基因工程考试重点

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1、Genetic engineering :对携带遗传信息的分子(DNA )进行设计和改造的分子工程，包括基因 重组，克隆，表达，其核心是构建重组体的DNA 技术。限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease) 一类能识别 dsDNA 分子内部的特定核苷酸序列， 并由此切割 DNA 双链结构的核酸酶。粘性末端(Cohesive terminus (end)：在对称 轴 5侧或 3切割底物, 使得 DNA 双链交错断 开，产生具有互补碱基的单链延伸末端结构，它 们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 同裂酶(Isoschizomer)来源不同的II型限制性 内切酶，具有相

2、同的识别序列。同尾酶(Isocandamers).来源不同，识别序列也 各不相同，但酶切以后的残端相同。质粒，Plasmid：细胞染色体外能自主复制的小 型环状 DNA 分子。免疫共沉淀，Co-immunoprecipitaion：以抗体 和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋 白质相互作用的经典方法。转化：大肠杆菌捕获质粒 DNA 的过程。末端脱氧核苷酸转移酶：TdT，是一种无需末端 的 DNA 聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到 DNA 分子 的 3羟基端。酶的星号活性：某些 II 型限制性核酸内切酶对 反映条件的要求比较苛刻，当反应条件发生变化 后，酶的特异性发生相应的改变。a-互补：虽然载

3、体和宿主各自单独表达的a和 w片段均无0 -半乳糖昔酶活性，但二者的产物 却可以融为一体，形成具有0半乳糖昔酶活性的 蛋白质，这种 lacZ 基因缺失各一部分突变体的 互补叫做a -互补。柯斯质粒：粘粒，一类人工构建的含有入DNA的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 感受态细胞：处于能吸收周围环境中 DNA 分子的 生理状态的细胞。双向凝胶电泳技术： 现根据蛋白质的等电点在 PH 梯度胶中等点聚焦，然后按照它们的分子量 大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离，从而最大 限度的分离蛋白质的方法。RNA 干扰：是指通过翻译 RNA 与正义 RNA 形成的 双联 RNA 特异性的一

4、致靶基因的转录后表达的 现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有同源 序列的双链RNA,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解，达到阻止基因表达的目的。原位杂交：将标记的核酸探针与固定在细胞或组 织中的核算进行杂交。包涵体：在大肠杆菌中外源蛋白的过量表达，造 成的一个问题是大量的外源蛋白会聚集形成不 溶于水的聚合体。Southern 杂交:将电泳分离的 DNA 片段转移到一 定的固相支持物上的过程。Nouthern 杂交：将 RNA 样品通过琼脂糖凝胶电 泳进行分离，在转移到硝酸纤维素膜上，用同位 素或生物素标记的DNA或RNA特异性探针对固定 于膜上的 mRNA 进行杂交，洗脱除去非特异性的 杂交

5、信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基 因的表达组织。多克隆位点(MCS)：载体上人工构建的。一段短 的 DNA 序列，携带有许多不同限制性内切酶识别 位点。RNA 酶保护分析法： RNaseA 和 RNaseT1 专一水解 杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测 RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护。 核酸酶 S1 保护分析法：核酸酶 S1 在一定条件下 专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不 水解 DNA 探针与待测 RNA 杂交形成的杂交体，使 杂交分子得到保护。穿梭载体：能够在两类不同宿主中复制，增殖和 选择的载体。巢氏PCR，NestedPCR： 种变异的聚

6、合酶链反 应(PCR),使用两对PCR引物扩增完整的片段。 酵 母 菌 人 工 染 色 体 ， Yeast artificial chromosomes:是利用酿酒酵母的染色体的复制 元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中 启动子，Promoter： DNA上能与RNA聚合酶结合 并能起始 mRNA 合成的序列起始位点一般为嘌呤 逆转录PCR,Revere -PCR：提取生物体的总RNA， 反转录成总 cDNA 做模板进行 PCR 扩增。1、基因工程的基本操作程序？切接转增检1、目的基因的获取，从复杂的生物基因中， 经过酶切消化或 PCR 扩增等步骤，分离出带有目 的的基因的 DNA 片段

