WB常见问题的解答

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1、Western Blot 详解Western 免疫印迹Western Blot是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测。对表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进展检测，对基因的表达产物，可通过融合局部的抗体 检测。本文主要通过以下几个方面来具体地介绍一下 Western Blot 技术:一、原理二、 分类i. 放射自显影ii. 底物化学发光 ECL iii.底物荧光 ECFiv.底物 DAB 呈色三、 主要试剂四、 主要步骤五、 试验常见的问题指南1. 参考书推举2. 针对样品的常见问题3. 抗体4. 滤纸、胶和膜的问题5.Marker 的相关疑问6.染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常

2、见问题9. 条件的摸索10. 方法的介绍11. 结果分析一、 原理与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 承受的是聚丙烯酰胺凝胶电泳， 被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 分别的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分别的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的其次抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分别的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类现常用的

3、有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和试验条件的是用第一种方法， 目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简洁，原理如下二抗用 HRP 标记：反响底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、 丙烯酰胺和 N，N-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4避光保存。严格核实 PH 不得超过 7.0，因可以发生

4、脱氨基反响是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重配制。如 有沉淀，可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH O 去离子水配制，室温保存。23、 分别胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCl (pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/L HCl 混合，加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40保存。4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/L Tris-HCl (pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH O 中，用约 48ml21mol/L HCl 调至 pH6.8 加水稀释到 100ml 终体积。过滤后

5、 40C 保存。这两种缓冲液必需使用 T ris 碱制备，再用 HCL 调整 PH 值，而不用 Tris.CL。5、 TEMED 原溶液 N，N，NN四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反响受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。供给两种丙稀酰胺聚合所必需的自由基。去离子水配制数 ml，临用前配制.6、 SDS- 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液 8ml，甘油 6.4ml，10%SDS 12.8 ml，巯基乙醇 3.2ml，0.05%溴酚蓝 1.6ml，H O 32ml 混匀备用。按 1:1 或 1:2 比例与蛋白2质样品混合

6、，在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量 100g。7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml， 得 0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释 10 倍。8、 转移缓冲液：配制 1L 转移缓冲液，需称取 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS， 并参加 200ml 甲醇，加水至总量 1L。9、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时上述储存液稀释 10 倍即成丽春红 S 使用液

7、。使用后应予以废弃。10、 脱脂奶粉 5%(w/v)。11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、 Tris 缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCl(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 过氧化物酶标记的其次抗体。15、 NBT(溶于 70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、 BCIP(溶于 100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、 100mmol/LTris-HCl(pH9.5)。18、 100mmol/L NaCl。19、 5

8、0mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/L EDTA。可以参看分子克隆四、主要步骤生物秀为您搜集了现阶段几乎网上全部的 Western Blot 的中英文资料，仅供试验参考，可以依据自己试验的实际状况进展调整：Western Blot PROTOCOL;五、 试验常见的问题指南依据问题的类型主要分成以下几类以下资料权作参考，请勿盲目仿照！ ;1. 参考书推举A. 对初学者看什么资料比较好？解答：抗体技术试验指南和 Antibodiesa laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane两本书不错。2. 针对样品的常见问题B.

9、做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot 以下简写成Western Blot，提取线粒体后冻存未加蛋白酶抑制剂，用的博士德的一抗，开头还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加 到 120g，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么缘由？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？解答：疑心是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同 时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 同一蛋白样品能同时进展两种因子的 Western Blot 检测吗？解答：固然

10、可以，有的甚至可以同时测几十种样品。D. 假设目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要留意什么？解答：假设是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温顺得多，这时最好加上NaF 去抑制磷酸化酶的活性。E 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时常常会觉察只有一局部蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶觉察有的孔全部的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办 法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用削减电流延长时间，多加51 0甲醇。F. 想分别的蛋白是分子量 260kd 的，SDS- 电泳的分别胶浓度多大适宜？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白简洁作 West

