水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定

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1、水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定邵基伦 环境工程专业摘要： 当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健 康。水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。所以控制污水中的 氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微 生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸 盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现 污水脱氮。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经 过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌

2、完成。硝化细菌是一类好样化能自 养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行 自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其 生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。它们能有 效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是 生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。因为硝化细菌、 亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其 影响较

3、大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为1038 C,高 于20C时硝化细菌的活性较高，但超过38C消化作用将会消失。当环境气温低于20C时， 氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的 pH 值分别为 6.08.5 和6.08.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的 浓度应当控制在1.02.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外，碳氮比、碱度等对 硝化及脱氨均有影响。本实验采用人工培养基方法富集培养硝化细菌研究了富集培养过程中硝化与亚硝化细菌的 结构和性质变化。结果表明，在25-28C，pH7. 5

4、8.5, D0 2-5mg / L，氨氮浓度100150mg /L条件下，经过19d和15d的富集培养，可以得到硝化速率为4.18mg(NH3-N)-g(MLSS)/h 和10.1mg(NH4-N)-g(MLSS)/h啲硝化细菌培养物.在这种富集培养过程中，硝化细菌培养 物的污泥色泽和结构、MLSS、SV30、SVI、硝化强度和硝化速率等均出现规律性变化且随 培养方法不同表现出明显差异。关键词：硝化细菌；反硝化细菌；脱氮；富集培养；硝化速率；活性污泥；载体Abstract： In todays world environment pollution is aggravating, especi

5、ally the water pollution has seriously affect Peoples Daily life and health. Water pollution is various factors, and ammonia nitrogen pollution in the most extensive and severe. So control of ammonia nitrogen content is sewage wastewater treatment in the important content. The basic principle of sew

6、age denitrification is the nitrogen organic wastewater by microbes function first ammoniation into ammonia, nitrifying bacteria of nitrification, will ammonia oxidation as nitrite, and continue to oxidation as nitrate. Nitrate after denitrifying bacteria against nitrification into nitrogen links suc

7、h as composition and released to the atmosphere, so as to realize the sewage denitrification. Is this a nitrification process of a intermediate link, and also an important link. Nitrification refers to the role of ammonia after microbial oxidation and the process of nitric acid based, by nitrifying

8、bacteria complete. Nitrifying bacteria is a kind of photosynthetic bacteria can fleas, including the nitrifying bacteria and nitrifying bacteria two subsets. Nitrifying bacteria can use YuanTai inorganic nitrogen compounds are also growing autotrophic, nitrifying bacteria in the life activities of s

9、ewage denitrification plays an important role. Because of nitrifying bacteria is which can sustain bacterium, the growth rate is slow, therefore nitrification, nitrosation bacteria life activities of sewage denitrification become one of the key steps. They can effectively reduce the water in ammonia

10、 nitrogen based and nitrogen content, aquaculture and environmental protection to have the important meaning. dressfying bacteria is biological nitration take off to play a major role ammonia of microbes, directly influence the effect and biological nitrification off the efficiency of ammonia. Becau

11、se nitrifying bacteria, denitrifying bacteria in the sewage and denitrification of special significance, for this kind of microbe study is widely concerned about.Ammonia and respectively based nitrosation bacteria and is the only energy denitrifying bacteria. The essential bacteria growth environmen

12、t for it to its large effect on the temperature, pH value and salinity influence is relatively minor. The most essential bacteria growth temperature right for 10 to 38 C, 20 C higher than when the activity of nitrifying bacteria are higher, but more than 38 C digestive function will disappear. When

13、the environment temperature less than 20C, ammonia transformation can be affected. Generally, appropriate denitrifying bacteria and the denitrifying bacteria growth medium pH value were 6.0 8.5 and 6.0 8.0. The water DO willaffect the good oxygen, anaerobic microbe proportion, most researchers think

14、 the concentrationshall control in DO 1.0 2.0 mg/L, less than 0.5 mg/L nitrification when significantly weakened.In addition, carbon and nitrogen, basicity on than nitrification and take off all affect the ammonia.This experiment used artificial medium enrichment of nitrifying bacteria cultivation m

