实验一凝集反应

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1、医学免疫学实验讲义实验一 凝集反应在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称 为凝集反应(agglutination reaction)。凝集反应是一种定性的检测方法，即根据凝集现象的出现 与否判定结果阳性或阴性；也可以进行半定量检测，即将标本作一系列倍比稀释后进行反应， 出现阳性反应的最高稀释度作为滴度(或效价)来判断结果的强弱。凝集反应可分为直接凝集 反应和间接凝集反应。由于凝集反应方法简便，目前在临床检验中仍被广泛应用。一、直接凝集反应细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直 接凝集反应(direct agglut

2、ination reaction)o凝集反应中的抗原又称为凝集原(agglutinogen)，抗 体称为凝集素(agglutinin)。常用的直接凝集试验有玻片法和试管法两种。(一) 玻片凝集试验ABO血型鉴定【原理】玻片凝集试验为定性试验，一般用已知抗体作为诊断血清，与受检颗粒性抗原如菌液或红 细胞，各加一滴在玻片上，混匀，数分钟后即可用肉眼观察凝集结果，出现凝集颗粒的为阳性 此法简便，快速，适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型，也可用于红细胞ABO血 型的鉴定。【材料】1. 标准血清(抗体)：抗 A 分型试剂和抗 B 分型试剂各1 支。2. 盛有1ml生理盐水的一次性试管1支。3.

3、 一次性采血针 1 枚、白瓷板或玻片 1 块、一次性毛细吸管 1 支、75%酒精棉球和灭菌 干棉球。【方法】1. 用酒精棉球消毒被检者的耳垂或手指尖端，以采血针刺破皮肤，稍加挤压，使血液流出，滴12滴血液于含有生理盐水的试管内，摇匀，使成为血球悬液。用灭菌干棉球止血。2. 取白瓷板1块，将抗A、抗B分型试剂分别滴加1滴于白瓷板的两个圆孔内。3. 用毛细吸管吸取血球悬液，在白瓷板的两个圆孔内各加1 滴。4. 将白瓷板前后左右不停地摇动，使其充分混匀，510min后观察血球有无凝集发生。如 有凝集，可见红细胞凝集成块；无凝集，红细胞呈均匀分散(图 1)。5. 记录受检者红细胞凝集情况，根据ABO血

4、型鉴定表，判断受检者的血型。表 1-1 A B O 血型鉴定表抗A分型试剂抗B分型试剂血型+ABABO红细胞不凝集红细胞凝集图1红细胞凝集判断示意图【注意事项】1. 采血前应对采血部位进行消毒。2. 采血针必须一人一针，禁止混用，严防交叉感染。3. 本法也可将血液直接滴在白瓷板或玻片上，而不必用生理盐水稀释，其结果不变。（二）试管凝集试验【原理】试管凝集试验是一种半定量的试验方法，常用于血清中抗体的测定，其浓度常以效价表示。 即将待检血清在试管内作一系列倍比稀释，然后加入相应的颗粒性抗原，使其在试管内发生直 接凝集，以出现明显凝集（+）的血清最高稀释度为其效价（亦称为滴度）临床上常用的试管 凝

5、集试验有：肥达试验（Widal test）和外斐试验（Weil-Felix test）。【材料】1. 诊断血清：1 ： 10稀释的伤寒杆菌“O”及“H”诊断血清。2. 抗原：伤寒杆菌“O”菌液（菌体抗原），伤寒杆菌“H”菌液（鞭毛抗原）。3. 生理盐水、小试管、吸管、试管架、水浴箱等。【方法】1. 取清洁小试管16支，分两排列于试管架上，每排8支，依次编号，每管内加生理盐水 0.5 ml。2. 用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”诊断血清0.5ml加入第一排的第1管内，于管内上 下吹吸3次，使血清与生理盐水充分混匀，吸出0.5ml加于第2管，同法混匀，吸取0.5ml加于 第3管，依次稀释至第7管

6、，从第7管吸出0.5ml弃去。第8管为生理盐水对照。稀释方法如 图2所示。图2血清倍比稀释法3. 同法稀释第2排的伤寒杆菌“H”诊断血清。4. 用1ml洁净吸管吸取伤寒杆菌“O”菌液，从第1排的第8管起依次向前在各管内加入0.5ml （表 1-2）。5.另取1支lml吸管，同法于第2排各管中加入伤寒杆菌“H”菌液0.5ml。6. 将各试管振汤混匀，放入37 C水浴箱中24小时，初步观察结果后，置4 C冰箱过夜,表1-2试管凝集试验加样程序单0. 50. 5J. 50. 50.5伤寒杆菌菌液0. 50. 50. 5血清稀释度 1 ： 4C 1 ： 801 ： 1601 ： 3201 : E401

7、 : 12801 : 25E0 对照37C水浴箱中24小时，4C冰箱过夜次日再行观察。结果【结果】先观察第8管对照(图3),管底沉淀物呈圆形，边缘整齐，轻轻振摇细菌分散呈均匀浑浊， 此为阴性。然后从第1管起，逐管观察，如有凝集，可见管底有凝集块，边缘不整齐，液体澄 清。“O”菌液的凝集呈致密颗粒状，不易摇散，“H”菌液的凝集呈疏松棉絮状，易摇散。凝集强度的判断以“+”号表示如下：“+”：很强，细菌全部凝集，液体澄清，管底有大片凝集物。“+”：强，细菌大部分凝集，管底的凝集物较小，液体微混。“+”：中等强度，细菌部分凝集，管底凝集物细小，但仍明显可见，液体半澄清。“ + ” ：弱，细菌仅少部分凝

