生物制药工艺学第13章生化药物制造工艺蛋白多肽药物
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1、 脑 垂 体 所 分泌 的 各 种 多肽 激 素 下 丘 脑 所 形成 的 激 素 释放 因 子 和 激素 释 放 抑 制因 子 脑 啡 肽 、 阿片 样 肽 及 胃肠 激 素 脑 -肠 肽 及多 肽 类 细 胞生 长 调 节 因子多 肽 类 药 物 1950s 1960s 1970s 1990s 多 肽 类 药 物 分 类 :多 肽 激 素 垂 体 多 肽 激 素 促 皮 质 素 ( ACTH) 、 促 黑 激 素 ( MSH) 、脂 肪 水 解 激 素 ( LPH) 催 产 素 ( OT) , 加压 素 ( AVP) 等 下 丘 脑 激 素 促 甲 状 腺 激 素 释 放 激 素 ( TR
2、H) 、 生 长 素 抑制 激 素 ( GRIF) 、 促 性 腺 激 素 释 放 激 素( LHRH) 甲 状 腺 激 素 甲 状 旁 腺 激 素 ( PTH) 、 降 钙 素 ( CT) 胰 岛 激 素 胰 高 血 糖 素 胰 解 痉 多 肽 胃 肠 道 激 素 胃 泌 素 、 胆 囊 收 缩 素 促 胰 酶 素 ( CCK-PZ) 、 肠 泌 素 、 肠 血 管 活 性 肽 ( VIP) 、抑 胃 素 ( GIP) 、 缓 激 肽 、 P物 质 胸 腺 激 素 胸 腺 素 、 胸 腺 肽 、 胸 腺 血 清 因 子 多 肽 类 细 胞 生 长 调节 因 子 表 皮 生 长 因 子 ( E
3、GF) , 转 移 因 子 ( TF) ,心 钠 素 ( ANP) 等 。含 有 多 肽 成 分 的 其它 生 化 药 物 骨 宁 、 眼 生 素 、 血 活 素 、 氨 肽 素 、 妇 血 宁 、脑 氨 肽 、 蜂 毒 、 蛇 毒 、 胚 胎 素 、 助 应 素 、神 经 营 养 素 、 胎 盘 提 取 物 、 花 粉 提 取 物 、脾 水 解 物 、 肝 水 解 物 、 心 脏 激 素 等 。多 肽 类 药 物 分 类 : 蛋 白 质 激 素 垂 体 蛋 白 质 激 素 生 长 素 ( GH) , 催 乳 激 素 ( PRL) , 促 甲 状 腺 素( TSH) , 促 黄 体 生 成 激
4、 素 ( LH) , 促 卵 泡 激 素( FSH) 。 促 性 腺 激 素 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 ( HCG) , 绝 经 尿 促 性 腺 激 素( HMG) , 血 清 性 促 性 腺 激 素 ( SGH) 。 胰 岛 素 及 其 他 蛋 白 质 激 素 胰 岛 素 , 胰 抗 脂 肝 素 , 松 弛 素 , 尿 抑 胃 素 。血 浆 蛋 白 质 白 蛋 白 , 纤 维 蛋 白 溶 酶 原 , 血 浆 纤 维 结 合 蛋 白( FN) ,免 疫 丙 种 球 蛋 白 , 抗 淋 巴 细 胞 免 疫 球 蛋 白 ,Veil s病 免 疫 球 蛋 白 , 抗 D免 疫 球 蛋 白
5、, 抗 HBs免 疫 球 蛋 白 , 抗 血 友 病 球 蛋 白 , 纤 维 蛋 白 原 ,抗 凝 血 酶 , 凝 血 因 子 , 凝 血 因 子 。蛋 白 质 类 药 物 分 类 蛋 白 质 类 细 胞生 长 调 节 因 子 干 扰 素 、 、 ( IFN) ,白 细 胞 介 素 1 7( IL) ,神 经 生 长 因 子 ( NGF) , 肝 细 胞 生 长 因 子( HGF) , 血 小 板 衍 生 的 生 长 因 子 ( PDGF) ,肿 瘤 坏 死 因 子 (TNF), 集 落 刺 激 因 子 (CSF), 组织 纤 溶 酶 原 激 活 因 子 (tPA), 促 红 细 胞 生 成
6、素(EPO), 骨 发 生 蛋 白 ( BMP) 。粘 蛋 白 胃 膜 素 、 硫 酸 糖 肽 、 内 在 因 子 等 。胶 原 蛋 白 明 胶 、 阿 胶 等碱 性 蛋 白 质 硫 酸 鱼 精 蛋 白蛋 白 酶 抑 制 剂 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂凝 集 素 PHA、 ConA蛋 白 质 类 药 物 分 类 多 肽 化 学 合 成 概 述合 成 原 理 : 是 一 个 重 复 添 加 AA的 过 程 , 一 般 自 C端 向 N端 合 成 。合 成 方 法 : ( 1) 液 相 合 成 ( 2) 固 相 合 成 ( 1963年 R.B.Merrifield 创 立 , 并 因 此 获 19
