WB实战指南

《WB实战指南》由会员分享，可在线阅读，更多相关《WB实战指南（16页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、jacqueslm20232023-08-03 21:32来 dxy 好多年了，这些年陆间续续回复了一些帖子，可是回来回去，觉察大家提的问题，还是那么几个，没有从根本上有所提高，确实出乎意料。看过很多总结阅历的帖子，不知道该 如何评价，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，手参考这些固然难获进益。实在受不了，这些混淆视听的东西，本人把这么多年的回复，略作整理完善拼凑成WB 实战指南，欢送行家批判指正。首先，摆摆自己的阅历。鄙人做WB 有 8、9 年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇 15+系国内完成；注：当年的IF，现在逐年递减没个标准。其次，由于一些

2、机缘的因素，在试验室WB 体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话， 碰了一鼻子灰，差不多能遇到的问题都经受了，因此我敢写这样一个咚咚给大家共享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，试验结果的牢靠、秀丽已经不算一个要求；如何缩短操作时间，使试验进展的更有效率也是我们所追求的，因此本文会针对两个普遍承受的 却可以看成铺张时间的操作， Bradford 法蛋白定量和立春红染膜做特地批判，这在以前的WB 操作指南是绝无的，甚至叛离被视为经典的分子克隆。可是，请记住，经典是人定的。话不多废，开头：样品制备：变性条件SDS LB 直接裂解：用常温或者高温预热过预热更有利于阻挡蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化

3、，但简洁遗忘， LB 久煮某些性质会转变的1*SDS LB或者略高 1.5*直接加到细胞或者组织上并煮样。通常 6 孔板细胞 80%以上密度，需 200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB 都是过量的因此不愿定要严格参考SDS LB 稀释比；假设 SDS LB 不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会觉察tip 吸不上来，格外粘、一砣一砣的，很简洁堵住tip。这时候常规做法有两种，1. 再煮 5min。常规煮样时间 3-5min，样品过浓时就煮 10min；2.假设 10min煮样后，照旧吸不起来，才适当增加SDS LB，连续煮；也可以对样品进展超声。煮样时间假设过长，蛋白会凝

4、固，此时以失去连续 WB 的意义，请丢弃推断标准：消灭明显的蛋白沉淀和水分层此方法的缺点，SDS LB 煮过的样品假设用来做IP，需要特别方法，因此， 这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法不争论诸如核抽提、亚细胞器分别等等了，其实类似 裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前 boss nature 文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A

5、and 10 g/ml aprotinin)此裂解液可用于抽提核蛋白，其中蛋白酶抑制剂很简洁也很贵，其有用 0.5mM PMSF 替代这三种就好了；假设还要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4现加现用，10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。NP-40 =Nonidet P40乙基苯基聚乙二醇,乙基酚聚乙二醇醚 leupeptin：亮抑蛋白酶肽。pepstatin a：胃酶抑素a，aprotinin：抑肽酶 。PMSF：=phenylmethyl sulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物此方法的优点：NaCl 浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较

6、为温存，便于随后的IP10等试验。其他 Na 盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如 0.15M生理盐浓度、0.3M、0.6M高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀格外粘稠及 0.8-1.2M；0.3M 及以下适合IP 试验，0.6M 及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般承受极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的缘由是 0.5% NP-40，用于破坏核膜构造；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最适宜，现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候，比方 50mg 颖癌组织，我承受的方法是1. 低温剪搅碎

7、，成肉糜状。2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击把握力气，尽量避开弄破锡箔纸，进一步裂开；反复屡次。3. 用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培育基培育细胞，收集上清液用于WB 检测；假设含量过低，需要用TCA 沉淀富集。理论上，从一般培育基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最正确的试验条 件；但是这存在隐忧。由于含血清的培育基中含有格外丰富的 BSA牛血清白蛋白之类的蛋白质，除非你进一步分别纯化，否则直接用这种样品去 WB 会有格外大的麻烦，尤其当你的蛋白在 60-46 kDa 之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片格外强的信号。由于此区间蛋白

8、主要是 BSA浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，承受SDS LB 裂解细胞制备样品前，通常要用PBS 洗涤，其目的之一是去除培育基中的BSA。承受无血清培育基收集细胞上去除了转变细胞的生理状态外可能激活未知信号途径，诸如AKT 等，还会消灭的问题是：1. 即使承受了无血清收集上清，照旧有大量杂蛋白，但相对好很多。2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要承受TCA 沉淀富集，再重溶解。a. TCA 沉淀对半定量操作要求格外高，由于很简洁沉淀不充分或者离心操作丧失，尤其在离心过程，离心管的摆放格外讲究，要180 度翻转离心两次。b。重溶解时，由于蛋白需要在确定的盐离

9、子条件下才能重溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。实际上，假设你不是格外强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定 量的 WB 试验检测不同样品间的差异。这里面有试验操作细节的麻烦阅历之谈，我曾经参与的cancer cell 文章所争论的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是cell lysis；间或用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做预备。样品制备完，应马上低温保存-20 度短期几天；-80 度长期；例外，IP 用样品应直接进展 IP，避开冻融破坏蛋白质间弱的相互作用。SDS LB 煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS 沉淀；SDS 4 度就会沉淀，