15、ethod. The process of cultivation of nitration and enrichment of nitrifying bacteria and the structure and properties of change. The results show that, in 25 to 28 C, pH7.5 8.5, DO 2-5 mg/L, ammonia nitrogens 100-150 mg/L conditions, after 19 d and 15 d enrichment training, can get nitration rate fo

16、r 4.18 mg (NH3-N)-g (MLSS) / h and 10.1 mg (NH4-N)-g (MLSS) / h of nitrifying bacteria culture substance. In this enrichment process of cultivation, nitrifying bacteria culture substance of sludge colour and lustre and structure, MLSS, SV30, SVI, nitrification strength and nitration rate all appear

17、to regular change with different methods and training showed obvious difference.Key words : Nitrifying bacteria; Denitrifying bacteria； Denitrification; Enrichment training;Nitration rate; Activated sludge; carrier引言据2010年环境状况公报显示，我国环境总体形势依然十分严峻湖泊(水库) 富营养化问题依然突出，在监测营养状态的26个湖泊(水库)中，富营养化状态 的占42.3水体的富营

18、养化问题主要由水体中的总氮超标所引起由于氮元素 污染的危害，脱氮已经成为水处理和防止氮素危害的重要一步目前普遍认为， 生物脱氮是水处理中防止氮素危害最经济有效的方法之一传统生物脱氮途径一 般包括硝化和反硝化两个步骤，即在好氧条件下通过自养硝化菌的作用，将水中 氨氮(NH4+-N)转化为硝酸氮(NO3-N)或亚硝酸氮(NO2-N),然后在缺氧或 厌氧条件下，利用反硝化菌将硝酸氮和亚硝酸氮还原为氮气，达到脱氮的目的由 于两个菌的作用条件不同，这两个过程不能同时发生，只能序列进行近些年来， 不断有好氧反硝化细菌的分离报道，好氧反硝化现象的出现突破了传统理论的束 缚，使人们对生物脱氮技术的发展有了全新

19、的认识已有文献报道一些好氧反硝 化细菌同时具有异养硝化功能，这一发现为同时硝化反硝化工艺( simultaneous ntrification denitrification, SND)发展奠定了理论基础.因此异养硝化一好氧反 硝化菌正成为研究的热点文献报道的许多菌属如： Pseudomonas stutzeri,Thiosphaerpantotropha,Alcaligenes faecalis,Pseudomonas putida等都具有良 好的异养硝化好氧反硝化作用,故从我校师琴湖取水，通过富集分离到一株具 有好氧反硝化能力的细菌,该菌株命名为ADB 通过形态观察和序列分析，对菌 株AD

20、B进行初步鉴定。初步探讨了不同碳源种类、碳氮比、PH值、温度对菌株 ADB脱氨氮作用的影响为后面的实现同时硝化反硝化工艺做前期的理论研 究同时氮素是我国水体污染和富营养化的主要因素 ,生物脱氮技术因其经济、 有效、易操作、无二次污染等特点,是近年来的研究热点之一。传统的生物脱氮 技术必须经过好氧硝化和厌氧反硝化两个相对独立的反应过程 ,好氧反硝化与传 统的厌氧反硝化脱氮相比,具有独特的优势:一方面,在有氧条件下进行反硝化,硝 化和反硝化作用可同时在一个反应器中进行,设备与操作成本大幅下降;另一方面, 硝化作用的产物可以直接作为反硝化作用的底物,避免抑制硝化作用,使得硝化和 反硝化进程加剧。现已

