一种鱼类DNA的非损伤检测方法

《一种鱼类DNA的非损伤检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种鱼类DNA的非损伤检测方法（9页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、一种鱼类DNA的非损伤检测方法宋君;王东;叶先林;雷绍荣;郭灵安【摘 要】为了减少和改变对濒危野生鱼类的大量伤害性取样,本文探索了从非损伤性取样的鱼类体表粘液样品中提取鱼类基因组DNA的方法，并用常用的两种分子 标记(Cyt b和D-Loop)检测了分离到的粘液DNA.结果表明,从非损伤性取样的鱼 类粘液样品中能够分离到高质量的鱼类基因组DNA,可用于后续的研究工作鱼类 体表粘液的非损伤性取样及其DNA提取，为濒危野生鱼类遗传学研究提供了一种 新的非损伤性DNA检测技术.期刊名称】四川动物年(卷),期】2013(032)006【总页数】5页(P853-856,861)【关键词】非损伤性取样;粘

2、液DNA;检测【作 者】 宋君;王东;叶先林;雷绍荣;郭灵安【作者单位】 四川大学生命科学学院,四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室, 成都610064;四川省农业科学院分析测试中心,成都610066;四川省农业科学院分 析测试中心,成都610066;四川省农业科学院分析测试中心,成都610066;四川省农 业科学院分析测试中心,成都610066;四川省农业科学院分析测试中心,成都610066【正文语种】 中 文【中图分类】Q9594Q78 濒危物种的研究长期以来受到样品来源的限制，通过采集诸如大量的珍稀濒危动物 血液、肌肉、肝脏、心脏、肾脏和脾脏等组织材料以提取足量的蛋白质和DNA , 显

3、然是不可取的。在生物研究中，常用的取样方法主要有3种，即伤害性取样 （destructive sampling）、非伤害性取样（non-destructive sampling）和非损伤性 取样（non-invasive sampling）（Morin&Woodruff, 1996）。非损伤性取样是在不 触及或伤害野生动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发或羽毛、粪便、尿液、食 物残渣、鹿角、鱼鳞和卵壳等不同形式的分析样品而进行遗传分析的一种取样方法 （刘丽等，2007）。早期研究中的鱼类等水生生物取样，主要采用伤害性取样方式 从鱼类的血液、肌肉、肝脏及肾脏等器官（组织）中提取DNA（薛良义，2

4、000冯洪 雨等，2005；夏颖哲等，2007）和非伤害性取样方式从鳞片中提取鱼类DNA（胡光 源等，2011）。伤害性取样对于濒危野生鱼类资源是一种严重的破坏，因此，探讨 鱼类尤其是濒危野生鱼类的非损伤性取样有着非常重要的现实意义。目前，从鱼类 体表粘液的非损伤性取样中提取DNA并用于后续分析的研究尚无报道。本文采用 非损伤性取样方法收集了鲫鱼Carassius auratus体表粘液和脱落鳞片，同时用无 伤害性取样方法采集了鲫鱼尾鳍作对照，从鲫鱼体表粘液、脱落鳞片和尾鳍中提取 DNA，并用 end point PCR（终点法 PCR）或 real time PCR（实时 PCR）对鲫鱼 C

5、yt b（细胞色素b）和D环控制区的部分DNA片段进行了分子检测，以期为鱼类遗传 学研究提供一种新的非损伤性DNA检测技术。1 材料和方法1.1 无损取样从市场上购买1尾鲜活鲫鱼Carassius auratus，质量约150 g，在实验室条件下 常规饲养备用。鲫鱼体表粘液的采集:用小型号的药匙轻轻从鲫鱼体表刮取少量粘液，转移到2 mL 的灭菌离心管中，粘液采集量约50pL。鳞片收集:收集养殖过程中，鲫鱼脱落的鳞片12片，用剪刀剪碎后转移到2 mL 的灭菌离心管中。尾鳍采集:剪取少许(约5 mg)尾鳍，剪碎后转移到2 mL的灭菌离心管中。1.2基因组DNA的提取及其质量检测根据Sambrook