10、何况-80 度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带SDS LB 不够，样品未充分溶解也会消灭类似拖尾；上样过大也会。在样品制备过程中，另一个需要留意的问题是，从样品制备的起始阶段就要留意定量问题；WB 本身系统误差有 20%，太微小的差特别常无视不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对 WB 结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小称重开头，裂解液的体积都是准确定量的，操作过程也尽量避开蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节争论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。【补充 1】：细胞有凋亡或生长速率差异时，有一个最直接的方法针对这个问题，实

11、际上将细胞收集下来以后，经过离心，去除PBS，这时候你可以拿出事先预备好的标准体积去比对，误差小于 50ul 的由于标准品差值可以设定为 50ul),所以根本上肉眼偏差至多只有 10ul细胞体积，这种小差异在 WB 结果中可以无视不计。其实标准品有多种好处，寻常可以用于离心时平衡；可以废物利用一些用过的effendorf 管。最好不要用纯水做标准品，我宠爱稀释一些SDS LB 做标准品，由于有蓝黑色比照下，可以更准确估量体积。这相比照测标准曲线，再一一读值还是快很多；蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。阅历之谈，8%胶最底边约 36KDa， 10%最底边约 25KDa，1

12、2%最底部约 12KDa。8%胶可以跑 300KDa-36KDa 之间的任意蛋白， 转膜效率对WB 结果的的影响都问题不大。12%，180KDa 左右，转膜效率对WB 结果的影响都问题不大300KDa 蛋白如何，没有尝试过。电泳一般承受恒流，45mA-55mA应依据电泳仪器适当调整，要留意仪器最高限压；此条件适合gibco model V16 型，胶宽 20cm。承受恒流的优点，保证最快速度完成电泳电压会渐渐增大，省时且削减集中；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必需想方法散热。散热不好，条带消灭波浪状。留意事项：1. 聚丙烯酰胺的 30%母液会降解，要 4 度避光保存。2. APS

13、会失效，10%APS 一般保质期才一个月左右。-20 度分装长期保存。3. 留意Tris buff 的PH 值，以及寻常所用的水的PH 值。PH 值转变会使带型格外怪异，全部蛋白和溴酚蓝压成一条细线即便在分别胶中，假设溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝始终延长到胶底部溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部 4上下层式电泳装置假设漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS- 胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5. 配胶用玻璃板和边条应准时洗净。玻板未洗净的害处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一 些微小的凹陷处会分散肉眼无法区分的胶颗粒摸上去

14、疙疙瘩瘩，其害处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。假设是 RNA 的超薄胶， 胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，格外难于去除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板 没洗净的另一个害处是，由中学物理学问可知，玻璃外表越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会 减弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部消灭大量气泡夹在 玻板和胶之间，这个关系不大；严峻的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光， 或者甚至胶和玻板分开。为避开拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子比水更好，有SDS 润滑。推断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，

15、洗衣粉、肥皂都不好用。6. 上样时，不要把tip 深入胶孔过深或者承受细的尖端拉长的专用上样枪头，可能会错开胶和玻板，样品会泄露。7. 未加样的孔应添加高浓度 SDS LB 平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常 20ul 样品含5ul 4*SDS LB，可用8-8.5ul 4*SDS LB 平衡。同理，点marker 的 lane 也要参与同样体积的 LB。LB 假设在室温放置太久和颖的在比重上会有差异，在旧LB 靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB 应全都。LB 应-20 度保存。8. 增加上样量不愿定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内

16、参粘连 ，全部的蛋白条带都扭曲变形。由于增加上样量最多只能提高几倍，而WB 灵敏度是以 10 的几次幂量级的，全部目的蛋白信号的唯一方案就是IP 富集可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰。增加上样量的另一个害处是，原来高表达的蛋白，诸 如内参，在同样WB 条件下，可能消灭荧光灼烧式粹灭一晃而灭或者条带中空。仍以 6 孔板 80%以上集合度为例，细胞裂解液和SDS LB 通常都是投入 200ul最少 80ul， 这样面积的培育板假设裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到全都，而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要把握在5-6ul，最少 2.5ul，最多 10ul

17、，10ul 时内参根本已经开头粘连成一条线，带型消灭波浪纹；固然并非不行以多上样，再多对 WB 结果影响不大没有的照旧没有，且条带都很丑。9. 不同样品上样时，可考虑将样品体积调成全都或类似。假设一组IP 样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul 4*SDS LB 到达常规 20ul 上样体积；后者第8 点提到只上 5ul，同样+5ul SDS LB比重同，不会相互挤压，最好补加 10ul DDW 使总体积全都。通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开空白仅指无蛋白， 仍应参与 8-8.5ul 4*SDS LB，这样才能确保每条带都很美观。10. SDS

18、 胶配好临时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间拔去梳子和底边边条后的间隙，用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4 度保存。个人习惯为，灌好分别胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌积存胶。两种方案都可以。所以假设估量次日工作量较大，可以提前灌好SDS 。样品是否确定需要定量再上样？不是的，这是铺张时间的一个操作。我们首先来争论一下蛋白定量的科学性。蛋白定量首先需要一个参照系标准蛋白，参照蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓的定量是对应于 BSA 的浓度的一个参照值。这里面存在一个问题，即无视了蛋白折叠和空间构象对光吸取、折射的影响；不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌入。因此你其实