8、集，液体混浊。“-”：不凝集，液体混浊与对照管相似。不凝集凝集以产生明显凝集(+)的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。凝集摇动后 的现象图3试管凝集结果示意图【注意事项】1. 加抗原时必须先从对照开始，然后从低浓度血清稀释度到高浓度血清稀释度依次加入。2. “H”菌液的凝集很疏松，极易摇散，判断结果时应避免剧烈振动，以免影响结果。注：效价是指机体对抗原产生免疫应答时，其血清中含有特异性抗体的浓度，常以出现阳性反应的血清最 高稀释度为效价(滴度)。二、间接凝集反应将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面(这种载体与免疫无关)，然后与 相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下,出现特异性

9、凝集现象，称为间接凝集反应(indirect agglutination)或被动凝集反应(passive agglutination)。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应，因此被广泛用于临床检验。其中将抗体吸附于载体表面检测 抗原的间接凝集反应称为反向间接凝集反应。根据载体的不同可将间接凝集反应分为：间接血 球凝集试验、间接乳胶凝集试验（及间接乳胶凝集抑制试验）和金黄色葡萄球菌协同凝集试验。（一）间接血球凝集试验血清类风湿因子测定【原理】以红细胞为载体，将人丙种球蛋白（可溶性抗原）吸附在载体表面而成为致敏红细胞，然 后用此致敏红细胞检测类风湿性关节炎患者血清中的类风

10、湿因子（抗变性IgG抗体），当患者血 清中含有类风湿因子时红细胞发生凝集。此方法常用于检测血清中的抗体，辅助诊断疾病。【材料】1. 致敏红细胞悬液。2. 1 : 10待检血清、阳性对照血清、稀释液。3. V型微量反应板、微量移液器、微量振荡器、37C恒温箱、移液头。【方法】1. 用微量移液器吸取稀释液加于微量反应板的19孔内，每孔50卩1，第10孔加50卩1阳 性对照血清。2. 第1孔内加待检血清50卩1，混匀后吸出50卩1加于第2孔内，依次作倍比稀释至第8 孔, 并从第8孔中吸出50卩1弃去。各孔的血清稀释度为1:20、1:40、1:80。第9孔为阴性对照， 第10孔为阳性对照。3. 将致敏

11、红细胞悬液混匀，从第9孔起依次向前各孔内加入50卩1致敏红细胞悬液。4. 第10孔阳性对照加50卩1致敏红细胞悬液。将反应板置于微量振荡器上，振荡lmin, 37C 静置30min后观察结果。【结果】先观察第9孔阴性对照孔中的红细胞应紧密集中于孔中央，成为一红点（图4）；第10孔 阳性对照孔中的红细胞应凝集并均匀地铺于孔的四周，孔中央无红细胞沉积的红点。然后根据 孔中红细胞凝集现象及其强弱程度，分别以“+”表示如下：“+” 一一红细胞凝集铺于孔的四周，有时因凝集过于强烈，会出现周边的凝集向孔心 滑动的现象，此时应注意不要误判为阴性（阴性：红细胞紧密集中于孔底，边缘整齐光滑）。“+” 一一部分红

12、细胞凝集，均匀铺于孔四周，孔中央可见疏松的红点。“+”红细胞沉积为环形，直径比对照的大，环四周有凝集现象。“-”一一红细胞紧密集中于孔底，边缘整齐光滑。以“+ ”的血清最高稀释度作为试验效价，凝集效价 1:40判定为阳性。红细胞不凝集红细胞凝集图4红细胞凝集判断示意图【注意事项】1. 在进行多样本血清稀释时，极易发生操作失误，因此，操作要仔细。2. 加致敏红细胞悬液应从第9孔为阴性对照开始依次从低浓度向高浓度进行。3. 观察结果时应轻拿V型反应板，避免已凝集的红细胞从孔壁滑落，造成凝集效价下降 或出现假阴性结果。(二)金黄色葡萄球菌协同凝集试验【原理】金黄色葡萄球菌细胞壁含有一种蛋白质，称为金

13、葡菌A蛋白(staphylococcus protein A, SPA)。SPA具有与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性。利用SPA 这一特性，将已知的特异性抗体吸附于金葡菌上，与相应抗原发生的凝集反应即为协同凝集试 验(coagglutination)。此方法常用于未知抗原的检测。【材料】1. 抗A群脑膜炎球菌抗体致敏的金葡菌液、未致敏的金葡菌液、生理盐水。2. 毛细吸管、有格玻片。【方法】1. 在玻片的第1、2格分别加1滴致敏金葡菌液，第3格加未致敏金葡菌液。2. 于第1、3格各加1滴病人脑脊液，第2格加1滴生理盐水，将玻片轻轻摇动35min, 观察结果。【结果

14、】第1格内细菌形成白色凝集，表明病人脑脊液中A群脑膜炎球菌阳性；第2格为致敏金葡 菌液对照，细菌不凝集；第3格为未致敏金葡菌液对照，细菌也不出现凝集(图6)。第1格第2格第3格金葡菌凝集金葡菌不凝集金葡菌不凝集图6协同凝集试验结果示意图【注意事项】1. 在操作过程中要不断地摇动玻片，同时注意避免相互之间混合。2. 气温较低的环境，应适当延长结果判断的时间，或提高实验环境的温度。3. 当凝集不明显，或结果判断困难时，可将玻片置于显微镜下观察，判断细菌是否有凝 集现象。实验二 沉淀反应可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合，当二者比例合适、并有适量电 解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或

15、沉淀线，称为沉淀反应precipitation）。参与沉淀反应的 抗原称为沉淀原、抗体称为沉淀素。由于参与反应的抗原为可溶性，分子小，单位体积内所含 的抗原量多，与抗体结合的总面积大，因此，在实验中常常稀释抗原以保持抗原与抗体合适的 比例，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。沉淀反应是免疫实验中最常用、最基本的方法之一。它的种类较多，可分为琼脂扩散试验 免疫电泳试验、环状沉淀试验及絮状沉淀试验等。一、琼脂扩散试验利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散，当二者比例合适时，就出现白色沉 淀线，此方法称为琼脂扩散试验。本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。琼脂扩散试验可分为单向

