通过原位易错PCR一步构建基因突变文库

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1、通过原位易错PCR 步构建基因突变文库王未未 2 张永昌 2 刘明杰 2 邵蔚蓝 1*【摘 要】主要介绍一种通过原位易错 PCR 构建随机突变文库的新技术。本实 验室最近发表的一项国际专利中，利用来源于海栖热孢菌的极耐热性 DNA 连 接酶，在传统 PCR 循环中加入一个连接步骤，即变性退火延伸连接的 四步循环法PCR，从而实现环状质粒的PCR指数扩增(PPCP)。原位易错PCR 中所用引物为一段线性双链DNA，它含有与模板质粒不同的筛选标记，产物转 化宿主菌后，模板质粒在筛选平板上被直接剔除。筛选到的阳性突变子可用作 模板直接进入突变文库的再次构建，通过筛选获得二级或多级累加的正突变。 利用

2、这种方法构建了一个木聚糖酶基因和一个纤维素酶基因的随机突变文库， 并筛选出具有正向突变的蛋白，证明以PPCP为基础的原位易错PCR技术，为 基因定向进化提供了一种快速有效的随机突变文库构建的新方法。期刊名称】微生物学通报年(卷),期】2014(041)004总页数】6【关键词】定向进化，随机突变文库，原位易错PCR，环状质粒扩增(PPCP) 基因定向进化已经成为蛋白质工程中的一项重要技术。体外定向进化不仅为研究酶的底物特异性和确定酶的催化活性位点、改善酶的热稳定性以及提高酶的 作用温度等方面提供了强有力的手段，而且有助于了解蛋白结构与功能之间的 关系1-5。在分子生物技术的发展过程中人们不断地

3、发展基因体外进化和重组 的方法，现在已经建立了多种用于构建随机突变文库的方法6。最常用的随机突变的方法是易错PCR7。其原理是在PCR过程中通过调整 Mg2+和Mn2+浓度等因素，提高Taq酶在扩增过程中引入错配碱基的频次， 导致目标基因的扩增产物发生适量的随机突变 8。早期的通过易错 PCR 构建 突变文库的步骤包括： 以目标基因为模板在易错条件下进行PCR，扩增出 含有错配碱基的突变基因；(2) 对易错 PCR 产物和表达载体进行酶切；(3) 用 DNA 连接酶将突变基因连接到表达载体上；(4) 将重组的表达载体导入宿主细 胞，获得带有各种不同突变基因的重组细胞群体，即基因突变文库。构建一

4、个 多样化的基因突变文库，需要从成千上万个转化子中筛选出所需要的正突变基 因；上述方法就显得很繁琐，工作量很大9-12。另外，用 Taq 酶进行的易错 PCR会在DNA链的3末端带一个多余的碱基，因此在克隆前还需要修补DNA 链或去除此碱基13。而且通过这种方法构建的文库中常常会产生不带有目的 基因片段或是带有多个目的基因片段的质粒 14。因此早期发明的突变文库的 构建方法步骤繁琐、效率低下。为了提高构建基因突变文库的效率，Miyazaki和Takenouchi于2002年提出 特大引物全质粒扩增法(Mega-WH0P)15 ; Wei等2004年对这个技术进行 了改进和发展16。该扩增方法以

5、随机突变后的目标基因作为双链互补的引物 对(即特大引物， Megaprimers) ，以含有原始基因的表达质粒为模板(将此模板 质粒甲基化)，采用高保真DNA聚合酶进行PCR，扩增出质粒的全长片段；再 用 DpnI 酶处理，将甲基化了的模板质粒降解，而新扩增出的质粒因为没有被 甲基化，所以被完整保留。由于没有 DNA 连接酶存在，利用引物和质粒模板 单向延伸产生的线性 DNA 新链不能作为模板进行下一轮的扩增， Mega- WH0P 法不能实现指数扩增；此外，这种方法在转化突变产物前还需要使用类 似于DpnI这样的酶来进行一个模板消化的过程，步骤繁琐。为解决以上问题，本文介绍一种新型的通过原位

6、易错 PCR 构建随机突变文库的 方法，为广大科技工作者提供一个更为方便快捷的构建随机突变文库的方式。1 原位易错 PCR (In situerror-prone PCR)技术原位易错 PCR 技术是本实验室最近发表的一项国际专利中公布的一种最新方法(PCT专利公开号：US-2012-0004142-A1)17。该发明专利的主要创新点包 括：(1) 用一种极耐热性 DNA 连接酶，在传统 PCR 循环中加入一个连接步骤， 即“变性退火延伸连接”的四步循环，从而实现环状质粒的 PCR 指数 扩增(PPCP)；PPCP和易错PCR相结合，在表达载体中对目标基因进行原 位易错PCR，产生带有随机突变