7、84年 获 诺 贝 尔 化 学 奖 ) Du.Vigneaud等 合 成 催 产 素 ( oxytocin,OXT , 9AA单 链 肽 )1953年 合 成 促 肾 上 腺 皮 质 激 素 ( ACTH, 39AA单 链 肽 )1963年 中 国 科 学 家 合 成 了 胰 岛 素 ( Insulin, 51AA双 链 肽 )1965年 多 肽 合 成 的 主 要 步 骤 氨 基 的 保 护 和 羧 基 的 活 化 羧 基 的 保 护 和 氨 基 的 活 化 接 肽 和 去 保 护 基氨 基 保 护 基 苄 氧 羰 基 强 酸 脱 除 叔 丁 氧 羰 基 ( BOC) 三 氟 乙 酸 ( T
8、FA) 脱 除 9-芴 甲 氧 羰 基 ( Fmoc) 碱 脱 除 多 肽 的 固 相 合 成 (Fmoc保 护 法 )( 1978年 改 进 的 方 法 , 避 免 了 强 酸 处 理 ) 原 料 选 择上 清 破 碎 提 取沉 淀 变 性 复 性 蛋 白 质 纯 化蛋白质药物纯 度 活 性 鉴 定 合 格 不 合 格 精 品 发 酵 生 物 组 织 原料选择提取 纯化 根 据 目 的 蛋 白 与 杂 质 之 间 的 差 异 进 行 纯 化 。1.根 据 蛋 白 质 的 pI的 不 同 进 行 纯 化 , 其 方 法 有 :1) pI沉 淀 法 2) pI沉 淀 法 与 盐 析 法 相 结
9、合3) 等 电 聚 焦 法 2.蛋 白 质 分 子 形 状 和 大 小 的 不 同 进 行 纯 化 , 其 方 法 有 1) 凝 胶 过 滤 2) 超 滤 法 3) 离 心 法 4) 透 析 法3.蛋 白 质 的 溶 解 度 不 同 进 行 纯 化 , 其 方 法 有 : a)盐 溶 与 盐 析 法 b) 结 晶 法 c) 有 机 溶 剂 沉 淀 法4.蛋 白 质 电 离 性 质 不 同 进 行 分 离 : 离 子 交 换 法5.蛋 白 质 功 能 专 一 性 不 同 进 行 纯 化 : 亲 和 层 析 法 、 假 亲 和 层 析 法6.蛋 白 质 在 溶 剂 系 统 中 分 配 不 同 进
10、行 纯 化 : 萃 取 法7.蛋 白 质 的 选 择 性 吸 附 的 性 质 进 行 纯 化 : 吸 附 法8.蛋 白 质 的 其 他 特 殊 性 质 进 行 纯 化 分 离 纯 化 方 法 的 选 择1.分 离 纯 化 的 早 期 使 用 方 法 的 选 择特 点 : 提 取 液 中 的 物 质 十 分 复 杂 , 目 的 蛋 白 浓 度 较 稀 。方 法 选 择 原 则 : 低 分 辨 能 力 到 高 分 辨 能 力 , 而 且 负 荷 量 较 大 为 合 适 。2.各 种 分 离 纯 化 方 法 的 使 用 程 序原 则 : 相 同 性 质 的 纯 化 方 法 一 般 不 重 复 使 用
11、 。 纯 化 方 法 顺 序 先 后 的 安 排 上 要考 虑 到 有 利 于 减 少 工 序 , 提 高 效 率 。3.分 离 纯 化 后 期 的 保 护 性 措 施4 对 每 一 步 骤 方 法 的 优 势 进 行 综 合 评 价 每 一 个 分 离 纯 化 步 骤 方 法 的 好 坏 , 除 了 从 分 辨本 领 和 重 现 性 二 方 面 考 虑 外 , 还 注 意 方 法 本 身 的回 收 率 的 高 低 。 纯 化 方 法 选 择 指 南 猪 胰 岛 素牛 胰 岛 素赖 脯 人 胰 岛 素 ( 礼 来 公 司 、 速 效 Ins) 门 冬 胰 岛 素 ( 诺 和 诺 德 公 司 、
12、 速 效 Ins ) 甘 精 胰 岛 素 (安 万 特 公 司 、 长 效 Ins)人 胰 岛 素 ( Insulin)B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29B28 A21 ;B31 ;B32 3D Structure of Insulin 胰 岛 素 二 聚 体 ( dimer) 胰 岛 素 六 聚 体 ( hexamer ) 目 前 临 床 使 用 的 胰 岛 素 来 源 动 物 胰 脏 来 源-经 动 物 胰 脏 提 取 或 适 当 提 纯 的 猪 、 牛 胰 岛 素 半 合 成 胰 岛 素-以 猪 胰 岛 素 为 原 料 , 酶 修 饰 后 得 到 人 胰 岛 素重 组 D
13、NA技 术 生 产 胰 岛 素-重 组 DNA技 术 生 产 人 胰 岛 素 、 速 效 胰 岛 素 、 长 效 胰 岛 素 1921年 -从 动 物 胰 腺 中 提 取 出 胰 岛 素 , 开 创 了 人 类 胰 岛 素 治 疗的 历 史 。1926年 -重 结 晶 胰 岛 素1930s-传 统 中 、 长 效 动 物 胰 岛 素1970s-单 峰 胰 岛 素 和 单 组 分 胰 岛 素 70年 代 末 -半 合 成 胰 岛 素1982年 -采 用 基 因 重 组 技 术 生 产 的 人 胰 岛 素 正 式 上 市 。90年 代 至 今 -重 组 人 胰 岛 素 类 似 物 成 功 研 发
