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1、邓 椋 爻 技 术 支 持广 州 市 昊 洋 贸 易 有 限 公 司 u定 量 分 析绝 对 定 量相 对 定 量 u定 性 分 析SNP分 析 ， 基 因 扫 描阴 阳 性 判 定熔 解 曲 线 分 析 绝 对 定 量 ： How Many 优 点 ： 给 出 目 标 基 因 初 始 模 板的 绝 对 数 量 ， 数 据 容 易 处 理 缺 点 ： 必 须 有 标 准 品 ， 做 标 准曲 线 应 用 ： 病 毒 拷 贝 数 ； 转 基 因 的拷 贝 数 ； 转 基 因 成 分 百 分 含 量 检测相 对 定 量 :How Much 优 点 ： 需 要 /不 需 要 标 准 品 ；使 用 广
2、 泛 缺 点 ： 数 据 理 解 困 难 应 用 ： 差 异 表 达 分 析 ； 芯 片 评估 14500 copies 108 106 102104 108 106 102104T 108 106 102104T 105 copies/well 1/3 Blank1/3 1/3 1/31.11 ng/2ul0.37 ng/2ul0.12 ng/2ul10.0 ng/2ul3.33 ng/2ul T Control CT = 21.3Sample A CT = 22.8Sample B CT = 19.3 Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1Sample A C
3、T = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4Fold 管 家 基 因 校 准 (Normalization Gene) 得 出 每 个 细 胞 中 的 目 的 基 因 目 标 基 因 vs. 管 家 基 因对 照 样 品 校 准 (Calibrator Sample) 得 出 相 对 于 某 个 样 品 的 基 因 表 达 量 , 1X sample. 处 理 的 vs. 未 处 理 的 ， 6hr vs. 0 hr, 病 理 vs. 正 常 .目 标 基 因管 家 基 因 处 理 后处 理 前ERBB2GAPD
4、H SampleCalibrator 按 比 例 稀 释 标 准 品 ， 根 据 标 准 曲 线 确 定 样 本 初 始 模 板 浓 度 至 少 需 要 两 个 标 准 曲 线GOIreference gene 标 准 曲 线 确 定 反 应 扩 增 效 率 依 据 ： 平 均 相 对 含 量 % = 2 平 均 CT数 据 处 理 ： C（ t） GOI- C（ t） ref= C（ t） C（ t） sample- C（ t） calibrator= C（ t）好 处 ： 不 做 标 准 曲 线应 用 范 围 ： 扩 增 效 率 较 高 ， 目 标 基 因 和 内 标 基 因 扩 增 效
5、率 一致 并 且 相 互 独 立 扩 增 ； 不 做 标 准 曲 线 ， 高 通 量 检 测 （ 芯 片 评 估 ）； 不 要 求 很 高 的 精 度 RNA提 取 RT-qPCR实 验结 果 分 析RNA定 量反 转 录 (RT)设 计 qPCR实 验 方 法 Aurum Total RNA kitiScript cDNA Synthesis Kit 已 知 在 50%的 乳 腺 肿 瘤 样 本 中 ， ERBB2表 达 异 常 ，因 此 可 以 作 为 一 个 检 测 标 准 选 用 GAPDH作 为 内 标 基 因 FAM标 记 的 ERBB2探 针 VIC标 记 的 GAPDH探 针
6、标 准 品 （ 质 粒 ） 构 造 标 准 曲 线 多 重 PCR反 应 阴 性 对 照 无 RNA对 照 （ 空 白 ） 无 逆 转 录 酶 对 照 （ 监 控 基 因 组 污 染 ） Experion RNA StdSens Chip5-500 ng/ml100-6,000 ntExperion RNA HighSens Chip0.1-5 ng/ml100-6,000 nt 乳 癌 组 织 RNA正 常 乳 腺 组 织 RNA5 hr. at 90 CIntact Intact 7 hr. at 90 CIntact 7 hr. degradation GAPDH geneIntact
7、5 hr. degradation 在 不 同 的 反 应 管 中 运 行 RT & PCR1. 反 转 录 反 应 加 热 灭 活 反 转 酶 2. PCR 反 应 2. PCR 反 应1.反 转 录 反 应 1. 25 C 5 min2. 42 C 30 min3. 85 C 5 min 4. 冷 却 至 4 C iScript cDNA Synthesis Kit 1. 定 性 条 件 摸 索2. 荧 光 化 学 物 质 SYBR GREEN染 料 Taqman探 针3. 定 量 PCR条 件 优 化4. 单 双 通 道 相 互 验 证 q Fam标 记 目 标 基 因 探 针q VIC
8、标 记 看 家 基 因 探 针 动 态 温 度 梯 度 5-6oC Below10oC Above预 设 退 火 温 度 Real annealing range 95C,15min 94C,15sec 60C,1min plate read go to step 3,39 more times 10C,forever End 目 标 基 因 ： 未 知 样 品 生 成 标 准 曲 线 ： 标 准 品 梯 度 监 控 系 统 故 障 ： 阳 性 对 照 监 控 污 染 ： 阴 性 对 照 /基 因 组 对 照 校 准 生 物 学 误 差 ：看 家 基 因 降 低 其 余 误 差 ： 重 复 实
9、 验 Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2 ERBB2单 双 通 道 相 互 验 证 的 实 验 结 果A.Multiplex ReactionsHealthy RNA Carcinoma28.48 26.4228.68 26.9828.78 26.9828.65 0.15 26.80 0.32B.Singleplex reactions Healthy RNA Carcinoma28.67 27.0928.71 26.6828.73 26.7028.70 0.03 26.82 0.24 样 品 扩 增
10、 ： 正 常 vs肿 瘤PMT1-FAM detection- ERBB2 PMT2-VIC detection- GAPDH肿 瘤 肿 瘤正 常 HealthyRNA TumorRNAGAPDHERBB2 10951052 213024929550085730 136000130800Copies ng/ l Total RNAERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.0197Healthy RNATumor RNA 0.0110.
11、018 0.018/ 0.011 1.63HealthyTissue Carc.TissueRelative Expression 00.20.40.60.811.21.41.61.82 C(t)=4.41-5.18=-0.77 0.182-c(t) =1.51 1.93结 果 与 双 标 准 曲 线 法 相 近 Healthy RNABBER2 GAPDH C(t)28.40 23.27 5.3128.46 23.41 5.0528.43 0.04 23.34 0.10 5.18 0.18Carcinoma RNABBER2 GAPDH C(t)27.36 22.81 4.5527.12 22.86 4.2627.24 0.17 22.83 0.03 4.41 0.21
实时荧光定量PCR实验结果分析
