《补体检测及应》PPT课件

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1、第 十 九 章 补 体 检 测 及 应 用 第 一 节 概 述 一 、 补 体 成 分 的 含 量 与 理 化 特 性 二 、 补 体 的 活 化 途 径 第 二 节 补 体 总 活 性 测 定 第 三 节 单 个 补 体 成 分 的 测 定 一 、 免 疫 溶 血 法 二 、 免 疫 化 学 法 第 四 节 补 体 结 合 试 验 一 、 试 验 原 理 二 、 试 验 方 法 三 、 方 法 评 价 第 五 节 补 体 受 体 的 测 定 第 六 节 补 体 测 定 的 应 用 思 考 题 小 结 第 一 节 概 述补 体 ： 具 酶 样 活 性 、 不 耐 热 的 糖 蛋 白 其 存 在

2、 与 抗 原 性 异 物 的 刺 激 无 关 在 正 常 人 血 清 中 含 量 相 对 稳 定 某 些 疾 病 时 ， 含 量 及 其 活 性 可 发 生 改 变 分 类一 、 补 体 成 分 的 含 量 与 理 化 特 性根 据 补 体 系 统 的 生 物 学 功 能 ， 可 将 其 分 为 ： 补体 固 有 成 分 、 补 体 调 节 蛋 白 、 补 体 受 体(complement receptor, CR)三 大 部 分 。 补 体 理 化 性 质由 肝 细 胞 、 巨 噬 细 胞 以 及 肠 粘 膜 上 皮 细 胞 等 多 种 细 胞 产 生 均 为 多 糖 蛋 白 ， 大 多 数

3、 电 泳 迁 移 率 属 、 球 蛋 白含 量 约 占 血 清 球 蛋 白 总 量 的 10%， 其 中 C3含 量 最 高 、 D因子 含 量 最 低固 有 成 份 间 的 分 子 量 差 异 较 大 ， 其 中 C1q最 大 、 D因 子 最小 。对 热 不 稳 定 ， 56 C、 30min即 被 灭 活 ， 0 10 C条 件 下活 性 只 能 保 持 3 4d。多 种 理 化 因 素 如 射 线 、 机 械 振 荡 、 酒 精 、 胆 汁 和 某 些 添 加剂 等 均 可 破 坏 补 体 补体成分分子量电泳区带血清含量参考值（g/ml）补体 成分分子量电泳区带血清含量参考值（g/ml

4、）C1q 390 2 70 C9 79 240C1r 95 35 B 95 210240C1s 85 35 D 25 2C2 117 1 2030 P 220 2 25C3 190 1 1300 C1INH 150 180C4 180 2 430600 C4bp 1100 250C5 190 2 75 I因子93 50 C6 128 2 60 H因子159 400480C7 120 2 55 S因子88 500C8 163 1 200 经 典 途 径二 、 补 体 的 活 化 途 径 经 典 激 活 途 径 替 代 激 活 途 径 MBL途 径激 活 物 质 抗 原 抗 体 复 合 物 肽 聚

5、 糖 、 酵 母 多 糖 、 脂 多 糖 MBL相 关 的 丝 氨 酸 蛋 白 酶起 始 分 子 C1q C3 C2、 C4参 与 补 体 成 分 C1、 C4、 C2、 C3、 C5-C9 C3、 C5-C9、 B因 子 、 D因 子 C2-C9、 MASP所 需 离 子 Ca2+、 Mg2+ Mg2+ Ca2+C3转 化 酶 C4b2b C3bBb C4b2bC5转 化 酶 C4b2b3b C3bnBb C4b2b3b 生 物 学 作 用 参 与 特 异 性 免 疫 的效 应 阶 段 ,感 染 后 期发 挥 作 用 参 与 非 特 异 性 免 疫 的效 应 阶 段 ,感 染 早 期发 挥