11、ern Blot 吗？解答：260kd 的蛋白不好做， 分别胶用 6， Stacking Gel 3.5。G. 假设上样量超载，要用什么方法来增加上样量？假设需要加大上样量使原来弱的条带 能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以依据你的目标分子量透析掉一局部小分子蛋白。一般地，超载 30是不会有问题的。假设已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度， 可以试试 1.5mm 的 comb。H. 蛋白变性后可以存放多久？解答：80，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。I. 我所测定的蛋白分子量是 105KD，按理说分别胶应当承受 7.5%，

12、但我所查资料却要求分别胶和浓缩胶均承受 11的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，由于 105KD 的蛋白在上述两种胶的线性区分范围内，但需留意条带位置。J. 接下来我预备承受 DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知承受这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5的脱脂奶粉呢？似乎有资 料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，由于脱脂奶粉中含生物素，用 BSA 代替应当好一点K. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：Western Blot 一般上样 30100 微克不等，

13、结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开头摸条件时，为了拿到阳性结果，各个 步骤都可以量多一点时间长一点，固然背景也就出来了。要拿到好的结果，假设抗体好的话比较 简洁，抗体不好的话就需要反复地试了，固然有的不适合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不简洁。L. 做组织样品的 western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比 BSA 好一点？解答：必需进展研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更猛烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。

14、还有一点就是组织中的蛋白酶 活性更强，需要留意抑制蛋白酶的活性参加 PMSF 和蛋白酶抑制剂 cocktail，封闭剂一般 5% 脱脂奶粉较常用。假设一抗为多克隆抗体，使用 BSA 也是不错的选择。M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白 200KD，在做 western 要留意什么呢？解答：做 200kd 蛋白的Western Blot 时要留意，分别胶最好选择7%的；剥胶时要留神； 转移时间需要相应延长；要做分子量参照否则消灭杂带不知道如何分析。N. 有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。O. 我要检测的目的蛋白是分子量或许为 42kd 的膜蛋白，膜蛋白提取可

15、不行以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法， 42kd 的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，而不是只需要提取膜蛋白，可以用Ripa buffer 提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做 Western Blot 就可以了。假设是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以依据一般的转移方法实施。P. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答：上样量要依据试验的要求来定， 假设要求是定量和半定量的 Western Blot 则上样量要均等， 假设只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过 0.3g/m m2。Q.

16、 一抗，二抗的比例是否重要？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特异的本底。3. 抗体R. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？解答：对二抗无要求，要看你试验条件来选择，一般推举用 HRP 标记的二抗。S. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么 样的稀释度比较好呢？我用的 ELL+plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，假设封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最正确的抗体稀释度也是不一样的，需要你试验摸索。我觉得转膜过夜似乎没有必要吧，转膜的目

17、的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必铺张时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还 是湿式。一抗固然可以过夜，假设你想所短 Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度， 我们试验室一般 37 度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度， 你可以一抗 1：1500；二抗 1：20230 试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭； 一抗和二抗后至少是 5x5min，跑一张好膜不简洁，多尽点心吧，这样不会铺张你的时间，只会节约你的时间！T. 免疫组化和Western Blot 可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体

18、识别的是未经变性处理的抗原打算簇又称表位，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象 型表位由于受蛋白空间构造限制，煮后变性会消逝。假设你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几 个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而假设抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。限 于单抗U. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主见储存反复使用，但是如抗体比较贵重，可反复使用 23次。稀释后应在 23 天内使用，4 度保存，避开反复冻融。4.

19、 滤纸、胶和膜的问题V. NC 膜 PVDF 膜 尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较抱负的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最廉价；PVDF 膜介于二者之间。就结合力量而言：尼龙膜结合 DNA 和RNA 力量可达 480600g/cm2，可结合短至 10bp 的核酸片段；硝酸纤维素膜结合 DNA 和 R NA 力量可达 80100g/cm2，对于 200bp 的核酸片段结合力量不强；PVDF 膜结合 DNA 和 R NA 力量可达 125300g/cm2。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照耀后，核酸中的局部嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜

20、依靠疏水性相互作用结合 DNA，结合不结实；PVDF 膜结合结实，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易裂开；PVDF 膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用； PVDF 膜可以重复使用。W. 在做Western Blot 时，PBDF 膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更简洁跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。X. 检测磷酸化的 JNK 和非磷酸化的 JNK 可以在同一张膜上吗？解答：可以。AA.