14、上 市 , 包 括 超 短 效和 长 效 人 胰 岛 素 类 似 物 。 动 物 来 源 的 胰 岛 素 ( 28种 )药 品 名 称 生 产 企 业 药 品 名 称 生 产 企 业ILETIN I LILLY NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN NOVO NORDISK INC ILETIN II LILLY PROTAMINE ZINC & ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY INSULIN NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II LILLY INSULIN INSULATARD NPH
15、 NORDISK NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK) LILLY INSULIN NORDISK MIXTARD (PORK) NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC INSULIN BRISTOL MYERS SQUIBB LENTARD NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II LILLY LENTE NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II (PORK) LILLY LENTE ILETIN II LILLY REGULAR PURIFIE
16、D PORK INSULIN NOVO NORDISK INC LENTE ILETIN II (PORK) LILLY REGULAR INSULIN NOVO NORDISK INCLENTE INSULIN NOVO NORDISK INC SEMILENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY SEMILENTE INSULIN NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II LILLY ULTRALENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II (PORK) LILLY ULTRALEN
17、TE INSULIN NOVO NORDISK INCNPH INSULIN NOVO NORDISK INC VELOSULIN NOVO NORDISK INC 半 合 成 来 源 的 胰 岛 素 ( 5种 )药 品 名 称 生 产 企 业INSULATARD NPH HUMAN NOVO NORDISK INC MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS NOVOLIN 70/30 NOVO NORDISK INCNOVOLIN L NOVO NORDISK INCNOVOLIN N NOVO NORDISK INC 基 因 重 组 来 源 的 胰 岛 素 ( 27
18、种 )药 品 名 称 生 产 企 业 药 品 名 称 生 产 企 业APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG LILLY MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50 LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLY NOVOLIN N NOVO
19、 NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R( Purified) NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 PEN LILLY NOVOLOG NOVO NORDISK INC HUMULIN BR LILLY NOVOLOG MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLY VELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLY VELOSULIN BR HUMAN