6、作 用 参 与 非 特 异 性 免 疫 的效 应 阶 段 ,感 染 早 期发 挥 作 用 第 二 节 补 体 总 活 性 测 定补 体 总 活 性 测 定 方 法 是 以 红 细 胞 的 溶 解 为 指 示 ， 以 50%溶 血为 判 断 终 点 ， 称 为 CH50补 体 活 化 途 径 不 同 ， 应 用 不 同 的 激 活 物 可 活 化 不 同 的 补 体途 径基 于 经 典 途 径 的 CP-CH50（ 临 床 常 规 项 目 ）应 用 于 C3旁 路 检 测 的 AP-CH50（ 尚 未 列 入 检 验 常 规 ）MBL途 径 活 性 测 定 的 可 靠 方 法 暂 未 建 立 （

7、 一 ） CH50测 定 法 的 原 理 应 用 绵 羊 红 细 胞 （ sheep red blood cell, SRBC） 和 其 相 应的 抗 体 （ 溶 血 素 ） ， 作 为 能 诱 导 补 体 活 化 经 典 途 径 的 指 示 物和 激 活 剂 。 补 体 能 使 溶 血 素 特 异 性 结 合 的 绵 羊 红 细 胞 溶 解 ，当 溶 血 素 和 绵 羊 红 细 胞 浓 度 恒 定 时 ， 溶 血 程 度 与 补 体 含 量 和活 性 相 关 。 将 新 鲜 待 检 血 清 作 不 同 稀 释 后 ， 加 入 反 应 体 系 ，测 定 溶 血 程 度 ， 以 50%溶 血 时

8、 的 最 小 血 清 用 量 作 为 判 定 终 点 ，可 测 知 补 体 总 溶 血 活 性 溶 血 程 度 与 补 体 含 量 的 关 系 在 适 当 、 稳 定 的 反 应 系统 中 ， 溶 血 反 应 与 补 体 的剂 量 依 赖 关 系 呈 现 “ S”形 曲 线 在 轻 微 溶 血 和 接 近 完 全溶 血 时 ， 补 体 量 的 变 化 对溶 血 程 度 的 影 响 不 大 ， 即溶 血 对 补 体 量 的 依 赖 不 敏感 。 但 在 30 70%溶 血时 ， 补 体 含 量 仅 出 现 较 小的 变 动 ， 溶 血 程 度 也 会 发生 较 大 的 改 变 （ 二 ） CH5

9、0测 定 方 法1.红 细 胞 浓 度 的 调 整绵 羊 红 细 胞 （ SRBC） 采 自 绵 羊 颈 静 脉 ， 制 备 脱 纤 维 羊 血 或用 阿 氏 （ Alsever） 血 液 保 存 液 制 成 抗 凝 血 ， 4 保 存 备 用 。 使用 前 ， 调 制 成 2% 5% SRBC悬 液 。 为 使 红 细 胞 浓 度 标 准 化 ，可 吸 取 少 量 红 细 胞 悬 液 ， 加 入 20 30倍 的 稀 释 液 ， 在 542nm波 长 处 测 定 吸 光 值 以 调 整 红 细 胞 浓 度 。 2.溶 血 素 滴 定溶 血 素 可 通 过 SRBC免 疫 家 兔 获 得 ，

10、一 般 无 需 纯 化试 验 前 需 先 行 加 热 56 30min或 60 3min以 灭 活 补 体溶 血 素 有 商 品 销 售 ， 可 按 标 识 效 价 稀 释 使 用自 行 制 备 的 溶 血 素 需 进 行 滴 定 ， 确 定 使 用 浓 度 ， 在 补 体 活性 测 定 中 ， 大 多 使 用 2个 单 位 。溶 血 素 效 价 稳 定 ， 一 般 使 用 3个 月 后 再 作 重 新 滴 定 3.稀 释 缓 冲 液 4. 50%溶 血 标 准 管 5. 50%溶 血 总 补 体 值 的 计 算 （ 三 ） 方 法 评 价 与 临 床 意 义方 法 简 便 、 快 速 ， 但

11、 敏 感 性 低 ， 补 体 的 活 性 除 与 反 应 体 积成 反 比 外 ， 还 与 反 应 所 用 的 缓 冲 液 、 SRBC的 数 量 以 及 反 应 温度 有 关 总 补 体 活 性 的 参 考 范 围 为 50 100U/ml CH50增 高 见 于 ： 急 性 炎 症 、 组 织 损 伤 、 恶 性 肿 瘤 等CH50降 低 见 于 ： 系 统 性 红 斑 狼 疮 、 类 风 湿 性 关 节 炎 和 强 直 性 脊 柱 炎 、急 性 肾 小 球 肾 炎 等 第 三 节 单 个 补 体 成 分 的 测 定常 作 为 单 个 补 体 成 分 的 检 测 指 标 ： C3、 C4、

