《细菌感染实验诊断》PPT课件

《《细菌感染实验诊断》PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《细菌感染实验诊断》PPT课件（73页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、第 二 章 细 菌 感 染 实 验 诊 断 疾 病 的 种 类 不 断 发 生 变 迁 ， 传 染 病 如鼠 疫 等 已 明 显 减 少 ， 相 反 ， 由 条 件 致 病 菌引 起 的 内 源 性 感 染 却 明 显 增 多 。 同 时 ， 新的 病 原 菌 不 断 出 现 ， 原 有 的 病 原 菌 因 变 异 、耐 药 等 又 重 新 流 行 。 目 前 ， 临 床 遇 到 主 要 是 条 件 致 病 菌 ，引 起 的 感 染 。 正 常 菌 群 与 病 原 菌 的 致 病性 是 相 对 的 ， 因 此 ， 既 不 要 轻 易 认 为 分离 出 的 非 致 病 菌 是 污 染 菌 ， 也

2、 不 要 轻 易认 为 所 发 现 的 细 菌 就 是 该 感 染 的 病 原 菌 ，必 须 结 合 临 床 进 行 进 一 步 的 诊 断 。 第 一 节 临 床 感 染 性 疾 病 实 验 诊 断 要 求 一 、 诊 断 的 目 的 1.以 疾 病 的 病 原 学 诊 断 为 目 的 ,只 需 鉴 定 到 细 菌 的 种 。 2.为 提 供 治 疗 方 案 为 目 的 ， 要 进 行 临 床 标 本 的 直 接 药 物 敏 感 试 验 。 3.以 流 行 病 学 研 究 为 目 的 ,要 鉴 定 到 型 。4.以 了 解 细 菌 与 感 染 的 关 系 为 目 的 ,应 该 做 细 致 的

3、 鉴 定 。 二 、 诊 断 试 验 的 选 择1.选 择 有 鉴 定 价 值 的 试 验 。2.选 择 简 易 、 快 速 、 方 便 的 试 验 ， 达 到 目 的 即 可 。 3.综 合 考 虑 试 验 的 敏 感 性 和 特 异 性 。 敏 感 性 =阳 性 结 果 数 /感 染 病 人 数 ，越 高 假 阴 性 就 越 少 。 特 异 性 =阴 性 结 果 数 /未 感 染 病 人 数 ，越 高 假 阳 性 就 越 少 。 三 、 常 用 诊 断 流 程 1.双 歧 索 引用 于 相 互 区 别 比 较 容易 ,有 特 征 的 细 菌 ，如 革 兰 阴 性 杆 菌 初 步分 群 ；

4、对 于 相 互 区 别较 难 的 细 菌 ， 鉴 定 项目 较 多 ,用 起 来 不 太方 便 。 2.表 解 法 ：将 各 种 细 菌 及 其 多 种 特 性 列 成 矩 阵 表格 ， 使 相 互 的 区 别 点 十 分 明 显 ， 便 于分 析 比 较 。 此 法 对 于 相 互 区 别 比 较 复杂 的 细 菌 ， 如 肠 杆 菌 科 的 初 步 分 属 。 3.数 字 编 码 鉴 定 法 将 所 得 生 化 反 应 模 式 转 化 成 数 学模 式 ， 可 把 细 菌 生 化 反 应 结 果 转 化成 数 字 ， 经 检 索 手 册 又 可 将 转 化 成细 菌 名 称 。 与 电 脑

5、 分 析 软 件 配 套 ，形 成 了 半 自 动 或 全 自 动 细 菌 分 析 系统 。 组别试验项目代码结果结果代码总值 1硫化氢苯丙氨酸葡萄酸盐 4 2 1 - - + 0 0 1 1 2靛基质甲基红枸橼酸盐 4 2 1 - + + 0 2 1 3 3尿素动力产气 4 2 1 + 4 2 1 7 4赖氨酸鸟氨酸 棉子糖 4 2 1 +- 4 2 0 6 5山梨醇侧金花醇木胶糖 4 2 1 +- 4 2 0 6 第 二 节 临 床 标 本 的 采 集 与 处 理 一 、 标 本 采 集 的 一 般 原 则 1.病 程 早 期 、 急 性 期 或 症 状 典 型 时 ， 使 用 抗 生 素