6、等(1989)所描述的蛋白酶K-酚氯仿法提取尾鳍、鳞片的DNA。 采用微量样品基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Micro DNA Kit，天根生物技术 公司，北京)抽提鲫鱼体表粘液DNA，抽提方法参照试剂盒说明书并略作修改。首 先将收集到的粘液样品1800 g离心5 min，小心倒掉上清液;添加200pL缓冲液 GA重悬沉淀;向沉淀悬液中加入20pL蛋白酶K溶液(20 mg/mL),涡旋10 s混匀， 56C放置60 min，期间每15 min涡旋混匀3次;加入200pL缓冲液GB和1 pL Carrier RNA(1 pg/pL),充分颠倒混匀,70C放置10 min，期间每3 mi

7、n涡旋 10 s;加入200pL无水乙醇，充分混匀后将混合液直接加入到带收集管的吸附柱中， 13 000 g离心30 s，弃废液;向吸附柱中加入500pL缓冲液GD , 13 000 g离心 30 s，弃废液;向吸附柱中加入700pL漂洗液PW , 13 000 g离心 30 s，弃废液； 向吸附柱中加入500pL漂洗液PW , 13 000 g离心30 s，弃废液;将吸附柱中加 收集管13 000 g离心2 min，弃废液，将吸附柱常温下放置约5 min，晾干吸附 柱中残留的漂洗液;将吸附柱转移到干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加20 50pL洗脱缓冲液TB。室温放置25 min , 13

8、 000 g离心2 min，将溶液收集到 离心管中。为增加基因组DNA的得率，将离心得到的溶液再次加入到吸附柱中， 室温放置2 min , 13 000 g离心2 min，收集管中收集到的溶液即为鲫鱼体表粘 液DNA溶液。用超微量紫外分光光度计(Nanodrop1000, Thermo)检测DNA溶液的 A260/A280比值、A260/A230比值及其在260 nm处的紫外线吸收峰;然后用水 平电泳分离提取的DNA，观察DNA的完整性。1.3 Cyt b和D-Loop部分片段的检测为了检验非损伤性取样分离到的DNA能否用于鱼类遗传学研究，分别采用鱼类群 体遗传学中常用的两种分子标记Cyt b

9、（细胞色素b）和D-Loop（线粒体D环控制区） 对提取的DNA进行检测。扩增Cyt b片段（475 bp）的上、下游引物分别为5- GACTTGAAAAACCACCGTTG-3和 5-CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC-3（农业 部953号公告，2007）25pL扩增反应体系中分别加入10xPCR缓冲液18.3 pL, 10 mM 的 dNTPs 1 pL,25 pM 的上、下游引物各 1 pL,5 U/pL 的 Taq 酶 0.2 pL,模板DNA约50 ng，然后补充灭菌水至25pL。Cyt b片段扩增反应程序为 94工变性3 min，然后进行35次循环扩增反应（93工变性30

10、 s ,58工退火30 s , 72工延伸40 s），最后72工延伸5 min。采用引物 5-ACCCCTGCGTCCCAAAGC-3和 5-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3（刘 焕章，2002）扩增鲫鱼线粒体D-Loop 1000 bp的片段。在扩增D-Loop片段的 25pL PCR反应体系中加入模板DNA约50 ng ,2xPCR Mastermix（天根生物技 术公司，北京）12.5pL,10pM的上、下引物各1pL,然后补充灭菌水至25pL。扩增反应条件为95C预变性5 min , 35个循环反应（94C30 s,55C30 s;72C30 s），最后72C延伸7 min。根