19、默 认将全部的蛋白等同于 BSA 在溶液中的折叠状态、光吸取状况下，然后做出的一个相对推断，这就存在一个“系统误差”还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。其次，裂解组织或细胞的时候，那些裂解液中，某些溶剂本身会使 Coomassie G250 或者Bradford 法实际也是 Coomassie 染色显色，尤其是去污剂之类；例如 NP40，就会使Coomassie 显蓝色，可以完全掩盖掉蛋白与Coomassie 作用产生的蓝色。因此，假设你的裂解液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是 NP40 颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。【需要说明：我目前只知道

20、NP40 会这样，由于我们从来不去定量，没有做过更深入的争论。】实际上保证你的内参全都，是从样品制备开头的，上节末尾有提到，不赘述。假设你从制备样品时就留意过定量问题，实际上通常内参差异不会太大。假设真的有差异，通常我们会先 跑少量的样品，目的是让 Actin 或 tubulin 更清楚、不会粘连、不会过曝光。从而在其次轮跑正式结果前，依据第一轮的内参的荧光信号做微调，大致能做到相当；最多可能需要第三轮。以上的试验可以准确到 0.1ul 差异我很多体外生化试验之前的调整酶量就是这样进展， 此时根本不行能有足够的蛋白让你去定量。固然凭曝光强弱调整上样量的前提是，你的 WB 技术很稳定，很牢靠，这

21、是需要相当多的阅历积存，假设你一时把握不了，可以让阅历更丰富的师兄师姐或者导师帮助。顺便提到，有人问过用 Quantity One 等定量软件对光密度定量后计算差异从而调整上样体积是否可以？不行以。 由于WB 结果经过多重放大，准确计量只代表相对于比照组的相比照值，与实际比值还是有误差，所以按计算值更改上样量仍会消灭偏差。假设非要做定量的话，要留意你的裂解液配方，把每种溶剂都先参与到显色液中尝试一下， 避开那些本身会显色的物质消灭在你的裂解液中；固然，某些物质的去除可能影响对组织蛋 白的提取。所以这是一个两难的问题。转印转印效率对WB 结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！首先必需澄清的是

22、，很多时候手会把 WB 结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取打算性因素的是抗体识别力气的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节争论。有一个简洁的例证，Biorad 供给的 3mm 厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不抱负从预染的 marker 深浅可知，但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响建议少用这种滤纸做那种含量特别稀有或者转膜格外困难的蛋白。没有很好的策略可以解决这个滤纸的问题；尝试过浸泡会泡烂的、预电泳会略微好点等等，效果均不抱负。通常，最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。每次用完后清水略微冲洗一下外表盐分要把握水流；水流太大，纸张会烂掉的

23、，晾干再用；只要没冲烂可以始终反复使用。其次，尽管转膜效率不起打算性作用，但由于 WB 的流程相对较长，所以每个步骤的叠加作用会被级数放大，因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好，因此以下仍会深入探讨如何提高转膜效率。针对提高转膜的效率，个人认为最先应当考虑到的是仪器的选用。这里不是卑视“made in China ”，国内的厂家很少留意不断提高自己产品的品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合；但说到转膜仪，能把一个简洁的匀场电极做好的还真不多就我道听途说的，国外厂家为了使电极之间场强更加均匀，那种大块金属板外表是镀过极薄的白金层；因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。目

24、前，个人使用过的国产电转槽湿转唯 Tanon 仿 Biorad 的还可以算替它们免费打个广告吧， Tanon 仿biorad mini3 型电泳仪，在某些方面主要是操作上还优于Biorad 原装；目前我认为“中国制造”的灵魂就是仿造并超越前者；半干转仪一律进口，用过 Biorad、amersham 和英国公司的scieplas。PS：批判一下Biorad。Biorad 的半干转仪，其硬质塑料外壳会莫名其妙的碎裂绝非摔裂、磕碰，由于底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除残留盐渍，根本不会移动；即便如此它 自然就会碎裂，以致于其核心组件未坏的状况下，因外壳碎裂不得不报废该仪器其外壳里包裹电源线，外壳

25、碎裂，电源则无法接通，导致仪器报废我们先后买过3 台都是这样的毛病，其间间隔了 3 年，不能确定近来 Biorad 有没有改进这个问题；假设没有，我想市场迟早会被其他公司所取代对这三款产品，Biorad 的外壳有明显的质量缺陷，简洁过早报废；amersham 独特的蜂窝式设计确实对转膜效率有所提高，但蜂窝式使得与“三明治”的接触面削减，电转时散热不太 好，做大蛋白半干转仪也可以做大蛋白转膜，效率确实不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可承受长时程3hrs转膜需要在 4 度冰柜或cold room 进展；英国的产品，价格较高，公司不太知名国内不愿定有代理，但质量和散热都格外好。这里谈到了半干转和