21、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端即点样空的一侧的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 承受 tank system 有什么讲究？解答：建议低电压，长时间，一般 tank System 用衡压好点，如 28V 1416hrs。DD. 做 HSP WESTEN 定量，同样的抗体免疫组化能做出，而 WESTEN 却不能？解答：这多半是抗体的问

22、题，要看抗体的说明，是否能做 Western Blot 和 IHC。EE. 膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF. 假设是 68 转印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀释度是有说明的，依据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积 一般最少为 35ml。GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能到达最正确效果。解答：无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么缘由呢？是有的成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。假设过夜，胶里的水分被蒸发，承受保鲜膜包上也可以；也可能母液30% 聚丙酰胺有问题，你可以重配制一

23、份观看；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂， 避开找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：假设是用的是半干转，挨次为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽 分别比胶小 12mm，而膜的长宽分别比胶大 12mm。确定禁忌：上下两层滤纸由于过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分别小 21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd 和 66kd 可以一起转，12SDS-， 湿转 36V ， 35hrs 就可以了， 可以依据你试验室的阅历调整；170k

24、d 用 7%SDS， 48V 10hrs16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中参加20%甲醇是指终浓度(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，由于甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和 NC 膜的结合力量，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液参加终浓度 0. 1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的 NC 膜0.2 微米；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至 6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流； 增加转移时间。LL. 如何选择最适宜的蛋白杂交膜？解答

25、：蛋白质印迹杂交是分子生物学试验中极为常用的一门技术。选择质量上层、符合要求、便利适用的杂交膜是打算这项试验成败的重要环节。依据杂交方案、被转移生物大分子的特 性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选 择。硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是格外清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合， 从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。依据被转移的蛋白分子量大

26、小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。由于随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越结实。但是膜孔径假设小于 0.1mm，蛋白的转移就很难进展了。因此，我们通常用 0.45m 和 0.2m 两种规格的硝酸纤维素膜。大于 20kD 的蛋白就可以用 0.45m 的膜， 小于 20kD 的蛋白就要用 0.2m 的膜了，假设用 0.45m 的膜就会发生“Blowthrogh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合力量主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素， 因而降低了蛋白的结合量。S&S 公司承受的是 10

27、0%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达 80-150g/cm2。由于 100%的纯度，因而也大大削减了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF 转移膜：PVDF 是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF 膜可以结合蛋白质，而且可以分别小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，由于硝酸纤维素膜在 Edman 试剂中会降解，所以就查找了 PDVF 作为替代品，虽然 PDVF 膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋

28、白测序抱负的用品，始终沿用至今。PVDF 膜与硝酸纤维素膜一样，可以进展各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种 PVDF 膜，灵敏度、区分率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，格外适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇进展浸泡饱和 1-5 秒钟。离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF 膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是依据离子交换的方式结合生物大分子的。由 DEAE二乙氨乙基修饰的纤维素制成的 DEAE 阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE 可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10 以下，DEAE 基团

29、都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的 pH 环境为 5-7。DEAE 膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的争论。这种 0.45m 孔径的 DEAE 膜，除了可以做 Western Blotting 外，还可以用于核酸结合争论。还有一种离子交换型膜是羧甲基CM 修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合 pH 范围在 4-7。结合的多肽分子可以从 CM 膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。5. Marker 的相关疑问MM. 我用的是可视 markerBIO_RAD，但是电泳总跑不全 8 条带，请问什么缘由？怎样改善？胶用过

30、8，10，12，都是这样。marker 是买的。解答：一般来说，是小分子量Marker 跑走了，增加胶浓度或削减电泳时间试试看。固然梯度胶也是不错的选择。NN. 用的是 Roche molecular Biochemicals 公司的由 100kd，75kd，45kd，30kd，20k d，10kd 组成的 marker。开头做Western Blot 时还能够看到 marker，固然也仅能观察其中最多三条带。用 80V 进展 SDS- 电泳，用恒压 10V45min 转印的。前几次做 Western Blot 时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到 marker 有一条大约是 30

