚 糖 凝 胶 是 常 用 凝 胶 ， 由 葡聚 糖 和

64、 交 联 剂 甘 油 通 过 醚 桥( O CH2 CHOH CH2 O )相 互 交 联 而 形 成 的多 孔 性 网 状 结 构 O OHO OH OHCH2 O OHOH OH OHCH2 O OHOH OH OCH2 O OHOH OH OHCH2CHCH 2 CH2 OH O OOHOH CH2 O O OHOH OH OHCH2CH 2CHCH 2OH OH CH4 第 四 节 尺 寸 排 阻 色 谱 法 (二 )聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 与 N， N 亚 甲基 二 丙 烯 酰 胺 交 联 聚 合 而 成 。 CH2 CH CH

65、2 CH CH2 CHCNH 2 CNHCH2NH CCH CH CH2 CH2 CH2 CHC NH2 CNH2 O O O O O CNH2O 第 四 节 尺 寸 排 阻 色 谱 法 (三 )琼 脂 糖 凝 胶 (四 )聚 苯 乙 烯 凝 胶 亲 脂 性 凝 胶 ， 由 苯 乙 烯 和 二 乙 烯 苯 聚 合 而 成 (五 )葡 聚 糖 凝 胶 LH-20 亲 脂 性 凝 胶 (六 )无 机 凝 胶 有 多 孔 性 硅 胶 和 多 孔 性 玻 璃 第 四 节 尺 寸 排 阻 色 谱 法 n 三 、 操 作 方 法 及 应 用 (一 )凝 胶 的 选 择 分 子 排 阻 色 谱 法 对 所

66、用 凝 胶 有 下 列 基 本 要 求 ：化 学 性 质 惰 性 ， 不 与 溶 质 发 生 任 何 作 用 ， 可 以 反 复使 用 而 不 改 变 其 色 谱 性 质 ； 尽 可 能 不 带 电 荷 以 防 止发 生 离 子 交 换 作 用 ； 颗 粒 大 小 均 匀 ， 机 械 强 度 尽 可能 高 。 除 以 上 基 本 要 求 外 ， 可 根 据 分 离 对 象 和 分 离 要 求 选择 适 当 型 号 的 凝 胶 。 1. 组 别 分 离 即 从 小 分 子 物 质 (K 1)中 分 离 大 分 子 物 质 (K 0)或从 大 分 子 物 质 中 分 离 小 分 子 物 质 ， 即 对 于 分 配 系 数 有 显著 差 别 的 分 离 叫 组 别 分 离 。 2 分 级 分 离 当 被 分 离 物 质 之 间 分 子 量 比 较 接 近 时 ， 根 据 其 分 配系 数 的 分 布 和 凝 胶 的 工 作 范 围 ， 把 某 一 分 子 量 范 围 内 的组 分 分 离 开 来 ， 这 种 分 离 称 之 为 分 级 分 离 。 3. 亲 脂 性 有 机 化 合 物 的 分