21、发现一些好氧反硝化细菌,如Alcaligenes faecalis, Pseudomonasputida和P. stutzeri等，但现有报导的好氧反硝化细菌反硝化活性都较 弱,无法满足实际污水的生物脱氮需要,因而高效好氧反硝化细菌的筛选是一项重 要基础性工作,本研究拟从氮素严重积累的水产养殖水体、污泥及农村河道中筛 选高效好氧反硝化细菌,并初步探索筛选获得的菌株在不同培养条件下的反硝化 特性,以期为污水生物脱氮技术的应用提供科学依据。1. 实验部分1.1 材料和方法1.11菌种来源 好氧反硝化细菌ADB菌种为本实验室从我校师琴湖水中分离获 得1.12培养基的制备反硝化细菌富集分离培养基成分(

22、g/L)：为Na2HPO47H2O 为 7.9； KH2PO4 为 1.5； NH4C1 为 0.3； Mg2SO4。7H2O 为 0.1； 丁二酸钠为 4.7； KNO3 为 2； NaNO2 为 0.5；微量元素溶液为 2mL。微量元素溶液成分 (g/L)： EDTA 为 50.0； ZnSO4 为 2.2； CaCl2 为 5.5； MnC124H2O 为 5.06； FeSO47H2O 为 5.0； CuSO45H2O 为 1.57； CoC126H2O 为 1.61； PH 为 7.0-7.5 反硝化测定培养基：不添加 KN03和NH4C1，初始亚硝酸氮质量浓度为 100mg/L，其

23、它与反硝化细菌富集分离培养基基本一致。 脱氨氮测定培养基不添加 KNO3 和 NaNO2， （NH4）2SO4 代替 NH4Cl， （NH4）2SO4 和丁二酸钠含量随实验内容而变其它与反硝化细菌富集分离培养基 基本一致。1.2实验试剂 无氨蒸馏水（淮安化工二厂）、氢氧化钠（AR）（上海试剂四厂）、 碘化钾（AR）（南京化学试剂一厂）、碘化汞（AR）（浙江临平化工试剂厂）、酒石酸钾 钠（AR）（南京化学试剂一厂）、氯化铵（AR）（浙江临平化工试剂厂）、盐酸（GR）、琼 脂（江苏疾病预防控制中心微生物试剂厂）1.3 实验仪器 恒温培养箱（上海虹光化工厂）、灭菌炉（上海泗联化工厂）、试管、 250

24、m 1锥形瓶（南京化学试剂一厂）、培养皿、分析天平（上海康华仪器厂）、电炉（上 海康华仪器厂）、酒精灯（上海虹光化工厂）、接种环、分光光度计（上海虹光化工 厂）、电子显微镜（上海康华仪器厂）2. 实验方法2.1 反硝化细菌的分离与鉴定将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入反硝化菌液体培养基和硝 化菌液体培养基，放在24C地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上 进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。2.2形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。（ 2）镜检观察：单染色法（3

25、）在培养液中加入格利斯试剂，反硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化 菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。2.3细菌的纯培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28C培养，200 转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。（2）发酵培养：将培养5天的种子加入发酵罐中，于20-28C培养，其中pH控制 在6.0以上。每隔12小时取样测亚硝酸根浓度和菌浓度。2.3反硝化细菌的镜检 2.31试剂：生理盐水、结晶紫、卢哥氏碘液、碘化钾、碘片、95%的乙醇、二甲 苯、番红2.32仪器：光学显微镜（南京化学试剂一厂）、载玻片、盖

26、玻片（上海虹光化工厂） 2.33涂片：取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将 接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量培养物与玻片上的水滴混匀后， 在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。待涂布成一均匀的薄层后， 将盖玻片从一端缓慢的盖在载玻片上，已完全覆盖菌群为最佳2.34染色：由于微生物细胞含有大量水分，机体是无色透明的，与周围背景没有 明显的反差，必须进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能 更清楚地观察到其形态和结构。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其 他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。细菌带负电荷多， 容易与带正

27、电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。用碱性染料从一端 用滴管慢慢渗入使样品变色即可。染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。2.35干燥与镜检：涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些， 可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使 水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。最后将准备 好的样片放在显微镜下观测反硝化细菌的形态并且照下细菌的形态。见如下图：3结果与分析采用人工培养基的方式富集培养硝化细菌.对富集培养过程硝化、反硝化细菌的 形态以及培养系统生物相进行观察和比