31、KD 的条带消灭。再就是把 70KD 和 130KD 两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白 C 端的 V5 表位的酶联抗体Anti-V5-HRP。但就是出不来结果，我很茫然。感谢您过赐予教导！解答：1、“我用的是 Roche molecular Biochemicals 公司的由 100kd，75kd，45kd，30 kd，20kd，10kd 组成的marker。开头做Western Blot 时还能够看到 marker，固然也仅能观察其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清楚， 集

32、中。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不严密。转移是多加点 甲醇。2、“前几次做 Western Blot 时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到 marke r 有一条大约是 30KD 的条带消灭。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就 30kd-50kd 的转移地比较好。3、“再就是把 70KD 和 130KD 两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C 端的 V5 表位的酶联抗体Anti-V5-HRP。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性比照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到 1. 5hrs

33、。6. 染色的选择OO. Western Blot 哪种染色好？解答：1阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可到达 1. 5g，考马虽然与氨基黑有一样的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S 和快绿在检测后简洁从蛋白质中除去，以便进展随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2） 胶体金，灵敏度高，检测范围可到 pg 级，但染色比稳定。（3） 生物素化灵敏度位于 1、2 之间，可用于任何一种膜。7. 参照的疑问PP. 是否Western Blot 试验半定量肯定要加 ACTIN 内参？解答：对于发表文章的试验最好加

34、内参，试验严谨。QQ. 用 BANDSCAN 分析结果行吗？解答：分析一般的结果没问题。RR. 核内抗原Western Blot 内参选择什么适宜？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参， 在网上查查就可以选出你要的内参。SS. 转膜时承受电流是否比电压准确，是否依据 0.8mA/cm2，一般 1 小时左右？解答：不是的， 半干法推举用恒流，一般依据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的 Western Blot，内参 B-actin，GAPDH，那个好？解答：选用 beta-actin 就可以。8. 缓冲液配方的常见问题UU.

35、转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂 A 是什么？还有 Tris-HCl 是不是就是用 Tri s 和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的 TBST 脱脂奶粉。TrisHCl 就是 Tris 盐用 HCl调 ph 值，配置而成。VV. 预备做大鼠脑子的 Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必需要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的 发生？解答：可以用提取总蛋白的 buffer 提核蛋白，可以加 NaF 防止去磷酸化。WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？ 胞膜

36、和胞浆有区分吗？解答：一般来说提取时参加光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献 特别指明用特别的方法，一般来说都没有区分。XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过， 有条带。底片和显色液及 DAB 显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量 67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本-20 度放置一周内测。2、一抗放置 2 年， 可能效价不高！用的是 1:100。假设是一抗的缘由，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，由于一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含 15%脱脂奶

37、粉 TB ST，漂洗液用的是含 1%BSA 的 TBST 液，TWEEN-20 为 0.1%，不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找缘由。1. 封闭液用 5Milk，漂洗液washing buffer用 TBST2. 看看一抗是否能 work，降到 1：20。3. 看看二抗是否有问题。YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着肯定的固定作用，由于小分子蛋白质简洁转出去.(特别是在硝酸纤维素膜 上，由于 NC 膜结合蛋白质的力量较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是 5%的 TBST 脱脂奶粉”，其中 TBST 最终那个 T 是Twee n 吗，浓度多大？解答：是 Tween

38、，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Twe en-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比方现在我就在室温里做，或者要在 4 度下?解答：均可在室温进展，假设时间不够，一抗

39、孵育可以先在室温进展一个小时，然后 4 度过夜。BBB. 试验室暂无 NP40 我用 sds 可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，颖参加：65mM DTT蛋白酶抑制剂：试剂盒 HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白主要是想得到其中的膜蛋白是 否可行？改进的 RIPA 裂解缓冲液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%;脱氧胆酸钠， 0.5%