6、 前 。 2.无 菌 采 集 应 无 污 染 ， 严 格 进 行 无 菌 操 作 。 3.根 据 目 的 菌 的 特 性 用 不 同 的 方 法 采 集 适 量 标 本 ， 采 集 量 不 应 过 少 。4.注 意 在 不 同 病 程 采 集 不 同 部 位 标 本 。5.采 集 标 本 时 要 防 止 传 播 和 自 身 感 染 。 二 、 标 本 的 处 理1.标 本 保 存 在 4 环 境 中 ， 在 2h之 内 送 检 。 脑 脊 液 则 要 在 25 保 存 ， 用 于 细 菌 培 养 的 标 本 保 存 时 间 不 应 超 过 24h。 对 环 境 敏 感 的 细 菌 应 保 温

7、并 立 即 送 检 。 2.标 本 中 可 能 含 有 致 病 菌 ， 必 须 注 意 安 全 防 护 。 切 勿 污 染 环 境 。 对 于 烈 性 传 染 病 标 本 运 送 时 更 要 由 专 人 运 送 ， 严 格 按 规 定 包 装 。 3.厌 氧 性 标 本 应 放 在 专 门 的 运 送 瓶 或 试 管 内 运 送 ， 有 时 可 直 接 用 抽 取 标 本 的 注 射 器 运 送 。 第 三 节 细 菌 形 态 学 检 查 一 、 显 微 镜 1.普 通 光 学 显 微 镜 用 油 镜 放 大 1000倍 ， 一 般 细 菌 均 能 清 楚 看 到 。 2.暗 视 野 显 微

8、镜 用 于 检 查 不 染 色 的 活 细 菌 和 螺 旋 体 的 形 态 及 运 动 观 察 。 3.相 差 显 微 镜 主 要 用 于 检 查 不 染 色 活 细 菌 的 形 态 及 某 些 内 部 结 构 。 4.荧 光 显 微 镜 可 看 到 发 射 荧 光 的 细 菌 。 还 应 用 于 免 疫 荧 光 技 术 中 。 5.电 子 显 微 镜 有 透 射 电 子 显 微 镜 和 扫 描 电 子 显 微 镜 。 前 者 适 于 观 察 细 菌 内 部 超 微 结 构 ， 后 者 适 于 对 细 菌 表 面 结 构 及 附 件 观 察 。 二 、 不 染 色 细 菌 标 本 检 查 1.

9、主 要 用 于 检 查 生 活 状 态 下 细 菌 的动 力 及 运 动 状 况 。 可 对 某 些 病 原菌 作 出 初 步 鉴 定 ， 如 霍 乱 菌 。2.螺 旋 体 由 于 不 易 着 色 并 有 形 态 特征 ， 故 多 用 不 染 色 标 本 作 暗 视 野显 微 镜 检 查 。 三 、 细 菌 染 色 标 本 的 检 查 细 菌 标 本 经 染 色 后 ， 除 能 清 楚 看到 细 菌 的 形 态 、 大 小 、 排 列 方 式 外 ，还 可 根 据 染 色 反 应 将 细 菌 进 行 分 类 。 (一 )常 用 染 料 分 为 碱 性 和 酸 性 两 大 类 。 此 外 ， 还

10、 有 复合 染 料 。 1 碱 性 染 料 电 离 后 显 色 离 子 带 正 电 荷 ， 易 与 带 负 电 荷 的 被 染 物 结 合 。 由 于 细 菌 均 带 负 电 荷 ， 易 与 染 料 结 合 而 着 色 。 常 用 的 有 碱 性 复 红 、 结 晶 紫 、 美 蓝 等 。 2 酸 性 染 料 电 离 后 显 色 离 子 带 负 电 荷 ，易 与 带 正 电 荷 的 被 染 物 结 合 。 细 菌 都 带 有负 电 荷 故 不 易 着 色 。 通 常 用 来 染 细 胞 浆 ，而 很 少 用 于 细 菌 的 染 色 。 常 用 的 酸 性 染 料有 伊 红 、 刚 果 红 等