12、 C1q、 B因 子 和C1酯 酶 抑 制 物 等测 定 方 法 ： 免 疫 溶 血 法 （ 检 测 单 个 补 体 成 分 的 活 性 ） 免 疫 化 学 法 （ 检 测 单 个 补 体 成 分 的 含 量 ） 自 动 化 免 疫 散 射 比 浊 法 一 、 免 疫 溶 血 法 定 义 :是 根 据 补 体 参 与 抗 体 介 导 溶 细 胞 作 用 的 级 联 效 应 特 征建 立 的 单 一 补 体 成 分 检 测 法指 示 系 统 :以 SRBC-抗 SRBC为 激 活 物 和 指 示 系 统参 照 体 系 :以 人 为 设 计 的 缺 乏 某 种 补 体 成 分 的 血 清 为 参

13、照结 果 判 度 :若 有 溶 血 发 生 ， 表 明 待 检 标 本 存 在 参 照 血 清 所 缺乏 的 补 体 成 分 ， 且 溶 血 程 度 与 此 补 体 成 分 的 量 呈 正 比 ， 仍 以 50 溶 血 为 终 点 参 照 血 清 常 称 之 “ R（ remove） ” 试 剂 ， 即 去 除某 种 补 体 成 分 之 意 。 已 能 筛 选 到 的 血 清 有 人 C2缺 乏 、豚 鼠 C4缺 乏 、 小 鼠 C5缺 乏 和 家 兔 C6缺 乏 的 血 清 免 疫 溶 血 法 常 用 于 C2、 C3、 C4、 C5、 C6等 补 体成 分 的 检 测 。 其 中 以 C3

14、、 C4两 成 分 的 检 测 更 为 常 见 二 、 免 疫 化 学 法免 疫 化 学 法 分 类 1.单 向 免 疫 扩 散 2.火 箭 免 疫 电 泳 3.透 射 比 浊 法 4.散 射 比 浊 法 前 两 种 方 法 ： 手 工 操 作 繁 琐 、 耗 时 长 、 影 响 因 素 多 、 结 果 重 复性 差 ， 已 趋 于 淘 汰 后 两 种 方 法 ： 通 过 仪 器 对 补 体 的 C3、 C4、 B因 子 等 单 个 成 分 进 行自 动 化 测 定 比 浊 法 比 浊 法 原 理 借 助 补 体 的 抗 原 性 和 与 相 应 抗 体 反 应 的 前 带现 象 建 立 的 补

15、 体 单 个 成 分 定 量 检 测 法 。比 浊 法 不 足 必 需 以 过 量 的 某 种 补 体 相 应 抗 体 为 保 证 自 动 免 疫 比 浊 法 反 映 所 测 补 体 成 分 的 绝 对 量 可 进 行 标 准 化 流 程 管 理 与 质 量 控 制 第 四 节 补 体 结 合 试 验补 体 结 合 试 验 (complement fixation test， CFT ) 将 免 疫 溶 血 作 为 指 示 系 统 ， 用 以 检 测 另 一 反应 系 统 中 抗 原 或 抗 体 的 传 统 方 法 。 一 、 试 验 原 理作 用 原 理 ： 利 用 补 体 的 溶 细 胞

16、作 用 进 行 各 种 物 理状 态 的 抗 原 抗 体 测 定5种 成 分 ， 3个 系 统反 应 系 统 ： 已 知 抗 原 （ 或 抗 体 ） 与 待 测 抗 体 （ 或 抗 原 ）补 体 系 统指 示 系 统 ： SRBC与 相 应 溶 血 素 。 试 验 时 常 将 其 预 先 结合 ， 成 为 致 敏 绵 羊 红 细 胞 （ sensitized sheep red blood cell,SRBCS） 。 反 应 分 两 步 进 行 第 一 步 :反 应 系 统 与 补 体 的 作 用 第 二 步 :指 示 系 统 利 用 剩 余 补 体 的 反 应不 溶 血 为 补 体 结 合