7、基因的环状质粒文库；(3)在原位易错PCR过 程中更替筛选标记，产物与模板在平板筛选中自行分离。通过原位易错 PCR 进行基因定向进化的基本步骤如图 1 所示，将目标基因克隆 到表达载体中构建成表达质粒；同时，从序列互补但是带有不同抗药基因的载 体质粒中扩增出线性载体DNA ；再以表达质粒为模板，线性载体DNA作引物， 利用 TaqDNA 聚合酶在易错条件下对表达质粒中的目标基因进行延伸；再通过 极耐热性连接酶的连接作用，扩增出带有突变基因的可直接用于转化的环状质 粒，实现通过易错 PCR 一步构建基因突变文库。这种方法省略了限制性酶切、酶连等繁琐且低效的操作，可以用 PCR 产物直接 进行转

8、化。另外，由于引物片段中的抗性基因与 PCR 反应中加入的模板质粒所 带的抗性基因不同，无需对模板质粒进行降解，可直接将 PCR 产物转化后通过 不同的筛选标记选择性地培养含突变基因的转化子，将基因突变产物与原始模 板分离，完全排除模板质粒对转化的影响。2原位易错PCR技术的特点2.1原位易错PCR与MegaWHOP的不同之处原位易错PCR和MegaWHOP两种方法虽然都要用到易错PCR技术，但是它 们在本质上有所区别(表 1)。虽然 MegaWHOP 的试剂盒已经在美国市场上销 售，其方法并不符合 PCR 的基本原理；由于非指数扩增，并且主要产物不是双 链环状的 DNA，MegaWHOP 的

9、效率势必走低。原位易错 PCR 因基因在表达 载体中的原位被诱导随机突变而得名，所用的引物是通过高保真性扩增的同源 载体的线性双链DNA ;相对于MegaWHOP的特大引物(Megaprimer)而言， 原位易错 PCR 所用的引物可谓“超(级)大引物”，在国际专利中被称为载体引 物(Vector-primer)。“超大引物”与“特大引物”之间的另一个区别在于超大引物具有通用性。Mega-WHOP 中所用的特大引物必须针对目标基因及易错条件特别制备，适 宜的片段大小为0.2-1.0 kb;原位易错PCR中所用的“超大引物”是一个载体 系列的公共序列，不论克隆到载体中的是哪一个基因，都可以用同一

10、种引物进 行原位易错PCR。原位易错 PCR 引物的通用性和操作的简易性为我们带来更大的便利是正突变的 多轮叠加。如图2所示，当备有两套带有不同筛选标记(如Ampr或Kanr)的超 大引物时，可以轮番运用这两套引物，在筛选到正突变基因的基础上继续进行 随机诱变和筛选，获得二级或多级累加的正突变。2.2原位易错PCR的技术要点环状质粒的PCR扩增(PPCP)技术中所使用的DNA连接酶需要有高度的热稳定 性。经过研究，来自极端嗜热菌Thermotoga maritima(Tma)的DNA连接酶 在95 C的半衰期超过30 min，适合用于PCR过程18。TmaDNA连接酶只 对粘性末端有连接作用，

11、对平端则没有连接作用，因此此酶在反应中只将 PCR产物连成环状，不会对双链的超大引物进行相互连接或自身环化。TmaDNA连 接酶连接过程中需要二价离子如Mg2 +、Mn2+和Ca2+等的参与；其中添加 Mn2+既可以增强连接作用，也是易错PCR常用的诱导碱基错配的条件。值得 注意的是，此酶在反应过程中需辅酶NAD+，因此，PPCP反应体系中一定要 添加 NAD+。超大引物和普通PCR引物的要求一样，要求3端的序列具有较强的特异性。因 为充当超大引物的双链 DNA 片段变性解链后，正负链各自与互补的模板链退 火成为引物，所以这段双链 DNA 的两端序列都应当具有特异性。设计超大引 物时应尽量避免

12、在末端使用非编码区的常见序列，如很多基因共有的类似启动 子、终止子、转录起始位点至起始密码子之间的引导序列等。超大引物可以通 过 PCR 方法合成：以载体质粒为模板，合成一对普通引物，用高保真性且产生 平末端的 DNA 聚合酶，如 Pfu 和 Pyrobest 等来扩增载体上的相应区域，包括 选择标记的编码基因及两侧的其余序列。非常重要的是， PCR 扩增的超大引物 的5端必需经过多聚核苷酸激酶进行磷酸化处理，才能在原位易错PCR中实现 新链的首尾连接从而产生环状 DNA。原位易错 PCR 过程中，“变性退火延伸连接”四步循环的温度是个有 趣的问题。由于使用的引物非常大：除了筛选标记基因以外，