16、琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。扩散与电泳结合又有多种方 法，如对流免疫电泳、火箭电泳及交叉免疫电泳等。（一）单向琼脂扩散试验【原理】单向琼脂扩散试验（single agar diffusion）是一种定量试验。将一定量的抗体与琼脂混合， 倾注于玻璃板上，凝固后，在琼脂层中打孔，再将抗原加入孔中。孔中抗原向四周扩散（分子 量20万的物质，在琼脂中扩散犹如在液体中自由运动），在抗原与抗体的比例合适处，呈现白 色沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线， 则未知标本中的抗原含量可从标准曲线中求出。本试验主要用于检测标本中各种Ig和血清中各 种补体成分的含量，

17、灵敏度较高。【材料】1. 3 %琼脂（用O.Olmol pH7.4磷酸盐缓冲液配制）。2. 抗血清：羊抗人IgG诊断血清（单向扩散效价1 ： 80）。3. 标准抗原：冻干正常人混合血清。4. 待检标本：人血清。5. 0.01mol pH7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）。6. 单向扩散专用小塑料板、微量移液器、打孔器（3mm）和水浴箱等。【方法】1将3 %琼脂加热溶解后，保温于56C水浴中。2用PBS将羊抗人IgG诊断血清作1:40稀释，保温于56C水浴中。当抗血清和琼脂均为 56 C时，二者等量混匀，此时抗血清的浓度为1:80，琼脂浓度为1.5%。3将含有抗血清的琼脂浇板，每块板4ml,待其冷却

18、凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔， 空间距为1.21.5cm,挑出孔内琼脂。4稀释标准抗原 每支冻干标准血清加入蒸馏水0.51.0ml,待完全溶解后，根据IgG含量 用PBS稀释成几种稀释度，使其IgG含量分别为每毫升50，100，200, 400，800yg等。5加样 用微量移液器吸取10山各种稀释度的标准抗原，准确地加入琼脂板的孔中，一种 稀释度加2个孔，用以制作标准曲线。测待检标本时，先将被检血清用PBS作1:40稀释，然后 每孔加10卩1，每份标本加2孔。6加好样品的琼脂板放于湿盒内，经37C24小时后取出，测量各孔沉淀环直径（图7）。7以各种稀释度标准抗原的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中

19、IgG含量为横坐标，在计算机 或半对数坐标纸上画出标准曲线。根据待检血清沉淀环的直径，查标准曲线，将查得的IgG含 量乘以标本的稀释倍数（40）,即为血清中IgG含量。（图8）。【注意事项】1琼脂和抗体保温温度不宜太高，抗体保温时间也不应太长，否则对抗体的活性有影响。2溶解IgG标准抗原时，其蒸馏水的具体用量应按试剂盒说明进行取量。3加标准抗原和待检标本时应力求准确，否则实验结果有偏差。4. 琼脂经37C24小时，可能会生长细菌，为避免此现象的产生，可加入终浓度为0.02%的 叠氮钠。沉淀环塑料板琼脂孔图7单向琼脂扩散试验示意图图8单向琼脂扩散试验标准曲线（二）双向琼脂扩散试验【原理】双向扩散

20、（double diffusion）是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板相对应的孔中，两者 各自向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀线。若同时含有 若干对抗原抗体系统，因其扩散速度不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。观察沉淀线的位置、 形状等可对抗原或抗体作出定性分析。本试验常用于检测抗原抗体的纯度，滴定抗体的效价以 及用已知抗原（抗体）检测和分析未知抗体（抗原）。临床上用此法检测患者血清中的甲胎球 蛋白（AFP）,作为原发性肝癌的重要诊断指标。双扩试验所需时间较长Q4小时），灵敏度不【材料】1.抗体，抗AFP；抗原，AFP。2. 待检血清。3. 1%琼脂（生理盐水配制，

21、内含1:1000叠氮钠）。4. 载玻片、吸管、吸球、打孔器、微量移液器、湿盒及37C孵箱等。【方法】1. 将琼脂加热溶化，待冷却至5060C时，用吸管吸取4ml缓缓加在载玻片上（勿使溢出 玻片边缘，并避免产生气泡）。2. 待琼脂冷却凝固后，用打孔器按图9打孔（打7孔或3孔均可，孔间距为6mm），并将 孔中琼脂挑出。3. 用微量移液器向中央孔（三角孔随意一孔）内加入10山抗AFP抗体，上下孔加AFP抗 原作阳性对照，其余孔加10卩l待检血清，防止液体外溢。4. 将琼脂板放在湿盒内，置37C孵箱中24小时后观察结果。图9双扩散法琼脂孔的大小及距离示意图【结果】若待检血清标本产生沉淀线，并与阳性对照

22、所产生的沉淀线吻接成一线，则表示AFP阳性。 如无沉淀线则表示AFP阴性（图10）双扩时，在抗原和抗体的对应孔和临近孔之间，由于加入的抗原和抗体的成分不同，沉淀 线的位置、数目与特征也有差异，这些都有助于分析抗原或抗体的成分，沉淀线一般有以下几 种情况：1. 抗原与抗体的浓度相等，沉淀线在两孔之间呈直线（图10A）；若抗体浓度比抗原低， 则沉淀线靠近抗体一方（图10B）；反之，如抗原浓度比抗体低，则沉淀线靠近抗原一方（图 10C）o2. 在三角形排列孔中，若两抗原孔内的抗原相同，与同一相应抗体反应，两条沉淀线顶端 相联（图10D）；若两抗原孔内抗原不同，与两种相应抗体反应，两条沉淀线相交（图1