28、较分析，结果见图1和图2。在富集培养方法中.采用生活污水作为反硝化细菌的菌种，在富集培养初期的活 性污泥絮体内可观察到线虫、钟虫、轮虫、滴虫，藻类等多种微生物，随着培养 的进行，这些微生物逐渐消失.但仍可见少量载体。在富集培养过程中菌落颜色 发生明显变化，最初为暗褐色，随着培养的进行.颜色运渐变浅，尤其是第16-19d 时变化更为明显。在添加载体的硝化细菌富集培养方法中，反硝化细菌生长环境发生了较大变化， 在富集培养初期培养物呈纯向色，随着富集培养的进行颜色逐渐变至淡黄色， 尤其是第10I2d变化明显。在培养过程中没有观察到原生动物、藻类和微型后 生动物的存在。4展望反硝化细菌在污水脱氮过程中

29、具有重要的意义，加强对反硝化细菌的研究对提高 污水脱氮水平，不断改进污水处理工艺具有重要的参考意义。近年来，我国对反 硝化细菌进行了一些分子水平的研究，还需要不断深入。第一：加强对硝化语反 硝化作用分子生态学的研究，即综合应用现代分子生物学技术，研究反硝化过程 中的微生物生态结构和生态机制，为提高污水的脱氮处理效率提供理论指导。第 二：加强反硝化作用微生物的分子生物学研究，即在理论上阐明硝化微生物在活 性污泥中的作用机制，克隆硝化过程中的相关酶的基因，通过基因的改造，改善 酶对氨的亲和力，提高反硝化作用速率和效率，从而达到较好的污水处理效果。5. 致谢我认为要想完成一篇合格的本科毕业论文，光靠

30、个人的付出还是不够的。要有来 自多方的协助，有来自老师的关怀尤其是邹海明老师对我的悉心指导、同学的帮 助还有大量实验器材的提供等等。所以我想在此感谢所有为了完成论文而不辞辛 苦的老师和同学们！想大声对你们说一声：谢谢！你们辛苦了！6. 参考文献1 Kenji FurukawaAldkoike and Masanori fujitaPreparation of Marine NitnfymgSludgeJournal of Fermentation and Bioengineering，199376（2）：134-l392 Hashimoto，Sand FurukawaK：Growth lcin

31、efic studies on organic oxidation and nitrification by activated sludge. Journal of Fermentation Technology,1982。60： 5255363 张伟.硝化细菌的富集培养及氨单加氧酶基因片段的PCR扩增.杭州：浙江大学硕士研究生论文. 2003.4 张明.硝化纸茵应用技术研究.华东师范大学博士研究生论文. 2003.5 王玮，海洋硝化细菌富集培养与固定化方法研究.青岛：青岛理工大学硕士论文. 2006.6 徐敏.硝化细菌富集培养、保存及应用基础研究.青岛：青岛理工大学硕士论文. 2007.7

32、 国家环保局“水和废水监测分析方法羚编委会.水和废水监测分析方法 （第三 版）.北京：中国环境科学出版社，2002.8 高廷耀，顾国维主编.水污染控制工程（下册九第二版北京：高等教育出版社， 1995： 182. 183. f91. Srinath, E. G. Leohr,R. C. Asee, M.。ec al., Nitrilying organism concentration and activityJournal of Environmental Engineering。 Die.。 ASCE, 1 976. 102： 449-463.9 Noda, S. Goto. K. and Sam。 A.： Regeneration of ammonium exchanged zeolite by USe of cultured marine nitrifying bacteria . Journal ofJapan Water Works Association. 1992. 61： 13-25.10 刘瑞兰.硝化细菌富集、保存及其在养殖水体中处理效果的研究.重庆： 西南师范大学硕士学位论文. 2005.11 于爱茸, 李 尤, 俞吉安. 一株耐氧反硝化细菌的筛选及脱氮特性研究 . 微 生物学杂志, 2005, 25(3): 77-81.