11、。 3 复 合 染 料 (中 性 染 料 )及 荧 光 染 料 复 合 染 料 是 碱 性 染 料 和 酸 性 染 料 的 复 合 物 ， 如 瑞 氏 染 料 (伊 红 美 蓝 )、 姬 姆 萨 染 料 (伊 红 天 青 )等 ； 荧 光 染 料 如 荧 光 标 记 的 抗 体 ， 荧 光 素 常 用 异 硫 氢 基 荧 光 素 。 这 些 染 色 常 用 于 某 些 特 殊 的 染 色 技 术 中 。 （ 二 ） 常 用 的 染 色 方 法在 细 菌 感 染 标 本 的 检 查 中 ， 临 床 上 常用 的 染 色 方 法 有 革 兰 染 色 、 抗 酸 染 色和 荧 光 染 色 。 1 革

12、 兰 染 色最 经 典 、 最 常 用 的 染 色 方 法 。 在 分 离培 养 前 都 要 进 行 革 兰 染 色 、 镜 检 。 通过 革 兰 染 色 将 所 有 细 菌 分 为 G+菌 和 G-菌 两 大 类 ， 可 初 步 识 别 细 菌 ， 有 助 于进 一 步 鉴 定 。 结 合 细 菌 特 殊 结 构 及 排 列 方 式 ， 对 病原 菌 可 进 行 鉴 定 ， 其 结 果 为 临 床 早 期 诊 断及 治 疗 提 供 了 依 据 。 革 兰 染 色 可 为 临 床 选 择 用 药 提 供 参 考 ，帮 助 临 床 制 订 有 针 对 性 的 治 疗 方 案 。 因 为G+菌 和

13、 G-菌 对 抗 生 素 敏 感 性 不 同 ， 且 致 病物 质 及 其 作 用 机 理 也 不 同 。 2 抗 酸 染 色 将 细 菌 分 为 抗 酸 性 和 非 抗 酸 性 细 菌 两大 类 。 因 为 大 多 数 病 原 菌 为 非 抗 酸 性 ， 所以 抗 酸 染 色 不 作 为 常 规 检 查 项 目 。 只 用 于 结 核 病 等 检 查 。 抗 酸 染 色 的 鉴定 结 果 。 对 疾 病 的 诊 断 和 治 疗 具 有 重 要 参考 价 值 。 3 荧 光 染 色 敏 感 性 强 ， 效 率 高 而 且 容 易 观 察 结 果 ， 在临 床 细 菌 鉴 定 中 有 很 大 的

14、 实 用 价 值 。 主 要 用 于结 核 分 枝 杆 菌 、 麻 风 分 枝 杆 菌 、 白 喉 棒 状 杆 菌及 痢 疾 志 贺 菌 等 的 检 测 。 此 外 还 有 ：鞭 毛 染 色 可 观 察 有 无 鞭 毛 、 鞭 毛 的 位 置 及 数 量 ，在 细 菌 鉴 定 中 很 重 要 。异 染 颗 粒 染 色 镜 检 异 染 颗 粒 ， 为 临 床 早 期 诊 断白 喉 提 供 依 据 。 第 四 节 细 菌 分 离 培 养 与 接 种 技 术 绝 大 多 数 细 菌 在 适 宜 的 条 件 下 可 以 生 长 ，细 菌 感 染 性 患 者 标 本 只 有 经 过 细 菌 的 分离 培

15、 养 、 鉴 定 和 药 物 敏 感 试 验 ， 才 可 对感 染 性 疾 病 进 行 病 原 学 诊 断 并 指 导 临 床用 药 。 因 此 ， 细 菌 培 养 对 疾 病 的 诊 断 、预 防 和 治 疗 具 有 重 要 的 作 用 。 （ 一 ） 细 菌 室 的 符 合 条 件1 细 菌 室 必 须 安 装 严 密 的 门 窗 ， 以 防 室 内 环 境 受 到 外 界 的 污 染 。 且 室 内 禁 用 风 扇 ， 避 免 细 菌 的 播 散 。2 细 菌 室 必 须 安 装 供 空 气 消 毒 的 紫 外 线 灯 ， 置 于 操 作 台 上 面 lm处 ， 每 天 开 始 工 作

16、前 照 射 20min。 对 其 消 毒 效 果 要 定 期 检 查 ， 及 时 更 换 失 效 的 灯 管 。 3 室 内 应 备 有 消 毒 剂 ， 用 于 试 验 中 发 生 菌 液 洒 溅 时 的 及 时 消 毒 处 理 。 同 时 还 应 备 有 供 工 作 人 员 浸 手 用 的 盛 有 消 毒 剂 的 水 盆 、 肥 皂 及 自 来 水 源 等 。4 室 内 操 作 台 须 每 日 用 消 毒 剂 擦 洗 ， 地 面 至 少 一 周 用 消 毒 剂 擦 洗 1次 。 5 对 接 收 的 标 本 、 无 菌 器 具 、 用 过 的 物 品 等 应 明 显 分 开 井 放 在 指 定