23、0E）； 若一抗原孔的抗原与另一孔中除有相同成分外又有不同成分，抗体孔内有各相应的抗体，则形 成的沉淀线相切（图10F）抗原：亢伸图10双向琼脂扩散试验沉淀线类型【注意事项】1扩散时间要适当。时间过短，沉淀线线不能出现；时间过长，会使已形成的沉淀线解离 或散开而出现假阴性。2加抗原抗体的移液头不能混用。3. 为避免琼脂中生长细菌，可加入终浓度为0.02%的叠氮钠防腐。（三）对流免疫电泳试验【原理】带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。蛋白质抗原在pH8.6 的碱性缓冲液中，由于羧基解离而带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。抗体属球蛋白，所 暴露的极性基团较少，在碱性缓冲

24、液中羧基解离也少，只带微弱的负电荷，而且其分子量较大， 电泳力较小，在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动，这样就使抗原和抗体定向对流，在 两孔间相遇时发生反应，并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。这种将双向琼脂扩散和 电泳技术结合在一起的方法称为对流免疫电泳（counter immuno-electrophoresis）。由于抗原、抗 体在电场中定向移动，限制了抗原抗体的多向自由扩散，加快了抗原抗体的移动速度，因而提 高了试验的敏感度，同时也缩短了试验时间，故可用于快速诊断。【材料】1. 电泳缓冲液：pH8.6巴比妥一盐酸缓冲液。2. 抗体：抗AFP。3. 抗原：AFP阳性血清、待检病人

25、血清。4. 1%琼脂：用pH8.6巴比妥一盐酸缓冲液配置，冰箱保存备用。5. 电泳仪、电泳槽、载玻片、打孔器、10ml吸管、移液器、移液头等。【方法】1. 制板 加热溶化1.5%琼脂，待冷却至5060C时，用10ml吸管吸取4ml加于载玻片上。2. 打孔在凝固后的琼脂板上，用打孔器打两排孔，孔间距为4mm。3. 加样 将琼脂板上有标记孔的作为阴极，然后按图11所示加满各孔。4. 电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上，抗原侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端。琼脂 板两端用纱布与缓冲液相连，接通电源，控制电压610V/cm板长（两端电压约50V），电泳时 间约3060min。5. 关闭电源，取出琼脂板，观

26、察结果。【结果】将玻片对着强光源，先观察AFP阳性血清孔与抗体孔之间的白色沉淀线，然后再观察待检 血清孔与抗体孔之间是否也有沉淀线出现，如有沉淀线，则表示AFP试验阳性，反之则AFP 试验为阴性。标记孔作负极沉淀线：抗AFP；盘：AFP阳性血清；營：待检病人血清【注意事项】1. 电泳时电流不宜过大，以免蛋白变性。2. 抗原和抗体的电极方向不能搞错。3. 抗原和抗体的浓度要适当，抗原太浓或太稀都不易出现沉淀线。4. 电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。5. 琼脂的质量要好（选用进口或者进口分装），否则不易出现结果，也可选用琼脂糖。6琼脂的浓度不宜太高（1%2%）,应以容易挑出孔内

27、琼脂为宜。注：带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动，称为电泳。其在电场中移动的方向及速度，取决于带 电质点本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静 电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，这种现象称为电渗作用，水向负极移动所产生的力称为电渗力。 因此，电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动 得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的Y球蛋白就是 如此。实验三 补体参与的免疫反应补体

28、是存在于哺乳动物血清中的一组糖蛋白，约占血清总蛋白含量的3%5%。正常情况下， 循环中的补体成分均以非活化的前体形式存在，可通过传统途径或旁路途径而激活。补体的作 用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。在激活过程中分解的产物有杀菌、溶菌、 灭活病毒、破坏细胞以及促进吞噬、促进血液凝固等作用，是整个机体免疫功能的重要组成部 分。各种动物血清中，补体的含量以豚鼠为最高，成分较全，效价稳定，采取方便，因而常将 豚鼠的全血清作为补体来使用。补体不耐热，56C 30min就可使其失去活性，这一过程称为“灭 能”或“灭活”。（一） 溶血反应【原理】 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家

29、兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，在有电解质存在时可发生凝集现象，若同时有补体存在，则补体 被激活，红细胞被破坏溶解，这种现象称为溶血反应（hemolytic reaction）。通常溶血反应用来 作为补体结合反应中的指示系统。【材料】1. 2%绵羊红细胞、溶血素、补体（豚鼠血清）、生理盐水。2. 小试管、吸管、滴管。【方法】 1.取小试管 3 支，按表 31 加入各物。表 31 溶血反应加样程序 1单位：ml管号1232% 红细胞0.50.50.5溶血素（ 2u）0.50.5补 体（ 2u）0.50.5生理盐水0.51.01.02. 将上述3支试管放置于37C水浴中

30、1530min,观察有无溶血现象，若红细胞溶解，则由 红色的细胞混浊液体变为红色透明液体。3将不溶血试管（第2、3管）低速离心35min，使红细胞沉淀。4. 将第 2 管上清液倒入（或用毛细吸管吸入）第 4 管，将第 3 管上清液倒入第 5 管，然后 再依表32 加入各物。表 32溶血反应加样程序 2单位：ml管号2345内容物第2管沉淀物第3管沉淀物第2管上清液第3管上清液2%红细胞0.50.5溶血素（ 2u）0.50.5补体（ 2u）0.50.5生理盐水2.52.55. 混匀后，将上述4支试管置37C水浴中1530min后，观察结果。【结果】 第1、2、5管出现溶血，其余两管均不溶血。【注

31、意事项】1. 未经洗涤的绵羊红细胞悬液可在4C冰箱中保存1周。2. 配置2%绵羊红细胞时，应将绵羊红细胞悬液洗涤3次，然后用压积红细胞配置，现用现 配。3采集补体用的容器要清洁，并及时分离血清，离心速度不应太高（以20003000rpm为 宜），否则极易引起溶血。4. 补体最好采用3只以上的豚鼠混合血清，并以新鲜为最佳，如一定要保存，根据笔者经 验，则将其置于-20C以下的环境中，可保存3个月左右。避免冻融。5. 试验前应对溶血素和补体的效价进行测定，找出最合适的浓度，否则程序2的结果会出 现混乱。新鲜补体一般作1： 30稀释。6. 试验过程中的离心速度不要太高，否则凝集的红细胞不易打散。7.