13、筛选标记的上游 和下游各有几百个与模板序列互补的碱基，其退火温度可高于 65 C；Taq 酶 的最适聚合温度为72 C,但是在60 C也有较高的活性；TmaDNA连接酶的 最适连接温度是60 C,但是在70 C的活性高达最高活性的80%18。因此，原位易错 PCR 过程中除变性温度为 94 C 以外，退火、延伸与连接的温度非常 接近，都可以在65-72 C之间选择，甚至可以合并为一步任其连续进行。有效的平板筛选技术或高通量筛选方法是利用原位易错 PCR 技术进行基因定向 进化的必要条件。对于许多酶基因实施定向进化，平板筛选技术的缺乏是主要 瓶颈问题，但是这个问题不在本文讨论之列。3 原位易错

14、PCR 应用实例在中国发明专利(ZL 200910025925.0)文献中介绍的实例包括一个木聚糖酶和一个纤维素酶基因的定向进化过程和试验条件19。实例中采用 pHsh 系列载 体构建表达质粒，其优点包括：(1) 载体质粒小，转化率高；(2) 载体系列中有 不同筛选标记供选择；(3) 该系统质粒为温控型，可以通过在不同温度下培养来 控制表达水平20。试验流程如图 1 所示，实验者首先将嗜热疏棉状丝孢菌的 木聚糖酶基因 xynA 和海栖热袍菌纤维素酶基因 celB 分别克隆到带有抗药基因Ampr 的载体 pHsh-amp (Gen-Bank accession No. FJ571619)中构建成

15、表达 质粒pHsh-xynA21 和pHsh-celB ；再用一对小引物扩增同一系列的带有抗药 基因 Kanr 的载体 pHsh-kan (GenBank accession No. FJ571619)，产生的线 性dsDNA经过磷酸化即可用作超大引物。原位易错PCR在20 pL反应体系中进行，含有pHsh-xynA或pHsh-celB模 板DNA 30 ng带有Kanr的超大引物DNA 200 ng , TaqDNA聚合酶0.5 U ,极耐热性 TmaDNA 连接酶 0.1 pg,以及 0.2 mmol/L dNTPs , 2.0 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L MnCl2

16、, 0.5 mmol/L NAD+ 和 PCR 缓冲液。这次试验 中采用的 PCR 循环程序为：95 C 5 min;94 C 1 min,72 C 1.5 min,60 C 2 min,共15个循环；60 C 10 min。琼脂糖凝胶电泳分析结果表明， 加入 TaqDNA 聚合酶和 TmaDNA ligase 的 PCR 反应中,环状质粒条带中DNA 量有明显的提高19。PCR 产物转化 E.coliJM109 感受态细胞 （Promega Corp，Madison，WI，USA），将pHsh-xynA的易错PCR产物涂布在含有2%木聚糖和卡那霉素的 LB培养基平板上，将pHsh-celB的

17、易错PCR产物涂布在含有2% CMC和卡 那霉素的LB培养基平板上，分别放置在30 C恒温培养箱中培养10 h后转到 42 C恒温培养箱中进行诱导表达5-6 h20（图3），菌落周围的透明圈或凹陷 圈的大小表明基因突变导致酶活性发生很大的变化。4 总结自 1993 年第一次成功运用易错 PCR 以来22，在短短的十几年中，各种进化 方法层出不穷。文中介绍的原位易错PCR方法适用于任何可用于克隆的表达载 体，最好使用能够在大肠杆菌中表达的载体。已知的适用于此方法的选择标记 也有很多，比如文中所使用的抗性基因。同样，需要突变的目的基因也可以是 任何编码序列。可以是一个蛋白的全长编码序列，也可以是一

18、段 RNA 序列或 一段调控序列等。此方法中连接反应和 PCR 反应同步进行，建议参考文中提供的反应温度设定热循环程序。MnCl2浓度与易错PCR的突变频率相关，推荐浓度范围为0.05- 0.50 mmol/L，建议对小于1 kb的目标基因采用较高Mn2+浓度，对大于1 kb的基因适当降低其浓度。极耐热性TmaDNA连接酶和NAD+按照文中实例 用量使用，其他酶和试剂浓度按常规 PCR 条件使用。此方法的反应条件需要根 据具体情况，比如突变基因的大小、类型或研究者需要的突变率进行微调，并 没有具体的、通用的标准，这可能需要使用者根据实际情况对反应条件进行优 化。突变子的筛选方法也因目标基因性质

19、而异，与本技术没有直接关系。参考 文献：1 Chirumamilla RR, Muralidhar R, Marchant R, et al. Improving the quality of industrially important enzymes by directed evolutionJ. Molecular and Cellular Biochemistry, 2001, 224(1/2)： 159-168.2 Cherry JR, Fidantsef AL. Directed evolution of industrial enzymes： an updateJ. Curren

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