20、NOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLY HUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY 1. 通 化 东 宝 1998年 12月 研 制 出 中 国 第 一 支 基 因 重 组 胰 岛 素 “ 甘 舒 霖 ” 甘 舒 霖 R- 常 规 重 组 人 胰 岛 素 注 射 液 甘 舒 霖 N- 低 精 蛋 白 重 组 人 胰 岛 素 注 射 液 甘 舒 霖 30R- 30/70混 合 重 组 人 胰 岛 素 注 射 液 ( 30%常 规 重 组 人 胰 岛 素 和 70%低 精 蛋 白 重 组 人 胰 岛 素 )2. 深 圳 科 兴 苏 泌 啉 - 常
21、 规 重 组 人 胰 岛 素 注 射 液 苏 泌 啉 恩 - 低 精 蛋 白 重 组 人 胰 岛 素 注 射 液 3. 徐 州 万 邦 万 邦 林 - 常 规 重 组 人 胰 岛 素 注 射 液 万 苏 林 猪 胰 岛 素 制 剂胰 岛 素 国 内 主 要 生 产 厂 家其 他 ( 持 有 药 品 注 册 证 ) -南 京 新 天 生 物 化 学 制 药 有 限 公 司 、 华 西 医 科 大 学 制 药 厂 、 上 海 第 一 生 化 制 药 厂 、 武 汉 生 化 制 药 厂 等 临 床 用 胰 岛 素 分 类l普 通 胰 岛 素 : 从 动 物 胰 脏 中 提 取l人 胰 岛 素l传 统
22、 中 长 效 胰 岛 素 l长 效 人 胰 岛 素 类 似 物l速 效 人 胰 岛 素 类 似 物l非 注 射 胰 岛 素 传 统 中 长 效 胰 岛 素 制 剂 低 精 蛋 白 锌 胰 岛 素 : 胰 岛 素 、 鱼 精 蛋 白 和 锌 的 结 晶 。 例 : 礼 来 公 司 , Humulin N(rDNA、 大 肠 杆 菌 ) 诺 和 诺 德 , Novolin N (rDNA、 酿 酒 酵 母 ) 胰 岛 素 锌 混 悬 液 : 精 蛋 白 锌 胰 岛 素 与 常 规 胰 岛 素 的 混 悬 液 例 : 礼 来 公 司 , Humulin 30/70 (30%常 规 胰 岛 素 , 7
23、0%精 蛋 白 锌 胰 岛 素 ) Humulin 50/50 诺 和 诺 德 , Novolin 30/70 Novolin 50/50缺 陷 :1.作 用 时 间 少 于 24小 时2.作 用 峰 值 明 显 , 夜 间 低 血 糖 危 险 性 高3.吸 收 不 稳 定4.结 霜 现 象 , 由 于 温 度 过 冷 或 过 热 导 致 胰 岛 素 再 玻 璃 瓶 壁 沉 淀 , 丧 失 活 性 速 效 胰 岛 素特 点 : 起 效 快 , 皮 下 注 射 后 15分 钟 起 效 。 达 峰 快 , 注 射 后 15分 钟 起 效 , 30 60分 钟 达 到 药 效 高 峰 。 药 效 维
24、 持 时 间 短 , 大 约 在 3小 时 左 右 ( 2 4小 时 ) 。 药 代 动 力 学 特 点 与 进 餐 后 人 体 内 源 性 胰 岛 素 分 泌 十 分 相 似 ,能 够 很 好 地 控 制 当 餐 后 血 糖 而 且 不 容 易 发 生 低 血 糖 。起 效 时 间 达 峰 时 间 峰 持 续 时 间 作 用 消 除 时 间 常 规 皮 下 Ins: 30-90min 1.5-2.5h 2-4h 6-8h生 理 Ins: 0-20min 30-45min 2-3h 3-4h B26-30对 于 胰 岛 素 结 合 于 胰 岛 素 受 体 的 功 能无 关 , 但 是 对 胰
25、岛 素 形 成 二 聚 体 有 关 的 结 构 特点 。 因 此 对 此 区 段 进 行 修 饰 将 产 生 一 些 自 聚 合能 力 下 降 但 是 与 胰 岛 素 受 体 结 合 能 力 不 变 的 新型 速 效 胰 岛 素 类 似 物 。研 制 机 理已 上 市 药 物 : Lispro 、 Aspart、 Apidra Lispro ( 赖 脯 胰 岛 素 , Humalog ) 是 第 一 个 用 于 临床 的 速 效 胰 岛 素 类 似 物 ,由 美 国 礼 来 公 司 研 制 生 产 , 将 人 胰岛 素 的 B28与 B29位 的 氨 基 酸 对 换 。 。 Aspart( 门