17、 位 置 。 同 时 要 对 用 过 的 物 品 及 时 进 行 灭 菌 处 理 。6 细 菌 室 应 有 当 地 的 气 温 特 点 的 消 防 设 备 。 (二 )无 菌 实 验 室1 无 菌 室 应 完 全 封 闭 ， 人 员 出 入 应 有 两 道 门 ， 其 间 应 隔 有 缓 冲 区 。2 用 前 应 以 紫 外 线 消 毒 30min， 定 期 用 乳 酸 或 甲 醛 熏 蒸 ， 彻 底 消 毒 。 3 在 无 菌 室 中 一 般 仅 限 于 分 装 无 菌 的 培 养 基 及 传 染 性 强 的 细 菌 的 接 种 ， 不 进 行 有 菌 标 本 的 分 离 及 其 他 操 作

18、 。4 无 菌 室 内 应 仅 限 操 作 人 员 进 人 ， 而 且 进 入 无 菌 室 应 着 隔 离 衣 和 专 用 鞋 ， 操 作 时 戴 口 罩 ， 随 时 保 证 室 内 的 无 菌 状 态 。 5 条 件 有 限 的 实 验 室 ， 可 用 超 净 工 作 台 代 替 无 菌 实 验 室 进 行 相 应 的 操 作 。 超 净 工 作 台 应 选 择 垂 直 气 流 通 风 方 式 。6 无 菌 室 应 配 备 空 调 设 备 ， 保 证 不 因 室 温 而 影 响 工 作 。 (三 )基 本 设 备 和 器 具 用 于 细 菌 培 养 的 温 箱 、 C02培 养 箱 、 厌

19、氧培 养 设 备 ； 用 于 观 察 细 菌 形 态 及 标 本 直 接 镜 检 的 显微 镜 ； 用 于 物 品 灭 菌 的 高 压 蒸 气 灭 菌 器 、 干 烤箱 ； 用 于 储 存 培 养 基 、 诊 断 用 血 清 、 抗 生 素及 菌 种 等 的 冰 箱 和 冷 藏 柜 ； 用 于 挑 取 标 本 、 接 种 等 的 接 种 器 具 ， 包括 接 种 环 和 接 种 针 ； 制 备 培 养 基 时 用 的 pH计 ； 用 于 接 种 器 具 灭 菌 的 火 焰 灯 或 酒 精 灯 ；还 有 各 种 必 用 的 平 皿 、 试 管 、 吸 管 等 玻 璃 器皿 ， 以 及 离 心 机

20、 、 天 平 等 。 二 、 培 养 基由 人 工 方 法 配 制 而 成 的 ， 专 供 微 生 物 生 长 繁 殖使 用 的 混 合 营 养 物 制 品 。适 宜 的 培 养 基 不 仅 可 用 于 细 菌 的 分 离 纯 化 培 养 、传 代 、 菌 种 保 存 ， 还 可 用 于 研 究 细 菌 的 生 理 、生 化 特 性 ， 是 对 病 原 菌 分 离 鉴 定 的 重 要 环 节 和必 不 可 少 的 手 段 。 (一 )培 养 基 的 组 成 成 分1.营 养 物 质 : (1)蛋 白 胨 ； (2)肉 浸 液 ； (3)牛 肉膏 ； (4)糖 类 ； (5)血 液 ； (6)无

21、 机 盐 类 ； (7)鸡 蛋 和 动 物 血 清 ； (8)生 长 因 子 ： 提 供 细 菌 生长 繁 殖 所 需 要 的 氮 源 和 碳 源 ， 还 有 生 长 因 子 。2.凝 固 物 质 制 备 固 体 培 养 基 时 ， 加 入 琼 脂 ， 琼脂 是 半 乳 糖 胶 ， 98 以 上 时 可 溶 于 水 ， 在 45 以 下 则 凝 固 成 凝 胶 状 态 。3.抑 制 剂 和 指 示 剂 用 于 选 择 、 鉴 定 及 判 断 结 果 。 (二 )培 养 基 种 类1 基 础 培 养 基 含 有 生 长 所 需 的 基 本 营 养 成 分 ， 称 肉 汤 ， 用 于 增 菌 、