32、 水浴温度不能高于37C。8. 溶血素和补体可用0.02%叠氮钠防腐。实验四 免疫标记技术免疫标记技术（im munolabelling technic）是指用放射性同位素、酶、荧光素、胶体金、化 学发光物质或电子致密物质等标记抗体或抗原作为试剂，检测标本中的相应抗原或抗体。本技 术不仅特异、敏感和快速，而且能定性、定量和定位，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。 免疫标记技术一般分为两类：一类用于组织或其它标本中抗原或抗体的定位称为免疫组化技术（immunohistochemical technique）；另一类用于体液标本中抗原或抗体的测定称为免疫测定 （immunoassay）。根据标记物

33、质的不同，免疫标记技术又可分为：酶免疫技术、荧光免疫技术、 放射免疫分析技术、金免疫技术及化学发光免疫分析等。一、 酶免疫技术【原理】 酶免疫技术是一种把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用结合起来的方法。将酶与抗 体或抗原用交联剂连接起来，此种酶标记抗体或抗原可与组织内的或固相载体上的相应抗原或 抗体发生特异性反应，加入相应的酶底物时，底物被酶催化生成有色产物，根据成色深浅判定 待测抗原或抗体的浓度与活性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两类，前者用于组织切片上抗原的定 性和定位。后者用于标本中抗原或抗体的测定，最常用的方法是酶联免疫吸附试验。酶联免疫吸附试验（Enzyme L

34、inked Immunosorbent Assay, ELISA）ELISA双抗体夹心法测抗原（检测人血清中乙型肝炎病毒表面抗原一HBsAg）【材料】1. 包被抗体：兔抗HBsAg抗体。2. 酶标抗体：辣根过氧化物酶（HRP）标记的小鼠抗HBsAg单克隆抗体。3. 待检标本：病人血清。4. 阳性对照：HBsAg阳性血清。5. 阴性对照：正常人血清。6. 其它试剂：包被缓冲液（0.05molpH9.6碳酸盐缓冲液）；封闭液（1%牛血清白蛋白、0.14mol NaCl、0.05mol pH8.0 Tris缓冲液）；标本稀释液（1%牛血清白蛋白、0.05%吐温-20、0.05mol pH7.2 PB

35、S）；洗涤液（0.05%吐温-20、0.05mol pH7.2 PBS）；底物溶液邻苯二胺（OPD 或四甲基联苯二胺（TMB）；终止液（2molHS0）。247聚苯乙烯酶标板，塑料洗瓶或洗板机，酶标仪，微量移液器等。【方法】1已知抗体包被酶标板：用包被缓冲液将兔抗HBsAg抗体稀释至工作浓度，按每孔100卩1 包被酶标板，4C过夜。2洗板：弃去酶标板内的包被抗体，在吸水纸上拍干，孔内加满洗涤液，静置23min, 再在吸水纸上拍干，如此洗涤3次。 有条件此步骤也可用洗板机进行操作。3. 封闭：每孔加封闭液200pl, 37C湿盒1小时。4. 洗板：弃去封闭液，按步骤2洗板三次。5. 加待检标本：

36、取病人血清标本，加于酶标板孔内，每孔100卩1,每份标本加2孔，同时设 阳性对照，阴性对照和空白对照。置37C湿盒60min。6. 弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。7. 每孔加100卩1酶标记抗HBsAg单克隆抗体，置37C湿盒60min。8. 弃去酶标板内液体，按步骤2洗板三次。9. 每孔加底物溶液lOOyl, 37C避光孵育15min。10. 每孔加终止液一滴（约50卩1）,终止反应。11. 观察显色反应或用酶标仪在490nm处用蒸馏水调零，测定其OD值。【结果】1. P/N值三2.1为阳性，2.12P/N值三1.5为可疑，P/NV1.5为阴性。p/N= 标本OD值一空白对照OD值阴性

37、对照OD 空白对照OD值2. 肉眼判断：反应孔呈棕黄色为阳性结果，无色为阴性结果。【注意事项】1. 包被缓冲液、洗涤液等，可配成10倍浓缩的液体，这样能减少配液次数,方便平时使用， 同时也便于保存。2. 浓缩的试剂在使用前需用新鲜的蒸馏水或去离子水按要求稀释，使用不合格的蒸馏水可 能使空白值增高。3存放在冰箱内的试剂，在使用前应先恢复至室温（一般在室温平衡30min）,并检查试剂 各组分是否变质（洗涤液、底物缓冲液等容易长霉菌）。4. 尽量避免标本溶血，检测标本宜新鲜。若5天内检测，可保存于2-8C，超过一周时 间测定，应于-20C低温冻存。5. 反复冻溶会使抗体效价降低，应尽量避免。6. 用

38、封闭液封闭酶标板，可降低本底。封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验 条件。并非所有的ELISA固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体 夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是 用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，实际已起到 了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。7. 每一洗板步骤一般为3次，每次浸泡时间一般为23min。洗板时需保证酶标板平放， 将洗涤液注满各孔，但尽量避免洗涤液溢液现象，洗板的液体残留量不宜过多，洗完后，应将 酶标板在吸水纸上轻轻拍干。8. 加样