26、 冬 胰 岛 素 , Novolog ) 由 丹 麦 诺 和 诺 德 公司 研 制 生 产 , 结 构 与 人 胰 岛 素 的 区 别 在 于 用 天 冬 氨 酸 取代 了 B链 28位 上 的 脯 氨 酸 。APIDRA ( 赖 谷 胰 岛 素 , Apidra ) 安 万 特 公 司 研 制 ,以 赖 氨 酸 和 谷 氨 酸 分 别 取 代 了 人 胰 岛 素 B3位 的 天 冬 氨 酸和 B29位 的 赖 氨 酸 。 长 效 胰 岛 素 -人 胰 岛 素 类 似 物1. 甘 精 胰 岛 素 ( glargine ) : 商 品 名 Lantus-甘 氨 酸 替 代 胰 岛 素 A链 21
27、位 门 冬 氨 酸 、 并 在 B链 末 端 增 加 两 个 精 氨 酸 。 使 胰 岛 素 结 合 更 多 带 正 电 的 氨 基 酸 残 基 , 改 变 等 电 点 , 使 等 电 点 由 5.4上 升至 中 性 。 这 样 , 胰 岛 素 类 似 物 在 酸 性 条 件 下 可 溶 , 在 生 理 的 近 中 性 条 件 下 结晶 。2. Insulin Detemir: 商 品 名 Levemir -胰 岛 素 B链 29位 赖 氨 酸 侧 链 通 过 酰 基 化 连 接 一 个 N-16-烷 基 酸 的 14碳 游 离 脂 肪 酸 该 游 离 脂 肪 酸 能 与 白 蛋 白 结 合
28、, 延 缓 与 胰 岛 素 受 体 结 合 , 从 而 延 长 其 半 衰期 。 Insulin Detemir( Levemir )诺 和 诺 德 公 司 研 制 glargine ( Lantus)安 万 特 公 司 研 制 胰 岛 素 肺 部 吸 入 制 剂 -Exubera 辉 瑞 、 万 安 特 以 及 Nektar 共 同 研 发 于 2006.1.27被 FDA批 准 一 种 作 用 快 的 胰 岛 素 干 粉 吸 入 剂 适 用 于 餐 前 给 药 , 其 胰 岛 素 吸 收 具 有速 效 化 的 特 征 胰 岛 素 制 备 工 艺 以 动 物 胰 脏 为 原 料 提 取 胰
29、岛 素 -酸 醇 提 取 法 传 统 胰 岛 素 -猪 、 牛 胰 脏 提 取 , 只 经 一 步 重 结 晶 单 峰 胰 岛 素 -凝 胶 过 滤 纯 化 单 组 分 胰 岛 素 -凝 胶 过 滤 、 离 子 交 换 纯 化 半 合 成 胰 岛 素-以 猪 胰 岛 素 为 原 料 , 酶 修 饰 后 得 到 人 胰 岛 素重 组 DNA技 术 生 产 人 胰 岛 素 AB链 合 成 : 分 别 表 达 AB链 , 化 学 方 法 连 接 逆 转 录 法 : 表 达 胰 岛 素 原 , 酶 切 得 到 重 组 人 胰 岛 素 Ins的 性 质 Insulin crystas 酸 醇 提 取 法
30、 提 取 动 物 胰 岛 素 注 意 事 项 ( 1) 原 料 的 质 量 和 预 处 理 ( 2) 在 上 述 工 艺 中 要 注 意 每 一 步 产 品 的 回 收 ( 3) 产 品 的 纯 度 ( 4) 浓 缩 酶 促 半 合 成 人 胰 岛 素 重 组 DNA技 术 制 造 人 胰 岛 素 1.AB链 合 成 法 : 以 人 工 合 成 的 人 胰 岛 素 A链 和B链 基 因 分 别 表 达 A链 和 B链 , 然 后 再 组 合 起来 。2.反 转 录 酶 法 : 通 过 胰 岛 素 原 的 cDNA合 成 ,表 达 产 物 是 胰 岛 素 原 , 经 工 具 酶 切 开 , 除
31、去C-肽 得 人 胰 岛 素 。 Ins A链 Ins B链转 化 大 肠 杆 菌发 酵 A链 B链纯 化 二 硫 键 活 性 胰 岛 素 AB链 合 成 人 胰 岛 素 质粒 Ins mRNA反 转 录Ins cDNA转 化 大 肠 杆 菌PCR连 接胰 岛 素 原活 性 胰 岛 素 二 硫 键 酶 切 提 取 质 粒限 制 性 内 切 酶 酶 切 反 转 录 酶 法 合 成 人 胰 岛 素 多 肽 的 液 相 合 成缺 点 : 操 作 步 骤 繁 琐 , 需 经 多 次 分 离 提 纯 , 最 后 产 率 不 高 。B 氨 基 保 护 剂 , 如 :氯 甲 酸 苄 酯 、 氯 甲酸 叔 丁 酯 等 A 羰 基 活 化 试 剂 , 如 :PCl5、 SOCl2等H2NCHCOOHR 保 护 氨 基B B HNCHCOOHR 活 化 羧 基A B HNCHCOR A引 入 第 二 个 氨 基 酸侧 链 为 R HNCHCORB NHCHCOOHR 活 化 第 二 个 羧 基A 第 三 个 氨 基 酸 重 复 上 述 反 应 B 多 肽 H2, Pd脱 保 护 基 多 肽 多 肽 的 固 相 合 成 (Boc保 护 法 )( 1963年 R.B.Merrifield 创 立 , 并 因 此 获 1984年 诺 贝 尔 化 学 奖 )
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