7、。 2、重组体的制备，将目 的基因的 DNA 片段插入到能自我复制并带有选择 标记的载体分子上。 3、重组体的转化，将重组 体转入适当的受体细胞中。 4、重组子的培养。 在相应的受体细胞中扩增重组子。 5、克隆的鉴 定，挑选转化成功的细胞克隆(含目的基因)。6、目的基因的表达，使导入寄主细胞的目的基 因表达出我们所需要的基因产物。2、Southern 印迹杂交基本步骤？1、待测核酸样品的制备。 2. 待测 DNA 样品的电 泳分离 3. 凝胶中 核 酸的 变性 (碱变性) 4. Southern 印迹。常用方法：毛细管虹吸印迹法， 电转法，真空转移法。 5. Southern 杂交：预杂 交杂

8、交洗膜 6、杂交结果检测。3、质粒 DNA 作为载体的条件？1、具有复制起点：可以在宿主细胞中自主复制。2、具有抗菌素抗性基因：至少有一个选择性标 志，两个以上最好。 3、具有若干限制酶单一识 别位点：背景清楚，具有多克隆位点。 4、多克 隆位点应该位于某选择性标志中。 5、具有分子 量小，高拷贝数。4、基因组文库与cDNA文库的cDNA 文库是指以 mRNA 为模板，在逆转录酶的作 用下形成的互补DNA。以细胞的全部mRNA逆转录 合成的cDNA组成的重组克隆群体成为cDNA。 基因组文库指的是将某种生物的基因组DNA切割 成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入 宿主细胞，进行克隆得到的

9、所有重组体内的基因 组DNA片段的集合，它包含了该生物的所有基因。 区别：（1）基因组文库中包含了所有的基因，而 cDNA 文库只包含表达的基因，缺乏内元和调节序 列，因此在研究基因结构时没有多大用处。（2） cDNA 文库代表了 mRNA 的来源，其中一些特定的 转录本丰富而另一些很少，所以存在丰度的差别 而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因 序列。（3）从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些 共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基 因；基因组文库中不能。（4）基因组文库由于含 有不表达序列，因此比 cDNA 文库大。（5） mRNA 在不同的组织之间存在丰度的差异，因此 cDNA

10、 文库的在构建时对于 mRNA 含量较少的就比较困 难；而基因组文库不存在这样的问题。5、外源DNA和载体的连接1、粘性末端：DNA连接酶把相互靠近的5端磷 酸与 3端羟基连接在一起2、平末端的链接用T4DNA连接酶直接连接 人工加尾形成“粘性末端”同聚物加尾：DNA末 端转移酶分别给载体和插入片段加上互补的同 聚物尾巴，以使他们有效的连接。衔接物连接： 用T4DNA连接酶连接到DNA分子的两端，直接成 为人工粘性末端DNA接头连接法3、PCR产物的连接。在引物的5端设计酶切 位点与T载体直接连接（利用TaqDNA连接酶）6、蓝白斑筛选pUC19 携带细菌 lac 操纵元件中的 lacI 和

11、lacZ 基因编码，当培养基中含有诱导物IPTG 和Xgal时，lacZ基因诱导表达产生具有活性 的0 -半乳糖苷酶，半乳糖苷酶水解Xgal而使菌 落呈现蓝色。在lacZ中间插入了一段人工设计和合成的 DNA 序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切 酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插 入此位置，当外来序列插入后则破坏了 lacZ编 码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈现白色， 这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有 何不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白 斑筛选法。7、外源基因在原核细胞中表达的必要条件 1、通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指 导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； 2

12、、外源基因 不能带有内含子，因而必须用 cDNA 或全化学合 成基因，而不能用基因组DNA； 3、必须利用原核 细胞的强启动子和 SD 序列等调控元件控制外源 基因的表达； 4、外源基因与表达载体连接后， 必 须 形 成 正确的 开放阅读框 （open reading frame， ORF）； 5、蛋白不需要翻译后加工过程 6、 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达， 防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。8、小鼠实验 原理：显微注射法是在显微镜下将体外构建的外 源目的基因，用注射针注射到动物受精卵中，使 之与动物基因整合，从而得到转基因动物的方法 步骤：（1）目的基因的制备：构建目的基因

13、的表 达载体：目的基因的表达载体：目的基因包含完 整的，顺势调控序列，终止子（加尾信号）。 DNA 浓度：1一3p g/ml（2）小鼠的准备和要求超排及受精卵的准备 I、选择四到六周的小鼠，用孕马血清促性腺激素和人绒毛促性腺激素先后进行腹腔注射，做超 排卵处理。II、注射后10到13个小时超排卵， 每个母鼠与一个公鼠交配。假孕鼠的准备：通 过注射 PMSG 和 hcG 诱导产生，再与结扎的公鼠 交配。（3）受精卵的分离 处死超排卵的小鼠，从 输卵管膨大部分取出受精卵。解散卵丘细胞， 清洗受精卵。在显微镜下确认和选择受精卵。（4）显微注射：将受精卵置于培养品或玻璃片 的液滴内，用吸持针吸住受精卵