22、检 验 ， 是 制 备 其 他 培 养 基 的 基 础 成 分 。2 营 养 培 养 基 在 基 础 培 养 基 中 可 加 入 葡 萄 糖 、 血 液 、 生 长 因 子 等 特 殊 成 分 ， 供 营 养 要 求 较 高 的 细 菌 和 须 要 特 殊 生 长 因 子 的 细 菌 生 长 。 最 常 用 的 是 血 平 板 等 。 3 鉴 别 培 养 基 利 用 细 菌 分 解 能 力 及 代 谢 产 物 的 不 同 ， 在 培 养 基 中 加 入 特 定 的 作 用 底 物 和 指 示 剂 ， 观 察 细 菌 生 长 过 程 中 分 解 底 物 所 释 放 的 不 同 产 物 ， 通 过

23、 指 示 剂 的 反 应 不 同 来 鉴 别 细 菌 。 如 糖 发 酵 培 养 基 。 4 选 择 培 养 基 在 培 养 基 中 加 入 抑 制 剂 而 抑 制 杂 菌 生 长 ， 有 助 于 对 所 选 择 的 细 菌 生 长 。5 特 殊 培 养 基 包 括 厌 氧 培 养 基 和 细 菌 L型 培 养 基 等 。 (三 )分 离 培 养 基 的 选 择 依 据 卫 生 部 临 床 检 验 中 心 推 荐 ， 应 备 有 如 下 分 离 培 养 基 ：1 血 平 板 适 于 各 类 细 菌 的 生 长 。2 巧 克 力 血 平 板 其 中 含 有 V和 X因 子 ， 适 于 接 种 疑

24、 有 嗜 血 杆 菌 、 奈 瑟 菌 等 的 标 本 。 3 中 国 蓝 平 板 或 伊 红 美 蓝 平 板 有 选 择 地 促 进 G_菌 生 长 ， 是 较 好 的 弱 选 择 性 培 养 基 。4 麦 康 凯 平 板 具 中 等 强 度 选 择 性 ， 是 非 发 酵 菌 鉴 定 的 依 据 。5 SS琼 脂 有 较 强 的 抑 菌 力 ， 用 于 志 贺 菌 和 沙 门 菌 的 分 离 。 6 碱 性 琼 脂 用 于 从 粪 便 中 分 离 霍 乱 弧 菌 及 其 它 弧 菌 。7 血 液 增 菌 培 养 基 用 于 从 血 液 、 骨 髓 中 分 离 常 见 病 原 菌 。8 营 养

25、 肉 汤 用 于 标 本 及 各 类 细 菌 的 增 菌 。 三、细 菌 接 种 与 分 离 技 术(一 )平 板 划 线 分 离 法 1 连 续 划 线 分 离 法 此 法 主 要 用 于 杂 菌 不 多 的 标 本 。 2 分 区 划 线 分 离 法 本 法 适 用 于 杂 菌 量 较 多 的 标 本 。 获 得 单 个 菌 落 。 (二 )斜 面 接 种 法 该 法 主 要 用 于 单 个 菌 落 的 纯 培 养 、 保 存 菌 种 或 观 察 细 菌 的 某 些 特 性 。 (三 )液 体 接 种 法 多 用 于 一 些 液 体 生 化 试 验 管 的 接 种 。(四 )穿 刺 接 种

26、 法 在 试 管 内 壁 与 液 面 交 接 处 的 此 法 主 要 用 于 半 固 体 培 养 基 、 明 胶 及 双 糖 管 的 接 种 。 (五 )倾 注 平 板 法 测 定 牛 乳 、 饮 水 和 尿 液 等 标 本 细 菌 数 时 常 用 此 方 法 。(六 )涂 布 接 种 法 常 用 于 纸 片 法 药 物 敏 感 性 测 定 ， 也 可 用 于 被 检 标 本 中 的 细 菌 计 数 。 四 、 细 菌 培 养 方 法 (一 )需 氧 培 养 法 最 常 用 的 培 养 方 法 ， 适 于 需 氧 和 兼 性厌 氧 菌 的 培 养 。 (二 )二 氧 化 碳 培 养 法 常 以