40、; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin，2 g/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的 EDTA， 是否用做蛋白酶抑制剂？解答：做2-D 对不推举使用 NP-40由于即使进口的 NP-40 也不纯，其中的杂质会影响质谱结果。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱相对于组织和大肠杆菌等，可以不使用coc ktail，由于 7M 尿素+2M 硫脲+4%CHAPS 构成的变性环境已经足以抑制大局部蛋白酶的活性， 2M 硫脲+4%CHAPS 对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过假设您专职做膜蛋白建议承受分级抽提法。此外还可以承受梯度离心法和

41、一些基于去垢剂的方法。EDTA 用于灭活金属蛋白酶主要是其鏊合作用。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做 WB 无所谓，做 MAILDI 时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在 2-D 裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：供给连续的 PH 梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一局部核酸)；也不推举承受 SDS，因SDS 会与蛋白质结合导致其等电点发生转变，假设您实在要用，终浓度降到 0.1%以下。METHOD250ml 总量：?-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH O

42、至 50 ml。2方法：将用过的膜浸入 stripping buffer 中，置 50水浴箱中 30min，连续振摇。之后用 TTBS洗 3*5min 就好。此时你已经可以按的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35l2、10%SDS 1ml3、tris (0.5M，pH6.7) 625l4、dH O 3.34ml50-55，30min。2METHOD4stripping buffer 应当是可以放置很久的。不过我习惯于现配到底，加了-mercaptoet hanol 以后太难闻了，配了就用；而且，有了

43、现成的Tris-HCl 缓冲液和 SDS 的母液，现配还是很便利的。每次用量 5ml 少了点，我每次用 50ml。METHOD50.5M NaCl，0.5M HAc；室温摇床 15min。METHOD6将用过的膜泡在 1*TBS 中室温振摇过夜，中间可以换液 2-3 次，然后封闭，加一抗，二抗同第一次发光，实践证明方法完全可行。不管用那种方法，洗脱后都要用 PBS 或 TBS 再洗几次。9. 条件的摸索DDD. 用的是 Santa Cruz 的抗体，也试验过一抗和二抗确定能结合，二抗加DAB 确定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与 Marker 对应的条带是否是我要的我目的蛋

44、白的分子量分别是 55KD、29KD。半干法 2 小时转膜后，丽春红染色觉察大分子量蛋白转过去的较少。莫非是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和或许叫 Apopti n 的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80 度冻存的细胞，4 度 12023g 离心 5 分钟，取上清，与分子克隆其次版上的加样 buffer 混合，沸水变性 5 分钟，上样。不知道是哪里出了问题？解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用 PIERCE 公司的 BCA 试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应当在几-20 微克/微升。2、假设是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量

45、 分别是 55KD、29KD，建议分别用10和 12的胶。60-80V，1 小时左右。跑过积层胶与分别胶的线时，换用 100V，3-4 小时。3、转膜，建议恒压，15V，不用转 2 小时，45 分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是由于在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过 2 小时，但和 45 分钟的区分并不大。4、依据 MARKER 的条带我的是 7 条带：14、18、25、35、45、66、116KD，您依据 MARKER 的条带剪下 25 与 35 之间29KD的条带，45-66 之间50KD的条带。这样第一，可以节约抗体，其次，您要的目的条带确定在上面。5、延长

46、1 抗、2 抗孵育时间我曾室温 1 小时，4 度过夜，适当加大 1 抗浓度。6、我买的也是 Santa Cruz 的抗体，我觉得质量还可以，我想您应领先找其他方面的缘由。EEE. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100 分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100 分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不同。所 以，我想问题应当出在抗原和一抗上，不知对不对。解答：电泳的条件：样品的分子量打算了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和 10kd 左右蛋白跑在一起。由此可以打算电泳的电压和时间。建议你用恒压 80100 伏。FFF. B

47、IO-RAD 的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温我用的就是这种， 当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的状况下，就很简洁烧胶。就转膜时， 是实行恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很简洁烧胶，我的胶有 68cm2，用50mA 恒流来转膜，刚开头电压就很高，有20 v 左右，而用恒压，开头电流有110mA，但 15min 后，电流就降到 8OmA，30min 后就稳定在 40mA，不就相当于恒流吗？解答：恒流时电压渐渐上升的缘由是湿滤纸渐渐变干因而电阻渐渐增大的原因，假设电压 升得太快，可以使滤纸更湿一些以抑制。就我的感觉， 20V 的电流 3