17、试 验 阳 性 ， 而 溶 血 为 试 验 阴 性 （ 一 ） .试 剂 的 准 备二 、 补 体 结 合 试 验 方 法1.抗 原 或 抗 体用 于 试 验 的 抗 原 或 抗 体 : 需 要 纯 化 纯 度 愈 高 ， 特 异 性 愈 强抗 原 与 抗 体 比 例 适 当 : 确 定 抗 原 或 抗 体 相 应 的 使 用 单 位 采 用 方 阵 或 棋 盘 法 进 行 抗 原 与 抗 体 滴 定 由 于 该 试 验 基 于 指 示 和试 验 两 对 抗 原 抗 体 系 统竞 争 补 体因 此 ， 补 体 必 须 恒 量 ，且 以 满 足 指 示 系 统 的 溶血 为 度 ， 过 多 会

18、导 致 假阴 性 ， 而 过 少 则 引 起 假阳 性 。 2.补 体 采 用 豚 鼠 血 清 为 补 体 对 补 体 进 行 滴 定 和 确 定 其 用 量 ，以 能 产 生 完 全 溶 血 的 最 少 补 体 用量 为 1个 实 用 单 位 正 式 试 验 时 使 用 2个 实 用 单 位 补 体 的 性 质 不 稳 定 ， 每 次 试 验前 均 应 进 行 滴 定 血 清 标 本 遇 有 抗 补 体 现 象 时 ，可 作 下 列 处 理 ：T加 热 灭 活 时 提 高 12 T 20 冻 融 后 离 心 去 沉 淀 T以 3mmol/L盐 酸 处 理 T加 入 少 量 补 体 后 再 行

19、 灭 活 T以 白 陶 土 处 理 T通 入 CO2 T以 小 白 鼠 肝 粉 处 理 T用 含 10 新 鲜 鸡 蛋 清 的 生 理 盐 水 稀 释 血 清 3.待 测 标 本采 血 并 及 时 分 离血 清 用 于 检 测 或 20 保 存 备 用 。试 验 前 ， 应 先 将血 清 56 加 热 30min（ 或 60 3min） 以灭 活 补 体 。 （ 二 ） 正 式 试 验 分 类 :小 量 法 、 微 量 法 ， 以 小 量 法 常 用 实 验 过 程 :稀 释 和 处 理 后 的 标 本 与 已 知 抗 原 或 抗 体 、 不 同 含 量 的 补 体 温 育与 指 示 系 统

20、共 育结 果 判 度 :对 照 管 : 阴 性 对 照 管 :溶 血 阳 性 对 照 管 :不 溶 血 抗 体 或 抗 原 对 照 管 :完 全 溶 血 待 检 血 清 对 照 管 :完 全 溶 血 绵 羊 红 细 胞 对 照 管 :不 出 现 自 发 性 溶 血 补 体 对 照 管 ： 受 检 血 清 阳 性 :不 溶 血 阴 性 :溶 血注 意 : 若 上 述 各 对 照 管 不 出 现 预 期 结 果 ， 则 试 验 结 果 不 可 靠 ，其 可 能 原 因 应 根 据 出 错 的 对 照 管 进 行 分 析 。 2个 单 位 :全 溶1个 单 位 :全 溶 或 略 带 少 许 红 细

21、胞 0.5个 单 位 :不 发 生 溶 血 三 、 方 法 评 价 优 点灵 敏 度 高 、 所 测 定 的 抗 体 水 平 可 达 0.05 g/ml ，出 现 交 叉 反 应 的 机 率 较 小 ，可 检 测 的 抗 原 或 抗 体 范 围 广 泛 ，无 需 特 殊 设 备 、 结 果 容 易 观 察 、 试 验 条 件 要 求 不 高现 状影 响 的 因 素 多 、 各 种 制 剂 需 要 烦 琐 的 稀 释 和 滴 定 等 ，现 代 化 、 自 动 化 抗 原 抗 体 检 测 方 法 的 不 断 涌 现 ， 补 体 结 合 试 验 逐 渐 被 遗 弃补 体 结 合 试 验 作 为 一