26、湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合全部的蛋白，转膜效率最正确， 但靡费试剂、溶液，对一般分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转下文会具体给出条 件；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为 150KDa 以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，固然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚刚提到的amersham 半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义，何况还可以外加条件弥补；而且用半干转做大蛋白转印原来就是高手在悬 崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义我说过转印效率对 WB 结果不起打算因素。湿转、半干转缓冲液配方请参考

27、分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进展湿 转效果也格外抱负，通常这种缓冲液可以反复使用屡次30V，35V 四周的时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK 的，即使整张大板胶室温电转3hr 以后，最大电压仍为 18V因此足见其散热性能的优良。注明：以上半干转仪时间的要求是针对PVDF 膜的， 这里面有一个很好玩的问题。尽管厂家一再说明 PVDF 膜比 NC 膜对蛋白的截留更高但NC 带负电性，理论上它的吸附量应当更高，所以通常同样使用TBST 这种低盐洗液背景比PVDF 膜高，但 PVDF 膜对小分子的截留明显不如NC 膜，因此交联在预染marker 上的颜料小分子很简洁穿过

28、PVDF 膜，造成转膜过度的假象除可考虑提升甲醇浓度至 25%外， 也可以考虑增加 marker 的上样量；NC 膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白 1hr、大蛋白 3hrs，电流把握在 200-300mA16cm*9cm 大胶 300mA，假设胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于 2.5-3mA/cm2 左右。NC 膜唯一不如 PVDF 膜的地方，在我看来是它的强度：枯燥的膜易碎。固然目前某些厂家为解决这个问题，将 NC 成分涂在另一种介质的外表，这种膜的支持强度和 PVDF 膜类似，但转膜效率稍差于纯 NC 膜，且有明显的正反面；因此制作转印三明治的时候要特别留意正反面。此外

29、，20KDa 以下的蛋白宜承受 0.22uM 孔径的转印膜，但也不是确定必需。对于大蛋白转印，很多书本建议承受低浓度胶，如6% SDS-。但实际操作觉察，6%太软，制作转印三明治的操作格外麻烦；且内参如Actin、tubulin 都在 45KDa 四周，而 6%胶底边溴酚蓝指示 60KDa 左右，除非承受坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推举。个人阅历认为 300KDa 以下 8%胶底边 36KDa 都可以胜任，可以适当调整选择 7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。转膜最好在低温进展高温会局部溶胶或降低转膜效率，尽管很多半干转仪没有具体要求， 但用预冷过的

30、电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在 低温4 度进展。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20 度预冷，时间不能长于 2hrs，否则电泳液冻结；mini3 型有内置冰槽的，冰槽置-80 度预冷。制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好全都，否则没有胶、膜隔开局部的滤纸会由于直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电压流，造成升温过快。但 进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，假设每次都切割滤纸，消耗过快、初次使用的膜转 膜效率不高，且增加额外的操作。因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，但是我会选择已经 切割好的和胶面积最接近的滤纸；通常膜的大小会严格把握在与胶

31、面积全都或略小一点点。操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力气过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱除气泡完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如承受多层薄滤纸时可以一张张的叠加，更重要的作用是让膜和胶贴得更严密。可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更严密的接触无疑是转膜成败的关键。胶和膜需不需要泡呢？不少公司试验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有觉察泡和不泡的转膜效率有多大差异。实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可可以削减与滤纸或者膜之间的气泡；而膜也只要湿掉沾上电转液即可，同样多沾些缓冲

32、液会有利于削减气泡PVDF 要先用甲醇潮湿再投入缓冲液；NC 直接进缓冲液。如何监控转膜的效率呢？在早期，鄙人亦依据分子克隆的介绍，承受立春红染膜。只是后来觉察此操作不仅增加额外 的操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。首先，立春红也包括考染胶的灵敏度和HRP-ECL 体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB 结果会不会失败考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染，你照旧得连续后面的操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，或许只是另外一个分子量大小相 近的蛋白。因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必需进展后续的操作。而立春红染胶不 仅增加额外的操作

33、时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。那么为什么 不承受更直观的预染 marker 做转膜监控的依据呢？理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深说明有多少蛋白转印到膜上，格外直观、不会增加任何额外的操作固 定 marker 的上样量格外必要。固然上面提到针对 PVDF 膜，由于对小分子截留的局限，颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜颜料与蛋白交联得过深会使 整个 lane 糊掉；太紧多可转变蛋白构象使迁移率转变。所以多数状况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联，这意味着在某些条件下，颜料会从交联的蛋白上脱落，又由于膜分 子孔径以及膜对不同物质吸附

34、力气的差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸反面，而蛋白则 被结实的截留在膜上，造成转膜过度的假象。现在你知道有这种局限，要么更换 NC 膜；要么承受上面提到的格外稳定的转膜条件、留意必要的细节，就可从根本上无视掉其对转膜 效率的指示，而把预染的 marker 仅仅作为一个分子量大小的指针，固然同时可确认之前的转膜操作无误没有插反电极，放反膜，也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。不同公司预染的marker 效果不太一样，一般 NEB 和invitrogen 的常规分子量预染marker 要上 8-10ul，MBI 的只要 5ul胶大小 2030cm，Bioradmini3 型8.27.