48、0min 以后 20Kd 以下的分子丧失很多，不过我用的是小胶 40cm2，不知有无不同。GGG. 我想尽量提高转膜的效率我的试验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白不知道有那些方法？解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全电压过小时间过短或过度转移电压过大时间过长的问题，鱼小分子量蛋白和熊掌大分子量蛋白不行得兼呵呵。建议把胶切成 两半，比方以 35KD 为界，分别进展转膜，下半时间短，上半时间长一点，应当会好一些。HHH. 请问一下 PVDF 膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白简洁掉下来，结果较差。尼

49、龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合注：常用的 PV DF 即带正电荷的尼龙膜，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话， PVDF 膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。III. 1、煮好后的样品，假设没有准时上样分别，应如何保存，可以保存多久？ 2、有没有人在用 bio-rad 的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是否必需要用 bio-rad 的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，由于我要分别小至21KD，中至 66KD，大致 170KD 的蛋白质，转移条件能够一样吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分别的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在

50、这个范围内也能分别，只是就不是线 性范围了？解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。2、bio-rad 的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页 Bio-Rad USA 上有。3、转移时一般的 WATERMEN 滤纸就可以。4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让 ptglab 帮你定夺。5、凝胶的浓度也是和分别蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分别效果可能不是你 所期望的。JJJ. 怎样设计试验来确定最正确的条件？解答：任凭说一点， 具体的还是需要自己想：1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，也可以跑 1 个大 w e

51、ll， 不插梳子，多上样，SDS-；2、转移， 设定电流或电压；3、每隔 1or n 小时，取一点膜染色，看转移效果。KKK. 我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法 strip 最好，我用甘氨酸PH2.9漂洗 15 分钟，似乎没什么效果？解答：你可以加巯基乙醇loading buffer 一样的浓度，56 度， 30mins，看看。LLL. 1、在用 PBS 洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose 复合物时，每次要重悬多长时间适宜？ 2、最终用 2xSDS 重悬抗原-抗体复合物离心后，由于 2XSDS 中已经参加了溴芬兰，因此下面的 Agaro

52、se 珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了 Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些 Agarose 也不要紧呢？解答：1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。2、加 2X BUFFER 前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时留神点就是了。我也试过一些次，首先离心略微长一点，长 20 秒吧，期望胶粒能沉得结实点我想象的，再吸取。假设感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是遇到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力 做好就是了。MMM. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否肯定要加 NaF 等？解答：NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不

53、加也可以，大局部时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。NNN. Western Blot 中 block 的最短时间?解答：每一步 1 小时足够了，中间换抗体要洗的话多换液几次，每次时间 10 分钟就够， 洗 3 次只要半小时。跑胶 1 小时，转移 1 小时，block 半小时就行，1 抗 1 小时，洗半小时，2抗 1 小时，洗半小时，显色10 分钟。一般跑两块胶，一块染色，一块western。一天确定完事， 一般不用等到其次天。OOO. 想用Western 检测基因转染后细胞培育上清中表达的目的蛋白定性，分子量为20KD，浓度约为几百 ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、

54、纯化上清液中的目的蛋白？ 对小分子蛋白 Western blot 时需特别留意哪些条件？解答：依据你供给的浓度，假设做 Western Blot，是不用浓缩样品的. 对于 20kd 的小分子的蛋白，Western Blot 中要留意的是：1、转移时的时间，2、转移时的电流或电压.3、transfer buffer 中加 20%的甲醇.4、可以用 13-15%的分别胶.PPP. 蛋白分子量大小分别为 21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用 2.5 A/c m2， 30min 就应当够了。湿转，依据 b

55、io-rad 的说明，用 100mA，也得要半个多小时吧。QQQ. 需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？解答：将膜放入stripping bufferSDS 2%，TrisCl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巯基乙醇100mM中，50孵育 30 分钟，TTBS 西三次，再重参加一抗，进展另一种抗原的检测。RRR. 做Western Blot 试验时，觉察转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低. 100V 恒压转膜时的电流只有 190mA 左右，而以前都有 250mA。体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随

