TAIL-PCR原理及应用

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1、TAIL PCR 一种一种DNA 侧翼序列分离技术侧翼序列分离技术 在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA 序列邻近的未知序列。热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未DNA 序列的分子生物学技术。在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。该技术技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。介绍介绍结构结构1，TAIL

2、 PCR原理原理2，TAIL PCR引物设计引物设计3，TAIL PCR反应条件反应条件4，TAIL PCR优缺点优缺点及其优化5，TAIL PCR应用应用 TAIL PCR以基因组DNA 作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3 个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer,SP)，和一个较短且Tm 值较低的随机简并(arbitrary degenerate,AD)引物组合，通过3 轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR 扩增，获得已知序列的侧翼序列。原理原理目的片段第1 次PCR 反应 由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、15 次热不对称的大循环构成。通过

3、5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的序列退火并延伸,提高目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上,随后进行15 次TAIL 循环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物:特异性产物和非特异性产物(型和型)TAIL-PCR 一般分为一般分为3 次反应次反应第2 次反应 将第一级反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。第3 次反应 又将第2 次反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环。通过上述通过上述3 次次PCR 反应可获得较高含量的与已知序列

4、邻近的目标序列。反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。、分别为TAIL2PCR 反应中第2 次和第3 次反应的产物TAIL2PCR 产物分析产物分析 在多数情况下,第1 次反应有较多的非特异性产物特异性引物在第1 次反应中一般不能扩增到可被检测的水平,因此可以省去第1 次反应产物电泳分析，仅仅检测第2 次和第3 次反应的产物来获得特异性的目标片段。取第2 次反应产物和第3 次反应产物成对点样。由于特异引物是嵌套的,因此特异性扩增的特点是第3 次反应产物小于第2 次反应产物。由于AD 引物在特异性引物的下游有多个退火位点,同一目标序列有时会产生一个以上不同长度的特异性片段。TAIL-PC

5、R 引物设计引物设计 和一般的PCR 反应相比，TAIL-PCR 反应对引物的要求较高，引物的设计很是重要。特异性引物和简并引物的选择直接影响扩增的效果。特异引物设计特异引物设计 3 个嵌套的特异性引物长度一般在2030 bp 之间，Tm 值一般设为5868。SP1、SP2 和SP3 之间最好相距100 bp 以上以便在电泳时更容易区分3 轮PCR 产物。简并引物设计简并引物设计 简并引物是按照物种普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计的，相对较短，长度一般是14 bp左右，Tm 值介于3048之间。AD 引物是否最佳与它的简并度、引物长度和核苷酸序列组成有很大关系。为了更好的与目标序列退火：首

6、先，尽量选择简并度低的氨基酸区域作为引物设计区；其次，充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性；最后，尽量避免3 末端的简并。反应文件号循环次数温度设定第1 次反应1 1 94 2 min,95 1 min 2 5 94 15 s,63 1 min,72 2 min 3 1 94 15 s,30 3 min,以0.2/s 升至72 72 2 min 4 15 94 5 s,63 1 min,72 2 min 94 5 s,63 1 min,72 2 min 94 5 s,44 1 min,72 2 min 5 1 72 2 min 第2 次反应4 15

7、94 5 s,63 1 min,72 2 min 94 5 s,63 1 min,72 2 min 94 5 s,44 1 min,72 2 min 51 72 2 min 第3 次反应4 15 94 5 s,63 1 min,72 2 min 94 5 s,63 1 min,72 2 min 94 5 s,44 1 min,72 2 min 51 72 5 min TAIL-PCR 反应条件反应条件5 次高特异性反应1 次低特异性反应15 次热不对称的大循环15 次热不对称的大循环15 次热不对称的大循环Table 1 Cycle settings used for TAIL-PCRTAIL

8、-PCR 反应条件Table 2 TAIL-PCR 反应混合液的组成（30 L）ReagentAmount in primary Reaction/L Amount in secondary reaction/L Amount in tertiary reaction/L 10PCR buffer 2 2 2 2 mmol/L dNTPS 2 2 2 10 mol/L gene specific Primer 1 1 1 10 mol/L AP Primer 4 4 4 Template 1 1 1 Taq DNA polymerase(5u/L)0.2 0.2 0.2 ddH2O to 20

9、 L20 L20 L 每次使用不同SP引物第2、3次为前一次稀释1000倍 TAIL-PCR 技术优缺点技术优缺点TAIL-PCR 方法直接通过3 轮PCR 反应来得到目的片段，省去了诸如：酶切、连接、加尾等传统的基因克隆方法中的繁琐步骤；而且TAIL-PCR 方法又克服了常规PCR 不能对已知DNA 序列侧翼的未知序列进行扩增的缺点，能快速地分离到目标序列。优点：优点：(1)操作简便，省时，只要设计好引物,即可以用基因组DNA 作模板直接筛选到目标序列。(2)成本低，TAIL-PCR 只需要设计几个嵌套特异引物和简并引物即可，大大降低了成本(3)高特异性，用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相

10、组合,通过不对称的温度循环和分级反应,使反应体系有利特异引物的扩增。(4)高灵敏性，使用任何一个AD 引物,在60%80%的反应中能够产生特异性产物。运用不同的AD 引物就能够有效地扩增到目标片段。(5)快速。整个TAIL2PCR 反应循环能够在1 d 内完成,可以快速地获得目标片段。缺陷缺陷：(1)反应条件设置要求精细，因为TAIL-PCR 是3 轮连续的嵌套的反应。若是其中一轮出现失误，将会直接影响下一循环的工作。(2)TAIL-PCR 反应需要较多的引物组合，因为不同的AD 引物具有不同的结合位点。(3)TAIL-PCR 反应不是每次都有阳性结果。因为AD 引物存在有限的结合位点，在个别

11、侧翼序列的扩增中，即使使用不同的简并引物也难以获得阳性结优化优化优化TAIL-PCR反应的一些环节，可大大增加反应产物的特异性优化优化 1，3 次循环中增设不同的退火温度，设计特异引物时选择合适的Tm，这样会更有利于特异目的片段的富集优化优化 2，延长3 次PCR 循环中的变性时间和延伸时间，变性时间延长到了，有利于DNA 彻底解链；延伸时间延长，更有利于较长的侧翼序列的获得。优化优化 3，热不对称PCR 循环次数适当增加，或不对对称设置为3:1。优化优化 4，简并引物可以做一个混合物，将几个引物组合在一起，在反应时混合物中各个引物依然维持原来的浓度，提高目标条带扩增的机率。TIAL-PCR 的应用的应用 1.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2.获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3.鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5.用于人工染色体 PAC、YAC 和 BAC 的片段搭接。