39、时避免样本溅出，如有样本溅出孔外时，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。9. 空白对照不加样本，其余步骤相同。10. 加样后酶标板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。11. 保温容器最好是恒温水浴箱，可使温度很快达到平衡。如使用孵箱或置室温，为避免孔 内液体蒸发，可用封板胶将ELISA板面密封后进行温育。温育时尽量少开启恒温箱门，不能人 为缩短或延长温育时间。12. 底物溶液现配现用，加底物应避光显色，显色时间不要太长，以免本底偏高。13. 加终止液后，应在2h内比色测定。底物为邻苯二胺时用490nm波长比色；底物为四甲 基联苯二胺时用450nm波长比色。14. 叠氮钠对辣根过氧化物酶的

40、活性有明显的抑制作用，在试验中应避免使用。二、 荧光免疫技术荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。用荧光物质标记抗体而进行抗原定位的 技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）,利用荧光抗体可直接或间接检测抗原。 与酶免疫技术和放射免疫分析一样，荧光免疫技术在科研和临床检验中应用非常广泛。直接（或间接）荧光免疫法检测标本片中的抗原【原理】基本原理是将荧光素，如异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC ）或罗丹明 （lissamine rhodamine B200, RB200）与某些特异性抗体（或抗原，但少

41、用）以共价键结合，但 不影响该抗体的免疫特性。然后将此荧光素标记的抗体染色标本，如标本中有相应抗原，则荧 光标记抗体与抗原结合形成复合物，在紫外光或激光的照射下，复合物中的荧光素发出荧光， 借助荧光显微镜就能观察到该抗原的定位情况。【材料】1. 待检标本：如组织切片、细胞涂片、细菌涂片等。2. 特异性抗体。3. 荧光素标记的抗抗体（直接法只需荧光素标记的特异性抗体）。4. pH 7.4 PBS.【方法】1. 标本片制备（1）载玻片的处理：取新载玻片依次用洗衣粉溶液浸泡流水冲洗一 清洁液浸泡流水冲洗蒸馏水冲洗1遍95%乙醇过一遍烘干（晾干）。（ 2）根据实验目的不同制备各种标本片。（3）标本固定

42、：蛋白质抗原常用丙酮、无水乙醇或四氯化碳等室温固定310min,或4C 固定30min；多糖抗原用丙酮或甲醇固定，室温510min或4C 3060min；类脂抗原用10%甲 醛室温固定310min。标本固定后需立即以冷0.01mol pH 7.4PBS浸洗3次，每次3min,然后 晾干待用。2. 染色方法（1）直接法 将荧光抗体滴加于已固定的标本上，置湿盒内，37C染色3060min。取出 后先用pH7.4 PBS轻轻冲洗，再连续通过3缸PBS浸洗，每次5min。取出后流水冲去PBS后 吹干待检。（2）间接法 于固定的标本上先滴加已知抗体，置37C湿盒内30min,用pH 7.4 PBS轻 轻

43、冲洗后连续通过3缸PBS浸洗，每次5min。再于标本片上滴加荧光素标记的抗抗体，置37C 湿盒内30min,同法浸洗后吹干待检。3. 封片于已染色的标本片上滴加缓冲甘油（甘油1份、 0.01mol pH 7.4 PBS 1份）一滴，盖上盖玻 片。封片后可降低荧光素的光致猝灭。【结果】荧光显微镜下所观察到的荧光图象，主要以两个指标判断结果，一是形态学特征，二是荧 光强度，必须将二者结合起来综合判断。根据特异性荧光强度用“+”、“+”、“+”表示，无特异性荧光记“-”。特异性荧光呈黄 绿色。【注意事项】1. 载玻片厚度应在 0.8-1.2mm 之间.太后的玻片,一方面吸光太多,另一方面不能使激发光

44、在 标本上聚焦。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光，在使用必须彻底清洗，必要时还应作 处理。2. 盖玻片厚度应选择0.17mm左右,光洁。为加强激发光，也可以用干涉盖玻片，这是一种特 制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片,它可以使荧光 顺利透过,而反射激发光，这种反射的激发光又可以激发标本。3. 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察 到的上部为充分激发。另外，细胞组织重叠或杂质会掩盖荧光，影响判断。4. 染色反应最好在湿盒内进行,以免标本上试剂干燥。染色试剂的干燥是造成非特异性染色 反应的原因之一。5染色反应的酸

45、碱度以接近体液环境为宜（pH7.4左右），因此，切片冲洗液及抗体稀释液均应 注意酸碱度的调整。6. 组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。7. 切片经染色后，应及时观察并照相，不宜长期保存，以免褪色。切片在4C冰箱内过夜，其荧 光强度将减弱约 30%。8. 抗体稀释度以获得最佳染色效果，背景非特异性染色最小为标准，因此对每一批抗体必须 试验摸索，找出最佳稀释度。9. 为防止抗体效果下降，所购抗体应及早试验，并应尽量减少抗体溶液的冻融次数。10. 若非特异性染色过强时，在染色反应前应先将荧光抗体离心，去除沉淀物后再使用。11. 观察标本最好在暗室中进行，尤其是荧光强度

46、不高的标本。同时防止紫外线对眼睛的损 伤，在调整光源时应戴上防护眼镜。12. 观察时间以每次12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱,标本受 紫外光照射15min后，荧光也明显减弱所以最多不得超过23h.13. 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源，灯熄灭后欲再 使用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃，同一天中应避免数次点燃光源。14. 荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度。在 判断结果时，必须将二者结合起来判断。结果记录根据效果指标，即凭工作者目力观察，作为 一般定性观察，基本上是可靠的，随着科学技术的发展，在不

47、同程度上采用客观指标记录判断 结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器，但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的 判断。15. 保存荧光抗体一要防止抗体失活，二是防止荧光素不脱落和不受激发猝灭。一般认为 04C可保存12 年, -20C可保存34年。宜小量分装，禁止反复冻融。保存前需加防腐剂一 般加入浓度1:50001:10000的硫柳汞或1:10001:5000叠氮钠防腐） 。真空干燥后更易长期保存。16. 荧光亮度的判断一般分四级：-无或可见微弱荧光， + 仅见明确可见的荧光，+可见明亮的荧光， +可见耀眼的荧光。三、金免疫技术胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，这种金颗粒呈红