11、据岩原鲤 Procypris rabaudi 线粒体 D-Loop 序列（GenBank , HQ199642）, 设计引物 5-CCTGTTATCCTTGTCAAACCC-3 , 5-TGGGATGCAA- TTTATACCTCAA-3 和探针 FAM-5-CGTTCTTGAGT-CCTCCTTGGTTTCG-3- TAMRA ,采用real time PCR检测尾鳍、鳞片和粘液DNA的D-Loop片段。在 扩增D-Loop片段的20pL实时PCR反应体系中加入模板DNA 100 ng ,2 x qPCRmix（THUNDERBIRDTM Probe qPCR Mix，东洋纺）10 pL,1

12、0 pM 的上、 下引物各 1 pL,10 pM 的探针0.5pL,50xROX reference dye 0.4 pL,然后补 充灭菌水至20pL。扩增反应条件为95C预变性10 min , 40个循环反应(95C 60 s ,60C 60 s)。2 结果与分析2.1尾鳍、鳞片及粘液DNA的质量用超微量紫外分光光度计对尾鳍、鳞片及粘液DNA进行检测，能够清楚观察到在 260 nm波长的紫外线照射下，尾鳍、鳞片及粘液DNA溶液均有强烈的吸收峰(图 1)。尾鳍、鳞片及粘液DNA溶液的A260/A280比值分别为2.11、2.05和2.12;尾鳍、鳞片及粘液DNA溶液的A260/A230比值分别

13、为2.26、4.5和2.17。电泳 结果显示，粘液DNA的片段大小与采用经典的蛋白酶K-酚氯仿法提取的尾鳍和 鳞片DNA片段大小基本一致(图2)，都远远大于2000 bp , 3种不同组织(器官)的 DNA都有清晰的主带(DNA大片段)。鲫鱼3种不同组织(器官)DNA的 A260/A280 比值(1.8 2.0)、A260/A230 比值( 2.0)以及 DNA 电泳结果，表明 在非损伤性方法采集到的鱼类体表粘液中能够分离到纯度较高、分子量较大的 DNA。图1尾鳍(A)、鳞片(B)及粘液(C)DNA在波长为260 nm紫外线照射下的吸收峰 Fig.1 Absorption peak of ul

14、tra violet(260 nm)of DNA isolated from caudal fin(A)，scales(B)and mucus(C)图2尾鳍、鳞片及粘液DNA电泳结果M为分子量(Marker);泳道1、2为尾鳍 DNA;泳道 3、4 为鳞片 DNA;泳道 5、6 为粘液 DNAFig.2 Electrophoresis result of DNA extracted from caudal fin，scales and mucus sampled from crucianM represented molecular marker;Lane 1 and 2 showed the

15、 DNA isolated from caudal fin;Lane 3 and 4 indicated the DNA extracted from scales;Lane 5 and 6 showed the DNA isolated from mucus2.2 Cyt b和D-Loop分子标记检测为了验证获得的鲫鱼体表粘液DNA是否为鱼类DNA以及能否用于后续的研究， 本实验用分离到的鲫鱼体表粘液DNA为模板，扩增了鱼类Cyt b基因中的部分片 段。实验结果显示，与用尾鳍、鳞片DNA为模板的扩增结果一样，从粘液DNA 中也同样扩增出预期的475 bp大小的Cyt b片段(图3)，且在Cy

16、t b基因片段的 扩增实验中，空白对照无扩增，显示扩增实验无污染，反应体系工作正常。因此， 该实验表明通过非损伤性方法采集的鱼类体表粘液样品中分离到的DNA中含有鱼 类基因组DNA，能够用于后续分析。图3尾鳍、鳞片及粘液DNA的Cyt b分子标记检测结果M为分子量标准 (Marker);泳道1为扩增实验的空白对照;泳道2、3是以尾鳍DNA为模板的扩增 结果;泳道4、5是以鳞片DNA为模板的扩增结果;泳道6、7是以粘液DNA为模 板的扩增结果 Fig.3 Ampl ified fragments of Cyt b using the DNA extracted from caudal fin，s