22、种 经 典 的 免 疫 方 法 类 型 ， 其 设 计 和 原 理 仍 对 新 型 免 疫 方 法 的 建 立 有 着 启 迪 和 指 导 作 用 第 五 节 补 体 受 体 的 测 定补 体 受 体 ： 存 在 于 多 种 细 胞 清 除 免 疫 复 合 物 、 净 化 机 体 内 环 境 检 测 补 体 受 体 ， 有 助 于 判 断 机 体 抗 感 染 能 力 和 计 数 相 应 的 细 胞 数 量 补 体 受 体目 前 已 知 的 补 体 受 体 归 为以 下 五 类 ：CR1（ CD35） CR2（ CD21） CR3（ CD11b/CD18） CR4(gp150/95， CD11c

23、/18) C3aR/C5aR 名 称 别 名 CD分 类 配 体 细 胞 分 布 CR1 C3b受 体 ，C4B/C3b受 体 CD35 iC3b、 C3b， C4b、 iC4b， C3c 红 细 胞 、 中 性 粒 细 胞 、 单 核 细 胞 、 巨 噬 细 胞 、 B细 胞 、 树 突 状 细 胞 、 肾 小 球 上 皮 细 胞 CR2 C3d受 体 ，EB病 毒受 体 CD21 iC3b、 C3dg、 C3d、 EB病 毒 、IFN- B细 胞 、 树 突 状 细 胞 CR3 iC3b受体 、Mac-1抗原 CD11b/CD18 iC3b、 植 物 凝 集 素 、 某 些 细胞 多 糖

24、中 性 粒 细 胞 、 单 核 细 胞 、 巨 噬 细 胞 、 树 突 状 细胞 、 NK细 胞 CR4 gp150/95 CD11C/CD18 iC3b、 C3d、 C3dg 中 性 粒 细 胞 、 单 核 细 胞 、 巨 噬 细 胞 、 血 小 板 C5aR/ C3aR CD88 C5a/C3a(活 化 G蛋 白 ) 内 皮 细 胞 、 肥 大 细 胞 、 吞 噬 细 胞 补 体 受 体 特 性 第 六 节 补 体 测 定 的 应 用补 体 相 关 试 验 ： 诊 断 梅 毒 螺 旋 体 感 染 的 华 氏 反 应 （ 已 淘 汰 ） HLA分 型 的 补 体 依 赖 性 细 胞 毒 试

25、验 抗 原 抗 体 检 测 的 脂 质 体 免 疫 试 验 、 免 疫 粘 连 血 凝 试 验 抗 体 形 成 细 胞 定 量 检 测 的 溶 血 空 白 斑 技 术 免 疫 复 合 物 测 定 的 胶 固 素 结 合 试 验 和 C1q结 合 试 验 应 用 于 补 体 含 量 和 活 性 检 测 的 试 验 AP-CH50和 AP-H50试 验 : 反 映 总 补 体 活 性 溶 血 试 验 免 疫 化 学 试 验 免 疫 荧 光 技 术 检 测 补 体 单 个 成分 及 其 裂 解 产 物（ C1q、 C3SP 、 C3、C4、 B因 子 等 ） 和 补体 受 体 (图 )血 管 神 经

26、 性 水 肿补 体 含 量 和 活 性 相 关 的 疾 病1 免 疫 相 关 性 疾 病 ：如 自 身 免 疫 性 疾 病 时 ， C1、 C2、 C3、 C4和 Hf等 缺 陷 ；超 敏 反 应 时 （ III型 超 敏 反 应 ） ， C3a、 C5a等 过 敏 毒 素 的 产 生 。2 与 补 体 有 关 的 遗 传 性 疾 病 ： C2、 C3缺 陷 导 致 的 严 重 感 染 ； 与 C1抑 制 物 缺 陷 相 关 的 遗 传 性 血 管 神 经 性 水 肿 SLE患 者 出 现 的 细 胞 表 面 CR1缺 陷 与 C1C清 除 障 碍 涉 及 I因 子 、 H因 子 缺 陷 的