56、着离子的渐渐削减，电阻越来越大，固然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。SSS. 我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100 分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100 分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不同。 所以，我想问题应当出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推举的稀释度是 1：1001：1000。我用的是 1：100。莫非非要用多抗吗？按道理单抗也应当出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样 20 微升。提出的蛋白我保存在 4 度了，这样行吗？解答：

57、1、建议您用恒压进展电泳，先用 70V，等跑过积层胶与分别胶的界限时，换用 90- 100V，再跑3 小时左右。2、转膜可用恒流，但要依据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如， 你膜的面积是 30CM2，蛋白的分子量是 80KD，那么你就可以以 2.0mA/CM2 的条件进展，你就可以 60mA 的电流进展。3、我觉得你的抗体应当没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在 4 度呢？ 我们试验事都是保存在-20 度的，提出蛋白分装保存在-20 度。TTT. 目的蛋白是一种 6KD 的分泌性蛋白，RTPCR

58、就显示细胞中 mRNA 表达不高，估量将培育上清冻干浓缩后承受 Western Blot 还可能检测不出，但假设用 western，是否肯定要用 0.2m 的膜？用 Tris-tricine SDS 电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分别胶用 40%T 丙稀酰胺2.6%C浓度为 16.5%，另外两层都用 30丙稀酰胺，中间一层浓度为 10%，积层胶浓度为 4%，凝胶厚度 1mm，转膜的条件试过 30V70 分钟，膜上可见到小分子蛋白 marker 的条带，似乎见到目的条带，上样量为 60g 细胞胞浆总蛋白，转膜的条件怎么样适宜？解答：肯定要用0.2m 的膜，并且转移的条件要摸索一下，小分子的Wes

59、tern 不好做，要依据你的试验器材来定，一般你要是有prestained marker 就可以参照一下，假设相应的分子量大小的 marker 转移的好就可以了。UUU. 怎样才能把胶跑的格外秀丽，泳道和 band 都能很直，是不是上样的量很重要，罐胶有什么技巧吗？想跑秀丽，是不是应领先小电压，再高电压，总体上电压小些会跑的好些?还 有前面有人说电泳液平玻璃板会使电泳条带秀丽些?解答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越秀丽，浓缩胶 80v，分别胶 100v 就能跑得很好。2、胶的均匀度， 胶越均匀，条带越窄，分别越均匀。倒胶之前

60、，肯定要充分混匀，玻璃板肯定要干净，双蒸水隔 离时，肯定要比较轻地加上去，避开稀释上层的分别胶，使胶不均匀。VVV. 为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丧失一些哪?什么缘由?解答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一局部小分 子的就透过去了。 上次转染了 1.6*106 细胞，收集，收集到了 400 微升体积，加 6*loading buffer， 95 度煮 5 分钟，-20 度，交替 3 次，离心，上样，7%分别胶，先 80v 跑进分别胶，在 100v 电泳至溴酚兰出胶，biorad 半干转 PDVF 膜，15v 转 30 分钟，预染 marke

61、r 全部进膜，转移后的胶考马斯亮兰染，可见残留的蛋，大分子量多些.blot 时，封闭用5%奶粉 TTBS 1 小时，抗体稀释液 TTBS，一抗(1:10，单抗上清，2023 年制备)1 小时，二抗(1:2023)1 小时，均在室温. 结果，50kd 的小分子显色，160kd 大分子未显色。缘由分析及预备改进：转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低，大分子量表达也 会相对较低，加上大分子量蛋白的转移不完全，可能是我没有拿到大分子量条带结果的缘由。另 外背景略微有一些脏(背景整体均匀全都)，估量是二抗的浓度高了些，预备降至 1:5000，另外抗体稀释液预备改用 5%奶粉 TTBS，封闭改为室温 2 小时。这个过程有没有问题？解答：首先分析你的整个试验步骤。我觉察了两个比较大的毛病：1、一抗用TBST 稀释。依据我的理解，一抗最好用 5%的 TBST 脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相全都，这样可以降低背景。2、 “bi