17、cales and mucus as template DNA in PCRM represented molecular marker;Lane 1 showed the amplified result of blank control in this experiment;Lane 2 and 3 indicated the amplified result using the template DNA of caudal fin;Lane 4 and 5 showed the amplified result using the template DNA of scales;Lane

18、6 and 7 indicated the amplified result using the template DNA of mucus图4尾鳍、鳞片及粘液DNA的D-Loop分子标记检测结果M为分子量标准 (Marker);泳道1为扩增实验的空白对照;泳道2、3是以尾鳍DNA为模板的扩增 结果;泳道4、5是以鳞片DNA为模板的扩增结果;泳道6、7是以粘液DNA为模 板的扩增结果 Fig.4 Ampl ified fragments of D-Loop using the DNA extractedfrom caudal fin，scales and mucus as template D

19、NA in PCRM represented molecular marker;Lane 1 showed the amplified result of blank control in this experiment;Lane 2 and 3 indicated the amplified result using the template DNA of caudal fin;Lane 4 and 5 showed the amplified result using the template DNA of scales;Lane 6 and 7 indicated the amplifi

20、ed result using the template DNA of mucus采用一对特异扩增鱼类线粒体D-Loop 1000 bp片段的引物(刘焕章，2002)，以 粘液DNA为模板进一步扩增鲫鱼线粒体D-Loop片段。以粘液DNA为模板的扩 增结果与以尾鳍、鳞片DNA为模板的扩增结果一样，都扩增出预期1000 bp的 D-Loop片段(图4)，而且以3种不同组织(器官)的DNA为模板的扩增条带亮度 (扩增终产物的量)均较亮，显示粘液DNA与尾鳍、鳞片DNA的扩增效率较高， 说明无损取样获得的粘液DNA能用于鱼类D-Loop片段遗传多样性分析。图5尾鳍(A)鳞片(B)及粘液(C)DNA

21、D-Loop片段的real time PCR结果Fig.5 Amplified results of D-Loop using caudal fin(A) ， scales(B)and mucus(C)DNA as template DNA in the real time PCR以鲫鱼3种不同组织(器官)的DNA为模板，采用real time PCR检测D-Loop片 段。实验结果显示，根据岩原鲤D-Loop序列设计的特异探针都能与从尾鳍、鳞 片和粘液中获得的DNA杂交，并且分别在17.24、18.42、17.17个循环(cycles of threshold)时收集到高于背景噪声的D-Lo

22、op片段扩增信号，说明从鱼类体表 粘液中分离到的DNA浓度与从尾鳍、鳞片中获得的DNA浓度相差不大(Ct值反 映体系中的模板量)。3 讨论 通过伤害性取样方式如捕捉、损伤，甚至杀死生物个体等方式，采集大量的、满足 统计学要求数量的样本，对有限的野生鱼类资源尤其是濒危野生鱼类资源是极大的 破坏，不利于濒危鱼类的保护。本文探索了一种新的非损伤性采样方式，从鱼类体 表粘液中提取鱼类基因组DNA的方法，同时采用鱼类群体遗传学中应用较广泛的 细胞色素b(Cyt b)和线粒体D环控制区两种分子标记检测了分离到的粘液DNA， 成功地从粘液DNA中扩增出与对照样品DNA（尾鳍、鳞片DNA）片段大小一致的 Cy

23、t b和D-Loop片段，说明从鱼类体表粘液中提取的DNA用于鱼类遗传学研究 是可行的。收集鱼类体表粘液、脱落的鳞片，对鱼类生长不造成伤害和损伤，这种取样方式是 一种非损伤性取样;直接从鱼类身体上采集少量的鳞片、剪取少量的鳍条对鱼类生 长不造成严重的伤害，这种方式是非伤害性取样。体表粘液、鳞片和鳍条，这3 种不同组织（器官）相比较而言，鳍条是鱼类运动的重要器官，而鳞片对鱼类体表有 保护作用，因此这两种组织（器官）的取样对鱼类的生存会有一定的影响。虽然鱼类 体表的粘液在鱼类运动中起着减小对水的摩擦等作用，但是鱼类会随着不同环境和 条件自动调节粘液的分泌量（刘德明，2011），因此采集少量的粘液提