35、4cm)MBI 最低 2.5ul 转膜后就足够清楚。抗体孵育WB 真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。对 WB 结果有打算性影响的因素是抗体的效价和假设正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上； 同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差 异的最大化。封闭最短可以缩减到 5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB说实话，常常看到坛子上很多人这样给人答疑，格外的无语；实际上封闭极端点也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释

36、液中的组分。当你的抗体使用次数较多时，基 本不用封闭也可以有较低的背景；假设抗体很，其实封闭最短可以缩减到 5min没试过更短的，不愿定不行以。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好主因，或者抗体稀释液的配方有问题增大抗体稀释比略微有所改善。封闭液的配方可以和抗体稀释 液一样，也可以不同；通常封闭液是最简洁单方的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。封闭很少出状况。不过在 milk 做封闭剂的封闭液中，milk 颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。紧接封闭操作的是抗体孵育，之间不要用 TBST 漂洗。抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量，包括抗体的效价和背景的强弱，然

37、而历来商品化的抗体质量参差不齐。各家生产的 抗体中质量问题最严峻的是scbt 的抗体，但它们的价格却是最廉价的。其实，scbt 在美国的售后效劳还是相当不错的，只要按他们的要求操作照旧能举证抗体的质量问题，可以更换、交换你指定的他们销售的另外一种抗体，有时候还会附送一些ProA beads 之类的，所以不惊异它的普及率；也正由于此，假设你参考文献的话很简洁找到这家公司的。惋惜，在国 内代理商不行能供给相应的效劳，因此购置他们的商品存在不小的风险。所以，通常我更推 荐 sigma 和 Abcom、R&D 等。诸如 Sigma 公司销售的Actin，cat. A5316，clone AC-74，M

38、ab 更是作为手练习专用的抗体；它的背景很低，效价很高，可以1：30,000 稀释是一般一抗效价的 30 倍。此外，尽管 cell signaling 是做磷酸化抗体起家的公司，但它们的抗体的质量总体感觉也不好，所以有其它公司可以选择时，我们会刻意避开购置 cell signaling 的产品， 诸如Akt 总抗和Ser473这两种抗体R&D 的产品效价不错。特别注明：前几年 CST 的 AKT 抗体识别的条带在 55KDa 左右，而其他公司均认定为60KDa；最近还有战友提问这个抗体，重检索了一下，应当是原AKT 抗体包括磷酸化 已经被 CST 自己下架了，从目前的几个抗体示意图看，大小也已

39、与其他公司全都；因此， 要不要买取决你自己抗体公司在出售抗体的时候，在广告上会玩很多把戏。A.不给整张膜标记的图示。很多抗体 质量不好，背景高杂带多，假设靶蛋白区域较干净时，他们通常只给很窄的一条靶蛋白区域的图例。B.不给内源性蛋白标记的图示，用IP 的样品取代。通过IP 可以富集抗原，削减杂蛋白，通常很简洁拿到背景很干净，信号很强的图例。C.用制备抗体时高表达的多肽做阳性样品，不给全长蛋白的图例。由于多肽可以IP 富集，且不存在空间折叠的问题通常暴露在外，因此很简洁标记。除以上把戏外，不少抗体用途上还有局限，因此选择抗体时要睁大眼睛。此外，有一点值得留意的是，scbt 销售的抗体外表上很多通

40、常 1ml，而别的公司通常是 200ul或者 100ul，然而实际上它的浓度也仅为 0.2，所以实际上他们抗体的质量也和其他公司的没区分都是 200ug常规。所以在早期，我始终强调假设固定即用型一抗的浓度稀释的一抗为 1ug/ml 时，scbt 的抗体最正确稀释比为 1：200。不过近来觉察，实际上他们的抗体 1:2K 稀释效价也不错，因此或许其他公司的一抗可以进一步提高稀释比。现在推断当时scbt 抗体之所以承受 1:200 稀释，实际上是由于自制的 ECL 不够灵敏，所以建议用灵敏性更好的ECL，这样可以削减抗体的消耗量，进一步降低试验本钱。一抗通常 4 度过夜，效率较常温 1-1.5hr

41、s 高；二抗通常 1:5K 稀释，室温 0.5-1hr过久并不会明显提高信号强度甚至会减弱相当于洗膜，同时造成高背景进一步影响特异与非特异荧光信号强度间的比照。孵育时间过久还会迫使你延长 TBST 的时间，这对抗原识别力气较弱的抗体更致命。洗膜通常用 TBST，也可以考虑高盐洗膜液NaCl 0.5M；洗膜时间一般 10min*3 或者 5min*4。抗体孵育和洗膜时，摇床速度不能过快也不宜过慢，需要简洁摸索一下。聊完以上那些浅显的根本常识，接下来谈我认为最麻烦的：首先，抗原抗体识别原理的物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合的动力学过 程。由于抗原和抗体特异性结合的效率是非特异性结合的