27、 下 列 方 法 供 给 C02。 1 二 氧 化 碳 培 养 箱 是 一 台 特 制 的 培 养箱 ， 既 能 调 节 C02的 含 量 ， 又 能 调 节 所 需的 温 度 。 此 法 适 于 大 型 实 验 室 应 用 。 2 烛 缸 法 将 已 接 种 好 的 培 养 基 置 干 燥 器 内 ， 并 放 人 点 燃 的 蜡 烛 。 干 燥器 盖 的 边 缘 涂 亡 凡 士 林 ， 盖 上 盖 子 ， 烛 光经 几 分 钟 后 自 行 熄 灭 ， 此 时 干 燥 器 内 C02含 量 约 占 5 -10 ， 然 后 将 干 燥 器 放 入 35 温 箱 内 培 养 。 3 化 学 法 按

28、 每 升 容 积 加 入 碳 酸 氢 钠 0 4g和 浓 盐酸 0 35ml的 比 例 ， 分 别 置 于 容 器 内 。 将 容器 连 同 接 种 好 的 培 养 基 都 放 人 干 燥 器 内 ，盖 紧 干 燥 器 的 盖 子 ， 倾 斜 容 器 使 浓 盐 酸 与碳 酸 氢 钠 接 触 生 成 CO2。(三 )厌 氧 培 养 法 第 五 节 细 菌 产 物 的 检 测 及 鉴 定 一 、 细 菌 毒 素 的 检 测 (一 )内 毒 素 的 测 定 主 要 用 于 诊 断 病 人 是 否 发 生 革 兰 阴 性细 菌 感 染 。 另 外 ， 还 可 用 于 检 测 注 射 用 液和 生 物

29、 制 品 有 无 内 毒 素 污 染 。 1 细 菌 内 毒 素 的 致 热 作 用 常 以 家 兔作 为 实 验 动 物 ， 家 兔 正 常 体 温 38 5 40 。 抽 取 被 检 物 注 入 家 兔 耳静 脉 ， 记 录 体 温 变 化 情 况 ， 分 析 实 验结 果 。 2 鲎 试 验 鲎 血 液 的 有 核 变 形 细 胞 内 含 凝 固 酶 原 及 凝 固 蛋 白 原 ， 当 内 毒 素 与 鲎 变形 细 胞 冻 融 后 的 溶 解 物 (鲎 试 剂 )接 触 时 ，可 激 活 凝 固 酶 原 ， 使 可 溶 性 的 凝 固 蛋 白原 变 成 凝 胶 状 态 的 凝 固 蛋 白

30、 ， 利 用 此 种反 应 来 检 测 内 毒 素 。 本 试 验 对 内 毒 素 具 有 高 度 特 异 性 ， 灵 敏度 高 ， 可 检 查 出 0 005 0 0005 gml内 毒 素 。 且 操 作 简 便 ， 速 度 快 ， 在 2h内 即 可 得 出 结 论 。 (二 )外 毒 素 的 测 定1 体 内 毒 力 试 验 细 菌 外 毒 素 对 机 体 的 毒性 作 用 ， 可 被 相 应 抗 毒 素 中 和 ， 若 先 给 动物 注 射 抗 毒 素 ， 然 后 再 注 射 外 毒 素 ， 则 动物 不 产 生 中 毒 症 状 。 2 体 外 毒 力 试 验 外 毒 素 抗 原 性

31、 强 ， 可 刺激 机 体 产 生 相 应 的 抗 体 。 在 体 外 以 细 菌 外毒 素 的 特 异 性 免 疫 血 清 为 抗 体 与 被 检 细 菌外 毒 素 (抗 原 )进 行 抗 原 抗 体 反 应 ， 来 检 测外 毒 素 ， 从 而 鉴 定 细 菌 是 否 产 生 该 种 毒 素 。如 白 喉 棒 状 杆 菌 的 Elek平 板 毒 力 测 定 。 ELISA法 如 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 、 肠 产 毒型 大 肠 埃 希 菌 LT及 ST等 的 测 定 。 二 、 细 菌 生 化 反 应 鉴 定 不 同 细 菌 具 有 各 自 独 特 的 酶 系 统 ， 因而 对 底 物

32、 的 分 解 能 力 各 异 ， 其 代 谢 的 产物 也 不 相 同 。 这 些 代 谢 产 物 又 各 具 有 不同 的 生 物 化 学 特 性 ， 为 此 ， 可 利 用 生 物化 学 的 方 法 测 定 这 些 代 谢 产 物 以 鉴 定 细菌 。 (一 )碳 水 化 合 物 的 代 谢 试 验 1 糖 (醇 、 苷 )类 发 酵 试 验(1)原 理 ： 由 于 细 菌 含 有 发 酵 不 同 糖 类 的酶 ， 故 分 解 糖 的 能 力 不 同 ， 终 末 产 物 亦不 一 致 。 有 的 能 分 解 ， 有 的 仅 能 分 解 1-2种 ， 还 有 的 不 能 分 解 。 有 的

33、产 酸 产 气 ，有 的 仅 产 酸 ， 故 可 利 用 鉴 别 细 菌 。 (2)培 养 基 ： 在 培 养 基 中 加 入 0.5 -1 的糖 类 (单 糖 、 双 糖 或 多 糖 )、 醇 类 (甘 露 醇 、肌 醇 等 )、 苷 类 (水 杨 苷 、 菊 糖 等 )。 可 为液 体 、 半 固 体 、 固 体 或 微 量 生 化 管 几 种类 型 。(3)方 法 ： 将 细 菌 接 种 到 糖 发 酵 培 养 基 中 ，培 养 数 h小 时 至 2w后 ， 观 察 结 果 。 (4)结 果 ： 能 分 解 糖 产 酸 时 ， 呈 酸 性 反 应 ，若 产 气 可 出 现 气 泡 或 培

34、 养 基 内 有 裂 隙 等现 象 ;若 不 分 解 ， 除 有 细 菌 生 长 外 ， 无 任何 变 化 。(5)应 用 ： 是 鉴 定 细 菌 最 主 要 的 试 验 ， 特别 对 肠 杆 菌 科 细 菌 的 鉴 定 尤 为 重 要 。 2 氧 化 一 发 酵 试 验 (O F试 验 )(1)原 理 ： 细 菌 分 解 葡 萄 糖 必 须 有 分 子氧 参 加 的 称 为 氧 化 型 ； 进 行 无 氧 降 解的 称 为 发 酵 型 ； 不 分 解 葡 萄 糖 的 细 菌称 为 产 碱 型 。 利 用 此 试 验 可 区 分 细 菌的 代 谢 类 型 。(2)培 养 基 HL： Hugh-

35、Leifson二 氏 培 养基 。 (3)方 法 ： 将 待 检 菌 同 时 穿 刺 接 种 两 支 HL培养 基 ， 一 支 滴 加 无 菌 液 体 石 蜡 ， 高 度 不 少于 1cm。 将 培 养 基 于 35 培 养 48h或 更 长 。 (4)结 果 ： 两 支 培 养 基 均 无 变 化 为 产 碱 型 或小 分 解 糖 型 ； 两 支 培 养 基 均 产 酸 为 发 酵 型 ；若 不 加 石 蜡 的 培 养 基 产 酸 为 氧 化 型 。(5)应 用 ： 主 要 用 于 肠 杆 菌 科 细 菌 与 非 发 酵菌 的 鉴 别 型 或 产 碱 型 。 也 呵 用 于 葡 萄 球 菌与

36、 微 球 菌 间 的 鉴 别 。 3 -半 乳 糖 苷 酶 试 验(1)原 理 ： 有 的 细 菌 可 产 生 半 乳 糖 苷 酶 ，能 分 解 邻 -硝 基 酚 -D-半 乳 糖 苷(ONPG)， 而 生 成 黄 色 的 邻 -硝 基 酚 ， 在 很低 浓 度 下 也 可 检 出 。 (2)试 剂 ： O 75M ONPG溶 液 ： 取 80mg溶 于15ml蒸 馏 水 中 ， 在 加 入 缓 冲 液 (6 9g NaH 2PO4溶 于 45ml蒸 馏 水 中 ， 用 30 NaOH调 控 pH为 7.0， 再 加 水 至 50ml)5ml， 置4 冰 箱 中 保 存 。 （ 3） 方 法