14、，将外源基因注 入受精卵的雄原核内。（5）受精卵的移植：将假孕小鼠麻醉，在腹部 下方与最后一根肋骨平行的地方开一个小口，在 输卵管壶口处用微吸管将注射过的受精卵移入， 缝合伤口。按常规饲养， 20 天前后，后代产出。9、质粒：Ori :复制起点Ampr:氨苄青霉 素抗性基因 LacZ :大肠杆菌0 -半乳糖苷酶 编码的a -肽的DNA序列MCS :多克隆位点 Kanr:卡那霉素抗性基因 Tetr:四环素抗性 基因 Cml:氯霉素Sm:链霉素 Su:磺胺10、T4 DNA 聚合酶的基本特性？基本用途？1、有3-5的核酸外切酶活性和5-3的 DNA 聚合酶活性。 2、在无 dNTP 时，可以从任何

15、 3 -OH端外切。3、在只有一种dNTP时，外切至 互补核苷酸。4、在四种dNTP均存在时，聚合活 性占主导地位。基本用途:切平由核酸内切酶产 生的3粘性末端；DNA片段的同位素末端标记。11、T 载体现象：普通的Taq酶会自动给PCR产物的3末 端添加一个 A。原理：普通的Taq酶能够在PCR产物3末端加 上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3T 突出端的线性载体，在连接酶作用下，可以快 速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载 体 MCS 中。 操作最简单,快速和高效,是 Taq 聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。用于PCR产物 的克隆和测序。TA 克隆的优点：不需使用含限制酶序列

16、的引物;不需把PCR产物做平端处理； 不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克 隆。 TI 质粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒,大 小因种类而异，在 200250kb 之间。当农杆菌 同植物接触时，TI质粒中有一段DNA，大约在 15kb-30kb,称为T-DNA,能转移并整合到植物基 因组中，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。 Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约23kb。能转移到植物细胞内的这一小段DNA片段称为T DNA。12、MDM2 1）分别提取野生型突变型 MDM2 基因 转录出的mRNA，进行Northern杂交，其间用RNA 酶进行保护实验，通过实验结果定量分析两 mRN

17、A 的表达量，若突变的MDM2基因表达出的mRNA量 多，则说明启动区的突变导致MDM2的mRNA表达 水平提高。2）再分别提取野生型突变型MDM2基因翻译出的 蛋白质，与 MDM2 的单克隆抗体进行 Western 杂 交，通过试验结果分析比较两种蛋白质有无差异 从而验证启动子活性是否发生变化，若突变后的 MDM2 表达的蛋白质明显多于野生型，说明启动区 SNP 309的突变可以导致MDM2基因的过表达。 （3）将获取的野生型的突变型的 DNA 基因片段 分别于待测蛋白质进行凝胶迁移阻滞实验，看两 组 DNA 序列与 SP1 集合紧密与否，若突变后结合 得多，说明MDM2突变后可增加SP1C

18、转录激活因 子的亲和力。（4）向两种含MDM2基因的小鼠DNA中转入以一 段与内源靶基因有同源序列的双链RNA进行RNA 干扰实验，从而诱导内源靶基因 mRNA 降解，比 较两结果，若突变型的 mRNA 仍有活性和转录产 物，则说明启动子活性发生变化。（5）real-timePCR（Taqman）对两种 mRNA 进行， 以确定 mRNA 的表达量。（6）chip体内确定与SP1相互作用的DNA序列。 质粒4C、30min： 0C时，Ca 2+ 能与加入 的 DNA 分子结合，形成抗 DNase 的羟基磷 酸钙复合物，吸附在胞膜的外表面。（2）热 激42C、1min： 42 C热激处理，细胞膜的 液晶结构发生扰动，出现间隙，细胞吸收外 源DNA。（3）恢复37C、30min：转换后的细 胞通常在37C培养在营养液60 - 90分钟使 质粒成为建立和允许表型表达的特征。（4） 在选择性培养基上培养37C、16h：选择出 包含有质粒的细菌，并使其繁殖。13、基因转移过程中每一步的目的：（1）加