42、数百万数十亿倍，所以当特异 性抗体与非特异性抗体不好描述，指添加在抗体稀释液中的封闭蛋白，我们可以把它们看成非特异性的一抗竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白的浓度是一抗浓度20K：1 以上，在碰撞几率一样的条件下，由于时间的积存加孵育过程中反复漂洗孵育抗体要摇摆， 对吧，特异性一抗积存了识别、结合优势。同样在 TBST 等漂洗的状况下，由于亲和力等缘由，使得一抗很牢靠并进一步增加比照优势，再经过 2 抗特异性积存和ECL 的最终放大形成特异性条带和非特异性背景之间荧光信号的巨大差异。由以上碰撞结合、亲和力差异这些根本现象，我们可以解释WB 中消灭的现象。1.在样品制备章节中，我强调 PBS 漂洗

43、去培育基中BSA 的作用。当时只描述了不漂洗的后果，是在 BSA 位置任何抗体都可以非特异性的结合从而显影。用碰撞的原理去解释：当杂带很浓的时候，抗体的特异性已经毫无意义，它只符合物理定律中的碰撞几率原理；由于你 的杂带浓，碰撞几率大，粘附一抗的时机多，因此它就会显出来，但切记这是杂带。当杂蛋白含量高到确定程度，“任何”一种一抗都可以在该位置显出条带。因此，用条带的深浅去推断是否是靶蛋白，这是格外不科学的。在默认抗体有效的状况下， 假设抗原靠近区域没有杂带，背景干净，依据分子量大小可以初步确认靶蛋白的位置；假设 有杂带，并不愿定是特异性条带就比杂带亮，或许杂带蛋白浓度大，非特异性粘附的一抗更

44、多。目前推断杂带和靶蛋白的唯一标准是分子量；而当分子量大小类似时，只有通过增加过 表达或 IP 纯化的样品做阳性比照，或者 KD 该蛋白的样品做阴性比照一起电泳转膜，才能准确区分靶蛋白和杂质。用 IP 或 KD 样品也是验证商品化抗体是否有效的牢靠方案 2.WB 结果白板无信号和黑板高背景。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题固然也可能与ECL 显影有关，此点下一节有阐述，白板主要是可能是抗体本身效价不高，或者抗体稀释液中封闭蛋白过多，竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性的一抗，特异性条带和 非特异性背景同样结合强度无信号。黑板，也主要是由于抗体效价不高，而抗体稀释液 中封闭蛋白的拮抗作用又没有完全

45、发挥，此时无法有效识别抗原的一抗会等效的粘附转印膜 的任何位置，显影后整张膜全黑。有时候膜接近全黑，但可以假设有如无的观看到靶蛋白，消灭问题的缘由虽然仍是抗体效价不高，封闭蛋白不能完全起到作用，不过此时可以通过转变抗体稀释液的配方，提高特异性和非特异性结合的信号差异，降低背景。“这点格外重要”当你的抗体标不到抗原时白板，先弄出条带黑板，再解决黑板高背景问题。第一步应当是通过倍比降低一抗的稀释比从 1:1K 降到 1:500 到 1:250 到。；注：二抗稀释比不要轻易转变，增加二抗浓度对 WB 结果不会有太明显的转变，摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能格外高，但背景

46、的问题可以再调整，有没有特异性条带却没方法转变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公 司生产的抗体。那么如何通过转变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最正确条件呢？首先要认清，抗体稀释液没有一个确定通用的配方；一种抗体一个脾气。其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA 和 gelatin，似乎很少的样子 。可是，你有没有考虑过“复方”？这下配方无限多了吧。1. 承受milk，BSA 和 gelatin 的单方。3% milk，5% BSA，=0.4%的 gelatin，并依据实际状况转

47、变假设消灭白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加。gelatin 大家可能比较生疏，不过假设你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会觉察很多抗体溶液里都有它。 2.很多状况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比方 gelatinBSA 时，gelatin 浓度不能无限提高会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板，BSA 的浓度较任凭。3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液NaCl 0.5M以降低背景； 但是切记，有的抗体对盐浓度敏感，包括构象和溶解度，因此需要尝试。假设以上策略照旧无法解决高背景，

48、可将稀释好的一抗先跟寻常试验剪切下来的membrane 的边角料的放在一起孵育个把小时再用。假设还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别的公司或者抗别的区段的同种抗体。这三种封闭蛋白的差异：milk 和 gelatin 封闭效果不错且价格廉价，但 milk 简洁发霉变质，且国产 milk 脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？；BSA 封闭效果不佳，且价格较昂贵。个人推举 gelatin，gelatin主要成分是骨胶原，蛋白很大，但可以通过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小的蛋白。通常，我会将gelatin

49、加到 TBST 中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶的gelatin 会渐渐溶解；由于gelatin 可以灭菌milk 不行以，所以同样条件下，gelatin 的存放时间明显长于 milk。实际上，抗体可以反复用很久通常一般的抗体常规稀释比，可以连续用一个月以上；对于老手用过 2、3 次的旧抗体更 prefer，因此背景降到很低而效价正是最高的时候，通常抗体最终失效的缘由不是由于使用次数过多，而是染菌；比较旧的抗体都会有很多的沉淀在底部，更长时间还会有异味。稀释的一抗靠添加 NaN3 并于 4 度保存延长使用时间；二抗不能加 NaN3，但放在-20 度反复冻融延长使用寿命抗体并非确定不行以冻融； 只