24、取鱼类基因 组DNA，对鱼类是一种安全的非损伤性取样。实时PCR中的探针能与鲫鱼体表粘 液中分离到的DNA杂交并能扩增出D-Loop片段，表明从鱼类体表粘液中分离到 鱼类基因组DNA是可行和可信的。鱼类基因组DNA的提取方法主要有经典的酚氯仿法、甲酰胺法、缠绕DNA以及 普通试剂盒法（张亚平， 1996;刘臻等， 2004;夏红军等， 2004）等，这些方法主要 用于肌肉、肝脏、肾脏、血液和鳍条等组织（器官）中的DNA分离与纯化，对样品 保存要求较高（如低温、组织未腐烂腐等），存在样品用量较大，实验中的有机物 （苯酚、乙醇）残留相对较多，耗时费力等问题。由于鱼类体表粘液中的DNA含量 相对于肌

25、肉、肝脏和肾脏等器官DNA的含量较少，而且考虑到对野生鱼类资源的 保护，因此在非损伤性取样中也应尽量收集少量的粘液。对样品量少、DNA含量 低的粘液，我们选择了微量样品基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Micro DNA Kit）来抽提粘液DNA。与酚氯仿等传统方法相比，微量样品基因组DNA提取试剂 盒在优化的pH值条件下，采用carrier RNA、离心柱（硅胶薄膜）快速、有效地吸 附DNA，大大提高了 DNA分离效率，同时由于没有采用有机试剂来分离、纯化 及沉淀DNA，所以获得的DNA溶液中有机物等PCR抑制剂含量更低，在后续的 PCR分析中能更高效地扩增基因片段。参考文献胡光源，石

26、振广，张忠亮，等.2011.达氏鳇总DNA提取初探J.黑龙江水产，2:26-28刘德明. 2011 .鱼类体表粘液流变行为的研究 D .浙江大学硕士学位论文.刘焕章.2002 .鱼类线粒体DNA控制区的结构和进化:以鳑鮍鱼类为例J 自 然科学进展，12(3):266-270.刘丽，刘楚吾，张明辉，等.2007 不同保存条件下鱼类组织基因组DNA的提 取效果分析J.广东海洋大学学报，27(6):18-21 .刘臻，鲁双庆，肖调义，等.2004 .鲫鱼基因组DNA提取方法的探J 水利 渔业，24(6):20.马洪雨，姜运良，岳永生.2005 种从鱼类肌肉组织中提取基因组DNA的简易方法J.生物技术

27、通讯，16(5):531-532 农业部953号公告-5-2007 2012 转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法S.北京:中国农业出版社.夏红军，郑劲松，王丁. 2004 鲸类微卫星引物对长江江豚的适用性研究J.水生生物学报，28(6):640 夏颖哲，张春光，陈宜瑜，等.2007 福尔马林保存鱼类标本中大片段DNA的 提取J.水生生物学报，31(4):485-491 薛良义.2000 种鱼类DNA的简便提取方法J.水利渔业，20(6):5-8 张亚平.1996 .非损伤性方法的建立及其在亚洲黑熊分子遗传学研究中的应用J 动物学研究，17(3):253-258 M

28、orin DS , Woodruff 1996 Noninvasive genotyping for vertebrate conservationM/Smith TB，RK Wayne（ed）Molecular Genetics Approaches in ConservationOxford:Oxford University Press:298-313 Sambrook T，Fritsch EF，Maniatis T1989Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd editionMNew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor