高效液相色谱法测定化妆品中7种酚羟基类美白成分

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1、高效液相色谱法测定化妆品中 7 种酚羟基类美白成分张良雨;李启艳;王小兵;刘莹;于海英【摘要】建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)同时测定化妆品中 熊果苷、氢醌、阿魏酸、苯酚、丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚和己基间苯二酚7 种酚羟基类美白成分的方法用甲醇提取样品，采用Kromasil C18色谱柱(250 mmx4.6 mmx5pm)分离，以甲醇-质量分数0.02%磷酸作为流动相进行梯度洗脱, 流速1.0 mL/min,柱温30C,检测波长280 nm.熊果苷、氢醌、苯酚、丁基间苯二 酚、苯乙基间苯二酚、己基间苯二酚的质量浓度在2 200 mg/L,阿魏酸的质量浓 度在0.5

2、 50 mg/L范围内，线性关系良好相关系数均为0.9999,且保留时间和峰 面积的日内与曰间精密度均良好相对标准偏差(RSD)小于2.0%.此方法检出质量比 为14 mg/kg,回收率为96.2% -112.3%相对标准偏差(RSD)为0.8% 2.1%. 该方法简单、便捷、快速、准确,可用于化妆品中美白成分的测定.【期刊名称】 香料香精化妆品【年(卷),期】 2019(000)001【总页数】5页(P69-73)【关键词】 高效液相色谱法;美白祛斑类化妆品;美白成分;含量测定【作 者】 张良雨;李启艳;王小兵;刘莹;于海英【作者单位】 山东省食品药品检验研究院,山东济南 250101;山东

3、省食品药品检验 研究院,山东济南 250101;山东省食品药品检验研究院,山东济南 250101;山东省食 品药品检验研究院,山东济南 250101;山东省食品药品检验研究院,山东济南 250101正文语种】中 文拥有健康白润光滑的肌肤一直是中国女性梦寐以求的事情，因此，在美白祛斑类化 妆品的消费上中国女性出手阔绰、非同一般，她们为美白所支出的费用在世界上也 位居前列。权威市场研究公司尼尔森分析指出，在中国护肤品市场，有近30%的 化妆品都属于美白类产品。在巨大的市场需求及利益驱动下，各大化妆品厂商纷纷 投入到对新型有效的美白祛斑功效成分的开发与研究中，中国美白化妆品市场正在 成为众多化妆品品

4、牌的掘金之地。而在占据化妆品消费主导地位的同时，美白祛斑 类化妆品也存在着巨大的安全风险，需纳入严格管理。有研究表明，酪氨酸酶是人体内参与黑色素合成的关键酶，其活性程度对黑色素的 生成起到重要作用，对肌肤颜色的影响较大1-2。因此，可通过抑制酪氨酸酶的 活性来阻断黑色素生成，从而达到美白效果3-4。带有酚羟基的化合物因与酪氨 酸具有相似的结构特征，大多可以作为酪氨酸酶的抑制剂添加到美白祛斑类化妆品 中，如氢醌、苯酚、熊果苷、阿魏酸、间苯二酚衍生物等。其中，氢醌、苯酚作为 化妆品安全技术规范中的禁用物质，不得被添加到化妆品中；熊果苷、阿魏酸 作为天然植物提取物，安全可靠，但提取成本较高；间苯二酚

5、衍生物，作为一种新 型高效的美白祛斑功效成分，可以通过化学合成，且具有一定的安全性能，而日益 获得各大生产厂家的青睐。目前，化妆品中美白成分的检测方法主要有高效液相色谱法 5-7、气相色谱法8 超高效液相色谱 - 质谱法9-10等。化妆品安全技术规范中，仅规定了禁用美 白成分氢醌、苯酚的检测方法，而对其他几种成分还没有明确的限值和检测方法规 定。因此，本文采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法同时测定了氢醌、苯酚、 熊果苷、阿魏酸、苯乙基间苯二酚、丁基间苯二酚、己基间苯二酚7 种酚羟基类 化合物，以期为化妆品中美白成分的检测和美白祛斑类产品的市场监管与标准制定 提供参考。1 试验部分1.1 仪器

6、与试剂岛津LC - 20AT高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器），日本岛津公司；Milli - Q超纯水机，美国密理博公司；Mettler Toledo MS分析天平（十万分之一精 度），瑞士梅特勒-托利多公司；Universal 320R离心机，德国Hettich公司； KQ - 500DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。甲醇（色谱纯）购于德国默克公司；磷酸二氢钾（优级纯）购于国药集团化学试剂 有限公司；磷酸（优级纯）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；熊果苷（购于北 京恒元启天化工技术研究院，纯度：98% ）;氢醌（购于Dr. EhrenstorferGmbH，纯度：99.5%

7、 ）；阿魏酸（购于中国食品药品检定研究院，纯度： 99.6% ）；苯酚（购于中国计量科学研究院，浓度：1.02 mg/mL ）; 丁基间苯二 酚（购于Ark Pharm，纯度：97%）;苯乙基间苯二酚（购于TCI，纯度： 98% ）；己基间苯二酚（购于J&K，纯度：98%）。1.2 色谱条件色谱柱：K r o m a s i l C 1 8柱（4.6 m m x 250 mm x 5 pm）;检测器：二 极管阵列检测器，通用检测波长为280 nm ;流速：1.0 mL/min ;柱温：30 C; 进样量：10 pL;流动相：甲醇+质量分数0.02%磷酸水溶液，梯度洗脱条件如表 1 所示。表1梯

8、度洗脱条件时间/min甲醇体积分数/% 0.02%磷酸水溶液体积分数/%0 595 95 10 70 30 15 95 5 25 95 5 25.1 5 95 35 5 95 3 51.3 系列标准溶液的配制 准确称取熊果苷、氢醌、阿魏酸、丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚、己基间苯二酚 各标准品适量，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到质量浓度 分别为547.8、 979.1、1 124、989.4、1 018.0 和 980.8 mg/L 的标准储备液。取各标准储备液适量，用甲醇稀释定容，制成混合标准溶液，放于4 C冰箱中保 存备用。表2 列出了7 种美白成分混合标准溶液的浓度

9、。表2 7种化合物混合标准溶液的浓度系列化合物名称质量浓度/(mg mL-1 )熊果苷 2.191 10.960 21.910 43.830 109.60 219.10 氢醌 1.958 9.791 19.58039.160 97.91 195.80阿魏酸 0.562 2.811 5.622 11.240 28.11 56.22苯酚 2.04010.200 20.400 40.800 102.00 204.00丁基间苯二酚 1.979 9.894 19.790 39.58098.94 197.90苯乙基间苯二酚 2.036 10.180 20.360 40.720 101.80 203.60

10、己基 间苯二酚 1.962 9.808 19.620 39.230 98.08 196.201.4 样品的制备11准确称取样品0.5 g (精确到0.001 g)于10 mL具塞试管中，用甲醇定容至刻度，振摇 1 min ，超声提取30 min 使样品完全分散，于3 500 r/min 转速下离心10min，经0.45 pm滤膜过滤后备用。2 结果与讨论2.1 色谱条件优化2.1.1 检测波长的选择分别采集各标准物质的紫外吸收光谱图，结果如图1 所示。由图1 可知，7 种酚 羟基类化合物在280 nm 附近均存在紫外吸收峰，且熊果苷、丁基间苯二酚、苯 乙基间苯二酚和己基间苯二酚的最大吸收波长就

11、是280 nm ，因此选择280 nm 作为7 种化合物的检测波长。图1 7 种标准物质紫外吸收光谱图2.1.2 色谱柱的选择试验中比较了 3种不同填料色谱柱Atlantis T3 (4.6 mm x 250 mm x 5 pm)、Kromasil C18 (4.6 mm x 250 mm x 5 pm)、Zorbax XDB C18 (4.6 mm x 250 mm x 5 pm）的分离效果。结果表明，Kromasil C18的分离效果优于 Atlantis T3和Zorbax XDB C18，尤其是阿魏酸和苯酚、丁基间苯二酚和苯乙基 间苯二酚的保留得到了明显改善，分离度较另外两种柱子高，因

12、此本试验选择 Kromasil C18 作为分离色谱柱。2.1.3 流动相的优化 因检测的目标化合物均含有酚羟基，呈弱酸性，故需采用酸性流动相。参考文献 12-15中所使用的流动相，本方法考察了甲醇 - 0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液、甲 醇 - 水、甲醇 - 质量分数0.02%磷酸作为流动相时各组分的分离情况，并对梯度 洗脱条件进行了优化。结果表明，当以甲醇 - 0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液或甲醇 - 水作为流动相时，阿魏酸和苯酚不能完全分离，两者保留较差，分离度低；当用 甲醇 - 质量分数0.02%磷酸作为流动相进行梯度洗脱时， 7 种化合物可达到完全 分离，且峰形对称，不拖

13、尾，具体结果见图2。图2 7 种标准物质色谱图1 - 熊果苷；2 - 氢醌；3 - 阿魏酸；4 - 苯酚；5 - 丁基间苯二酚；6 - 苯乙基间苯二酚；7 - 己基间苯二酚2.1.4 柱温的优化考察了柱温分别为25、30、35和40 C时7种目标化合物的分离情况。结果表明， 当柱温为30 C时，7种目标化合物的分离度最高，温度过高或过低时分离效果均 不理想，因此将柱温设为30 C。2.2 方法学验证2.2.1 线性关系考察 在设定的色谱条件下，将系列标准溶液依次进样分析，分别测定不同浓度标准溶液 的峰面积，以各组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，各组 分的线性范围、回归方程及

14、相关系数如表3 所示。由表3 可知，7 种化合物的线 性相关系数均为0.9999，说明回归方程线性关系良好。2.2.2 方法检出限与定量限 向空白样品中定量添加目标化合物的混合标准溶液，进样分析，以3 倍信噪比(S/N=3 )计算检出限，以10倍信噪比(S/N = 10 )计算定量限。得到熊果苷、 氢醌、阿魏酸、苯酚、丁基间苯二酚、苯乙基间苯二酚、己基间苯二酚的检出限分 别为 4、2、1、2、2、2 和 2 mg/kg ;定量限分别为 13、6、3、6、6、7 和 7 mg/kg。表3 7种化合物的线性范围、回归方程和相关系数化合物线性范围/(mg mL-1) 回归方程相关系数熊果苷2 - 2

15、00 y = 4401.93x-1053.33 0.9999氢醌2 200 y = 11645.9x-6074.63 0.9999 阿魏酸 0.5 50 y = 30266.5x+4298.8 0.9999 苯酚 2 - 200 y = 5759.12x+5909.78 0.9999 丁基间苯二酚 2 - 200 y =9422.88x-2282.35 0.9999 苯乙基间苯二酚 2 - 200 y = 8027.22x-1999.94 0.9999 己基间苯二酚 2 - 200 y = 4818.5x+1608.07 0.99992.2.3 精密度与稳定性取混合标准溶液(其中阿魏酸质量浓度

16、为10 mg/L，其余六种化合物质量浓度为 40 mg/L) ，连续进样6 次，重复测定3 天，计算各化合物色谱峰的保留时间与 峰面积的日内精密度与曰间精密度，结果显示日内精密度为0.024% 0.71% , 曰间精密度为0.14% 1.6%，精密度与稳定性良好。2.2.4 加标回收率试验选取空白样品分别制备低、中、高3 个质量浓度的基质加标样品，每个添加水平 测3 个平行样，按样品前处理方法制备待测样品，进样分析测定，以标准曲线法 定量，计算回收率，结果如表4 所示。7 种化合物的回收率均在0.8%到2.1%之 间，表明该方法具有良好的回收率。表4 7种组分的回收率及相对标准偏差(n=3 )

17、组分名称加入量/pg平均回收率/% RSD/%1753 104.4 1.6 438 112.3 0.9 54.8 103.2 1.5 熊果苷表4 7种组分的回收率及相对标准偏差（续）（n=3）组分名称加入量/pg平均 回收率/% RSD/%1567.0 102.6 1.0 392.0 104.2 0.8 49.0 104.4 1.4 氢醌450.0 98.7 1.4 112.0 101.5 1.3 14.1 100.5 1.8 阿魏酸1632.0 100.4 0.9 408.0 100.91.3 51.0 101.3 1.5苯酚1583.0 97.5 1.4 396.0 102.4 1.4 4

18、9.5 102.5 1.7 丁基间 苯二酚1629.0 99.8 1.5 407.0 96.2 1.2 50.9 99.7 0.8 苯乙基间苯二酚1569.0 98.7 2.1 392.0 98.4 1.7 49.0 103.5 1.7己基间苯二酚2.3 样品测定为验证方法的适用性，本试验对市售的20 批美白祛斑类产品进行了检测，共检出 16 批样品含有上述美白成分，其中同时检出两种成分的有2批，检验结果如表5 所示。表5样品中7种组分的检出情况组分名称检出批数含量/（mg g-1）限值规定 熊果苷2 0.11 19 /氢醌0未检出不得检出阿魏酸1 0.086 /苯酚0未检出不 得检出丁基间苯

19、二酚1 0.96 /苯乙基间苯二酚10 0.95 5.2 /己基间苯二酚4 0.011 0.43 /3 结论本文建立了一种利用高效液相色谱 - 二极管阵列检测器同时分离测定化妆品中7 种美白成分的方法，试验结果表明，该方法简单、便捷、灵敏、可靠，准确度高， 稳定性好，实用性强，为更有效地监管控制美白类化妆品提供了技术支持和保障， 具有较大的参考价值。参考文献相关文献】1 杜孝元，刘玮，史飞，等酪氨酸酶活性抑制实验及其在祛斑美白化妆品功效评价中的应用J.中 国美容医学, 2005, 14(6): 740 - 742.2 程树军，步犁，潘芳.基于黑色素形成机制的美白化妆品功效体外检测方法J.中国卫

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