50、是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响。抗体稀释液一抗、二抗稀释液也可同也可不同和封闭液可以一样，可以不同，由于抗体稀释液可以承受复方的，所以即使混合了少许，不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封 闭液用milk 时，gelatin 稀释的一抗混入少许milk 会影响其使用寿命。由于以上诸多可变因素，实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液只能是多数通用，因此对待具体问题时，请具体对待多花点心思摸索吧。原装抗体的保存：1. 分装。每次一管，但是可能太多占地方，而且还会有粘壁的损失，不是很推举。2. 1：1 加甘油，冻于-20 度，可长期保存，此方法实际上也被很多国内的试剂公司广泛承受， 诸

51、如博士得，中杉，它们小包装的进口抗体通常都是1：1 添加甘油保存于-20不信去查查 。值得留意的是：不是全部的抗体都可以 1：1 添加甘油，要以抗体说明书为准，假设说明书中本身存在甘油，或特别注明外，通常可以承受。显影淬灭的祸因当抗体孵育、TBST 漂洗完毕后，进入 ECL 显影步骤。固然，目前国内一些试验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL 和常规的底片显影都省略了， 因此以下所争论的某些细节问题可能不再消灭。首先坛子上还有少数试验室处于DAB 显色时代，奉劝一句，都走到最终一步了就不要节约了；DAB 显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简

52、述一下其原理：交联在二抗上的HRP 酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL 中主要包含两种成分，催化剂和中间递质白色瓶子主要是过氧化物如双氧水。催化剂的作用不用废话了，其中间递质主要是吸取化学能并将其传递到luminol 之类的化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。因此催化剂的效率和中间递质的传递效率直接影响荧光的强弱。本人曾自制过ECL 并尝试改进，其间觉察很多化合物、金属离子如 Fe、Cu 等能催化并高效传递能量，且不依靠于HRP 浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到的一些粹灭缘由有联系。当时我自制的ECL 最大的毛病在于稳定性不好，同理，商品化的ECL 同样也有保质期的问题，往往最先

53、失效的组分就是过氧化物，尽管他们必定添加过抗复原剂。其实，检验 ECL 是否失效的方法很简洁，取稀释的即用型二抗 1-2ul 加至ECL 混和液中观看荧光强度，即可知道ECL 是否失效。商品化的 ECL 价格并不廉价，因此 ECL 孵育的最正确方案是：将 ECL 滴加在保鲜膜上或干净的支持物上，如废弃的旧底片、塑料盒，有机玻璃盒等等留意，国产的保鲜膜很多质量不过关，有两种潜在的问题，下面详述，然后倒扣膜于保鲜膜上，夹住一个角来回拖动数次至 ECL 均匀有的产品说明书要求孵育 1min。另外平铺一张干净的保鲜膜，将膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后显影。mini3 型胶整张膜孵育，ECL 总体积

54、0.7-1ml 足矣。哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？这局部实际上与导致荧光淬灭的因素局部重合1. 保鲜膜的质量。a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL 滴加到保鲜膜上简洁从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL 反响不充分，另一方面ECL 所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒或许你或其他人曾经不留神打翻过某种化合物、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉全部的HRP 酶，荧光转瞬即逝。b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。目

55、前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL 显影。假设买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别留意这些支持物外表的干净， 最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST 盐结晶颗粒。2. ECL 孵育完毕后膜需要控干。中学物理学过水会吸取光谱，因此任何液体包括ECL 溶液本身都会干扰荧光强度，所以 ECL 孵育完毕时需要控干。一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请留意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的 ECL，膜彻底干掉后荧光会消逝；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会上升，而且会严峻影 响重标记抗体时的背景。因此，依据我的方法，让自

56、由流下的多余的 ECL 被吸走就好。3.控干的膜要认真用保鲜膜包被，防止接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要 细心，尽量不让正面保鲜膜和膜之间消灭皱褶。皱褶的地方会积存多余的 ECL，要么形成一条荧光的亮线；要么由于液体吸取荧光或者局部区域HRP 过度消耗，呈线条状淬灭。4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观看一下荧光信号的强弱，这有利于推断试验可能消灭的 问题。很多人提问观看很强的荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭闪灭，再怎么快速操作也拿不到这种状况下的荧光信号造成的；有这个观看至少能够推断 ECL 孵育之前试验操作应当问题不大，而问题主要是淬灭。假设你省略这个步骤，那问题

57、就格外简洁了，由于之前任何操作都可能导致白板，根本无法推断。除上述的问题以外，还有哪些因素会导致荧光淬灭呢？1. 抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳的章节就曾提过，假设上样量太大， 不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。由于局部区域过多的HRP 酶会快速消耗底物呈富氧态，条带消灭烧灼样取出膜会觉察一条明显的暗黄色的带，荧光信号会闪灭或者条带空心条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效。2. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不行见。3. ECL 试剂质量。除过氧化物因接触空气被渐渐复原外，ECL 的成分通常都不稳定。如呈递电子跃迁能的中