48、色，并能与蛋白质 等大分子物质结合，因此，可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体。典型的测定方 法有斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等。胶体金技术具有简便、快速等优点，目前广泛 应用于临床实验室诊断。（一）、斑点免疫渗滤试验【原理】 以双抗体夹心法为例。预先在硝酸纤维素膜的中央滴加纯化抗体，为膜所吸附。当滴加在 膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中所含抗原被膜上特异性抗体捕获，其余无关蛋白等则滤出 膜片。其后加入的胶体金标记的抗体在渗滤中与已结合在膜上的抗原特异性结合。因胶体金本 身呈红色，阳性反应即在膜中央呈现红色斑点。【材料】HCG金标反应板，抗HCG金标抗体，洗涤液，待测尿液等。【方

49、法】1. 将反应板平放于实验台上，在小孔内滴加待测尿液12滴，待其完全渗入。2. 于小孔内滴加抗HCG金标抗体12滴，待其完全渗入。3. 在小孔内滴加23滴洗涤液，待其完全渗入。4. 判断结果。【结果】在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者为阳性反应，反之为阴性反应。斑点成色的深 浅相应地提示阳性强度（抗原浓度的高低）。（二）斑点免疫层析试验【原理】斑点免疫层析试验简称免疫层析试验（ICA）,它也以硝酸纤维素膜为载体，将多个试剂组 合在一个约6mmX70mm的试纸条上，成为单一试剂条（图18）,试剂条上端（A）和下端（B） 分别为粘贴吸水材料，金标抗体干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤

50、维膜条。硝酸 纤维膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgGo 测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干 片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条移动。若标本中有带测特异性抗原，则与免疫金复 合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条 （T）o过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相抗小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单 克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质 控线条。RTRA图虎免疫层柝试验原理示意图X 0 Y V免疫金复合物

51、特异性抗原固相特异性抗体固相抗小鼠IgG抗体【材料】HCG金标试纸条，待测尿液。【方法】将白色一端插入尿液中，使尿液面不超过Max线，5秒钟后取出平放，3min内观察结果。【结果】出现一条红线者为阴性，出现两条红线者为阳性，如无红线出现，表明试纸条失效。实验五免疫细胞的分离纯化密度梯度离心法分离外周血单个核细胞外周血液中单个核细胞（peripheral mononuclear cells， PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞， PMNC是免疫学实验最常用的细胞，也是进行T、B细胞分离纯化过程的重要中间环节。因此， 获取高纯度和活性的PMNC常常是许多免疫学实验的先决条件。【原理】PMNC在其体积

52、、形状和比重方面与外周血中其它细胞有差异。红细胞和多核白细胞的比重 （1.092左右）比PMNC的比重（1.0751.090）大。因此，利用一种比重介于1.0751.092之间 的等渗溶液（分层液）作密度梯度离心,使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布，从而可使PMNC 从血细胞中分离出来。本法淋巴细胞的回收率约为80%90%，淋巴细胞的纯度为90%左右。 不同动物所用的细胞分离液的比重有所不同，如大鼠为1.087g / ml，而小鼠和豚鼠为1.085g / ml。【材料】1. 聚蔗糖一泛影葡胺分层液 比重1.0770.001,商品名：淋巴细胞分离液。2. 抗凝剂 配制200U / ml注射用肝

53、素溶液。3. 台盼蓝染液 称取4克台盼蓝放置研钵中，加少量双蒸水，反复研磨，加双蒸水至100ml， 离心（1500rpmX10min），吸出上层液，即为4%水溶液，用前用生理盐水稀释成0.4%。【方法】1. 抗凝血稀释 取静脉抗凝血，用pH7.27.6Hanks溶液将抗凝血做1：11：2稀释。2. 取分层液4或15m1置入15或50m1灭菌离心管内。3. 用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠 于分层液上。稀释血液与分层液体积比例为2 : 1，即8或30m1稀释血重叠于4或15m1分层液 上（图19-A，离心前）。AB图194. 用水平离心机离心（200

54、0rpmX2025min），离心后细胞分布如图19-B，绝大多数PMNC 悬浮于血浆与分层液的界面上，呈白膜状。用毛细吸管轻插至白膜层，沿试管壁周缘吸出界面 层细胞，移入另一试管中。5. 用5倍以上体积的Hanks液或PBS液（含1%牛血清白蛋白，BSA）离心（1500rpmX5 10min）洗涤3次。6. 最后将细胞重悬于淋巴细胞培养液中。【结果】1. 细胞计数 取细胞悬液0.1m1,加等量0.4%台盼蓝染液，混匀，吸取1滴，加入血细 胞计数板内，使悬液充满计数室，按白细胞计数方法计数四大格内的活细胞（死细胞蓝染），按 下法计算细胞浓度：细胞浓度（细胞数/ml原液）=一4大格内的细胞总数X1

55、0000X稀释倍数4 所得PMNC总数=细胞浓度X细胞悬液体积2. 细胞分离率计算细胞分离率（）=所得细胞悬液中PMNC总数X100%血液中PMNC总数【注意事项】1. 静脉抗凝血用Hanks溶液做1 ： 2稀释，可取得更好的分离效果。2稀释血液与分层液体积比例不应大于2 : 1,过大会影响分离效果。3. 加入血液时应沿管壁缓慢加入，使血液重叠于分层液之上。避免血液加入过快或过猛造 成血液与分离液混合，严重影响细胞分离效果。4. 吸取单个核细胞时，应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染。5配制好的单个核细胞可放室温或0-4 C，后一条件较好，可减低细胞代谢活动。注意不要 迅速改变其所处的