37、： 从 克 氏 双 糖 铁 培 养 基 上 取 菌 ，于 0.25ml无 菌 生 理 盐 水 中 制 成 菌 悬 液 ，加 入 甲 苯 并 充 分 振 摇 ， 使 酶 释 放 。 将 试管 置 37 水 浴 5min， 加 入 0.25mlONPG试剂 ， 水 浴 20min3小 时 观 察 结 果 。 (4)结 果 ： 菌 悬 液 呈 现 黄 色 为 阳 性 反 应 ， 一般 在 20 30min内 显 色 。(5)应 用 ： 迅 速 及 迟 缓 分 解 乳 糖 的 细 菌 ONPG试 验 为 阳 性 ， 而 不 发 酵 乳 糖 的 细 菌 为 阴性 。 本 试 验 主 要 用 于 迟 缓

38、发 酵 乳 糖 菌 株的 快 速 鉴 定 。 4 七 叶 苷 水 解 试 验(1)原 理 ： 有 的 细 菌 可 将 七 叶 苷 分 解 成葡 萄 糖 和 七 叶 素 ， 七 叶 素 与 培 养 基中 枸 橼 酸 的 二 价 铁 离 子 反 应 ， 生 成黑 色 的 化 合 物 ， 使 培 养 基 呈 黑 色 。(2)培 养 基 ： 七 叶 苷 培 养 基 、 胆 汁 七 叶苷 培 养 基 。 (3)方 法 ： 将 待 检 菌 接 种 于 七 叶 苷 培 养基 中 ， 培 养 后 观 察 结 果 。(4)结 果 ： 培 养 基 变 为 黑 色 为 阳 性 ， 不变 色 者 为 阴 性 。(5)

39、应 用 ： 主 要 用 于 D群 链 球 菌 与 其 它链 球 菌 的 鉴 别 ， 前 者 阳 性 ， 后 者 阴性 。 也 可 用 于 革 兰 阴 性 杆 菌 及 厌 氧菌 的 鉴 别 。 5 甲 基 红 试 验(1)原 理 ： 某 些 细 菌 分 解 葡 萄 糖 产 生 丙 酮酸 ， 进 一 步 分 解 ， 产 生 甲 酸 等 ， 使 pH降至 4 5以 下 ， 加 入 甲 基 红 试 剂 则 呈 红 色为 阳 性 。 若 分 解 葡 萄 糖 产 酸 量 少 ， 则 pH 6 2以 上 ， 故 加 入 甲 基 红 指 示 剂 呈 黄 色 ，为 阴 性 。 (2)培 养 基 ： 葡 萄 糖

40、蛋 白 胨 水 培 养 基 。(3)方 法 ： 将 待 检 菌 接 种 于 上 述 培 养 基 中 ，培 养 2-4d， 于 培 养 基 内 加 入 甲 基 红 试 剂 ，立 即 观 察 结 果 。(4)结 果 ： 呈 现 红 色 为 阳 性 ； 橘 红 色 为 弱阳 性 ； 黄 色 为 阴 性 。 (5)应 用 ： 主 要 用 于 鉴 别 大 肠 埃 希 菌 与 产气 肠 杆 菌 ， 前 者 为 阳 性 ， 后 者 为 阴 性 。此 外 肠 杆 菌 科 中 沙 门 菌 属 、 志 贺 菌 属 、枸 橼 酸 杆 菌 属 、 变 形 杆 菌 属 等 为 阳 性 ，而 肠 杆 菌 属 则 为 阴

41、性 。 6V-P试 验(1)原 理 ： 某 些 细 菌 分 解 葡 萄 糖 产 生 丙 酮 酸 ，脱 羧 产 生 乙 酰 甲 基 甲 醇 ， 在 碱 性 环 境 中被 氧 氧 化 为 二 乙 酰 ， 进 而 与 胍 基 起 作 用生 成 红 色 化 合 物 ， 则 为 V-P试 验 阳 性 。(2)培 养 基 ： 葡 萄 糖 蛋 白 胨 水 培 养 基 。 (3)方 法 ： 将 待 检 菌 接 种 于 上 述 培 养 基 中 ，于 35 培 养 48h后 加 入 甲 液 (6 n萘 酚 酒精 溶 液 )和 乙 液 (40 KOH溶 液 )， 振 摇 。(4)结 果 ： 在 数 分 钟 内 出 现 红 色 为 阳 性 ； 如无 红 色 出 现 且 于 35 4h后 仍 如 故 者 即为 阴 性 。(5)应 用 ： 常 与 甲 基 红 试 验 一 起 使 用 ， 因 为前 者 阳 性 的 细 菌 ， 后 者 通 常 为 阴 性 。