27、肾 小 球 肾 炎 ； DAF缺 陷 引 起 的 阵 发 性 血 红 蛋 白 尿 ； C1q缺 陷 表 现 的 严 重 顽 固 性 皮 肤 损 害 ， 以 及 C1q、C1r、 C4、 C2缺 陷 造 成 的 免 疫 复 合 物 性 血 管 炎 （ 包 括 肾 炎 ） 等 。(图 )血 管 神 经 性 水 肿 3 补 体 含 量 显 著 降 低 的 疾 病 ： 消 耗 增 多 :免 疫 复 合 物 形 成 导 致 的 补 体 活 化 和 消 耗 增 多 .如SLE. 补 体 的 大 量 丢 失 :主 要 见 于 大 面 积 烧 伤 、 失 血 及 肾 脏 病 患 者 补 体 合 成 不 足 :

28、常 见 于 肝 脏 疾 病 患 者 或 营 养 不 良 的 病 人 。4 高 补 体 血 症 ： 偶 见 于 感 染 恢 复 期 和 某 些 恶 性 肿 瘤 患 者 ，正 常 妊 娠 时 ， 也 可 观 察 到 补 体 值 的 增 高 。 1.已 知 补 体 的 活 化 有 三 条 途 径 ， 试 述 三 条 激 活 途 径 有何 不 同 ？2.试 述 补 体 在 抗 感 染 免 疫 中 有 何 作 用 ？ 3.补 体 有 30余 种 成 分 ， 各 自 的 作 用 不 同 但 相 互 联 系 ，补 体 的 网 络 系 统 中 起 关 键 作 用 的 成 分 是 哪 几 个 ？4.补 体 在

29、参 与 机 体 免 疫 系 统 效 应 中 发 挥 的 主 要 作 用 是什 么 ？5.应 用 补 体 检 测 抗 原 抗 体 的 方 法 有 几 种 ？ 有 无 你 认 为可 以 建 立 但 尚 无 人 提 及 的 ？思 考 题 6.补 体 在 参 与 人 类 疾 病 的 病 理 损 伤 中 发 挥 什 么 作 用 ？7.机 体 的 免 疫 损 伤 或 炎 症 多 发 生 于 什 么 情 况 下 ？ 损 伤的 机 制 是 什 么 ？8.试 比 较 各 种 补 体 检 测 方 法 的 优 缺 点 和 如 何 进 行 临 床应 用 选 择 ？9.补 体 缺 陷 所 表 现 的 主 要 临 床 特

30、 征 是 什 么 ？10.补 体 的 主 要 理 化 特 点 是 什 么 ？ 小 结 补 体 是 重 要 的 参 与 固 有 免 疫 的 可 溶 性 球 蛋 白 分 子 ， 同 时 有 助 于 特 异 性 抗体 产 生 后 效 应 的 发 挥 ， 可 有 效 地 清 除 机 体 的 可 溶 性 免 疫 复 合 物 ， 发 挥 彻 底 排除 异 物 的 功 效 。 与 此 同 时 ， 也 可 通 过 清 除 抗 原 抗 体 反 应 形 成 于 组 织 或 细 胞 膜上 的 复 合 物 ， 造 成 炎 症 损 伤 ， 参 与 疾 病 的 形 成 过 程 。 补 体 清 除 可 溶 性 免 疫 复 合 物 ， 与 补 体 的 溶 细 胞 作 用 和 调 理 吞 噬 作 用 的 发 挥相 关 。 补 体 的 检 测 ， 主 要 是 根 据 补 体 的 抗 原 性 和 溶 细 胞 活 性 设 计 的 。 补 体 检 测的 方 法 涉 及 总 补 体 活 性 的 测 定 和 单 个 补 体 成 分 的 检 测 ， 其 中 总 补 体 活 性 测 定 ，在 临 床 应 用 广 泛 者 当 数 经 典 途 径 的 CH50检 测 法 ； 而 单 个 补 体 成 分 检 测 则 包 括 溶 血 法 与 免 疫 化 学 法 ， 后 者 可 用 于 定 量 测 定 。