58、间递质其化学性质就不太稳定，由于它转换能量的特性打算其必是一个有中间态的化合物，长期接触空气会被渐渐氧化失效；luminol 也有保质期。4. 操作时间过长，膜渐渐彻底干掉。商品化的 ECL 会消灭波形渐变，开头信号渐渐增加， 背景一起上升；随后荧光完全衰减淬灭。5. 不良的试验习惯。坛子上曾经有人问及淬灭问题，提到显影夹子很脏。脏的显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，前者造成闪灭催化作用，后者可能直接导致无荧光；只要有任何失误，诸如不留神刮破保鲜膜，保鲜膜包裹不严实其实通常还真的不严实，由于你不行能包裹好几层。于是，我问他用一个很脏的东西不觉得很别扭嘛， 为什么不先抄起抹布

59、擦干净再用呢。6. 淬灭的假象。少量沾在膜外表的二抗也会激发荧光，但 ECL 孵育时略微晃动就消逝了， 可能产生淬灭的错觉。Stirpping：完整的WB 流程完毕后，可能需要重标记某些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不愿定必需，那么首先争论一下stripping 的必要性。Stripping 排解其他的不讲，整个流程会消耗不少的时间，从节约时间的角度来讲能不做最好； 并且 stripping 条件过于猛烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜外表的抗原使WB 的最终信号减弱；此外，stripping buffer 未去除干净时，其中的某些组分确定会干扰其次种

60、抗体的结合。那么在什么条件下不需要stripping 呢？1. 当 A 蛋白和B 蛋白分子量差异 5KDa 以上10KDa 左右更保险，可将膜分割开分别标记不同的抗体，这样就不需要 stripping 膜重标记，且一次就能得到想要的结果。有人会将两种抗体混在一起标记整张膜，这样操作的前提是格外生疏这两种抗体的杂带位置，且 各自的杂带都不会干扰目的蛋白才可以如此操作；并且这样的抗体下次使用有了局限性，因 此不太推举。2. 两种抗体种属来源不同时，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置格外靠近无法切膜，这时候也不愿定需要stripping。轮番标记这两种不同的抗体时，只需要用 TBST 涮掉外表的ECL，

61、 时间可长一时腾不出手来就扔在那边始终漂，中间可以换换液可短换液涮两三次，然后直接用其次种抗体标记同一张膜。不过，假设其中一种蛋白显影太强，隔天显其次种蛋 白时可能会消灭干扰可能强可能弱；但只要两个蛋白不是同样大小或者连在一起了，可以在最终作图时用PS 切出来。3. 当两种抗体种属来源一样时，有一种状况也不需stripping，诸如标记某蛋白的磷酸化和总蛋白时。由于磷酸化抗体通常识别力气较弱相对于总蛋白而言，信号一般都不太强，此时也仅需简洁的漂洗；但标记的挨次确定是先标磷酸化后标总蛋白。以上避开stripping 主要从节约时间的因素考虑，实际上当上述2、3 点存在时，个人还是会用 strip

62、ping buffer 简洁漂一下，然后用TBST 换液漂洗 3 次再上其次种抗体；但假设时间较紧，就会真的省略。Stripping 膜至少有三种方法：A. 用 TBST 始终洗膜，洗 8hrs 以上就可以去除多数蛋白的信号，信号过强的蛋白如内参除外。所以，当你的抗体格外弱的时候，孵育过夜实际上相当于 stripping，的信号不会消灭， 原来的信号也会被漂洗干净，消灭白板。B. 请参考millipore PVDF 膜附送的说明书配方没有，请Google，上面提到假设信号很强，可以在 50 度反响。需要提示的是，由于巯基乙醇亦挥发，可以考虑临时添加。C. 假设做过 IP，你就知道可以用低 pH

63、 的Glycine-HCl 洗脱beads 上特异性吸附的蛋白。同理，0.1M GlycinepH2.5,30min也可以用于 stripping 膜，这是最廉价的高效洗膜方案。而且经过TBST10min*3漂洗后，膜上的 pH 早就恢复到正常值，此时不存在上述 stripping buffer 残留成分干扰其次种抗体标记的状况。假设第一种蛋白信号过强，同样可以在 50 度stripping 提高洗膜强度。此外，膜风干后，外表结合的二抗也会脱落，不过不是很推举。看完 stripping 这个局部，再多想一层，你确定会找到同一张膜屡次标记不同抗体的窍门。假设有A、B、C 三种蛋白，因分子量过于接

64、近无法切膜：a. 假设A、B 的抗体同是兔抗，C 的抗体为鼠抗，则最合理的标记挨次为 A-C-B 或者B-C-A。b. A、B、C 的抗体同种来源，A、B 几乎在一起，条带粘连；C 靠下。假设A、B 重要性差不多、B 信号稍弱，则 B-C-A；假设 A 的结果是最关键的，尽管 B 信号弱，一般还是 A-C-B。由于，经过两次stripping buffer 洗脱，且两轮WB 流程的时长都超过 8hrs一抗习惯 4 度过夜孵育，实际上在标记第三种抗体时，相对于经受了 3 次不同强度的 stripping；不要担忧第一种抗体还会有很强的干扰。如何正确使用 Quantiy One 定量：以下文字系摘录+改写整