56、温度，以免造成“温度”休克。实验六细胞免疫功能测定机体免疫系统在接受外来抗原或自身抗原的刺激后，通过细胞免疫和体液免疫以及相关系 统的相互协同，对抗原产生免疫，或消除抗原，或产生超敏反应，或产生免疫耐受。在免疫应 答过程中，有多种细胞参与，其中巨噬细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞是最主要的细胞，这些 免疫细胞的功能状态反应了机体免疫的状态，通过免疫细胞功能测定不仅能为临床疾病的发生 发展及转归作出一定的预测，同时还可为基础研究提供一定的实验依据。一、E玫瑰花环试验【原理】人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，在体外一定条件下，当T细胞与 SRBC混合时，可形成以T细胞为中心，四周环

57、绕SRBC的花环。E花环的形成是T细胞独特的 标志。E花环形成试验最常用的是总E花环试验和活性E花环试验。总E花环试验代表被检标 本中T淋巴细胞的总数和百分率；而活性E花环试验反映的是对SRBC具有高度亲和力的T细胞 亚群，该亚群T细胞与T细胞的体内外功能活性有密切关系，在一定程度上反映机体细胞免疫 功能的状态。【材料】1肝素，淋巴细胞分离液，无Ca+、Mg+Hanks液，SRBC悬液，0.8%戊二醛(生理盐水配 制)，瑞氏染液。2. 离心机，水浴箱，显微镜，吸管，试管等。【方法】1. 淋巴细胞分离 按实验六方法进行。2. 将Alsever液保存的新鲜SRBC，吸去上清后取沉淀细胞，用Hank

58、s液离心洗3次，每次 1500rpmX 10min,将压积 SRBC 用 Hanks 液配成 1 %SRBC 悬液。3. 总E花环试验：分别将淋巴细胞悬液0.1m1、1 %SRBC 0.1m1和吸收小牛血清0.05m1 混匀，置37C水浴10min。离心500rpm 5min,移置4C冰箱2小时或过夜，再吸去部分上清， 轻轻摇匀，加0.8%戊二醛1滴固定，数min后取1滴涂片，待自然干燥，瑞氏染色，高倍镜下 观察。4. 活性E花环试验：分别将淋巴细胞悬液0.1ml、0.5%SRBC悬液0.1ml和吸收小牛血清 0.05m 1混匀，37C水浴5min，离心500rpm 5min,弃部分上清，轻轻

59、摇匀后加美兰l滴，直接 滴于玻片上，加盖玻片计数。亦可于加0.8%戊二醛1滴；数min后取1滴涂片，干燥后作瑞 氏染色，计数200个淋巴细胞,凡淋巴细胞周围吸附3个或3个以上SRBC者即E花环阳性细胞。【结果】E花环形成率=形成E花环细胞数X100%形成E花环细胞数+未形成花环细胞数正常值：一般总E花环试验为6080%，活性E花环试验为2540%。【注意事项】1. 影响E玫瑰花环试验最主要的因素是淋巴细胞和红细胞的新鲜程度，被检血样必须新 鲜，采血后要求在3h4h内进行试验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。 红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周，且不应溶血。2. 控制好反应温度、

60、时间等条件对玫瑰花环形成率有较大影响。选37C作用10min，低 速离心5min,置4C 2h4h,其结果稳定性较好，结合率较高。如在37C作用时间较长， 可见玫瑰花环发生变形，结合部位松弛、拉开，甚至解离。3. 加小牛血清能增强玫瑰花环形成细胞的稳定性和牢固性。4. Hanks液的pH以7.27.4为宜5. 未加戊二醛固定前避免剧烈摇动，防止已经结合在淋巴细胞膜上的绵羊红细胞脱落，降 低花环形成率。6.0.8%戊二醛必须用生理盐水配制，不然红细胞会因低渗而溶解，造成实验失败。7. 镜下观察结果应采用随机原则，不能带有主观因素。8. 不同种类的红细胞与玫瑰花环的形成率有关。如马淋巴细胞与豚鼠红

61、细胞结合较好，而 驴则与绵羊红血球结合较好。Melinda氏报道，人、马、牛、猪、狗、猫、鼠的淋巴细胞与豚 鼠红细胞的结合率都高于绵羊红细胞的结合率。二、淋巴细胞转化试验T淋巴细胞与植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)或刀豆蛋白A (concanavalin, ConA) 等非特异性有丝分裂原，或与结核菌纯化蛋白衍生物(PPD)等特异性抗原，在体外共同培养时， 细胞内核酸和蛋白质合成增加，同时细胞形态转化为原始母细胞。依其细胞的转化程度，可测 定T细胞的应答功能，常用的方法有形态计数法和同位素掺入法。(一)形态学检查法【原理】将人外周血或分离的淋巴细胞与PHA共同培养一

62、定时间后，取培养细胞涂片染色，镜下计 数转化的淋巴母细胞数，计算其转化率，转化率高低可反映人体细胞免疫功能的水平。【材料】1. 淋巴细胞培养液：50 g/ml PHA 10%FCS 1640完全培养液。2. 离心机，C02培养箱，显微镜等。【方法】1. 采用全血微量法时，无菌取肝素抗凝血1ml注入3ml淋巴细胞培养液中。若用分离的淋 巴细胞，则将淋巴细胞数调整为3X106个/ml的细胞悬液，同时设对照。2. 转化培养：37C培养72小时，每天摇匀1次。3. 将细胞悬液离心，取沉淀细胞制成推片；亦可经低渗破坏红细胞，即培养后1000 rpm 离心10min,弃上清，加蒸馏水2m1/管1min，加高渗盐水恢复为等渗，再离心。弃上清后将 细胞打匀，取悬液制成涂片。姬姆萨氏染色，油镜观察计数。【结果】根据细胞大小、核和胞浆特征等进行判别。转化过程中，常见的细胞类型有以下几种：淋 巴母细胞、过渡型淋巴细胞、核分裂相细胞、成熟淋巴细胞等。淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的34倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈细 网状