牡蛎蛋白酶解多肽降糖及抗氧化活性评价

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1、牡蛎蛋白酶解多肽降糖及抗氧化活性评价赵荣涛;王宁丽;魏鉴腾;裴栋;刘晔玮;邸多隆【摘要】Objective: evaluate the effects of 9 enzymes on the hypoglycemic activity and antioxidant activity of peptides obtained from oyster protein by chemical method.Methods:As the evaluation indexes of hypoglycemic activity and antioxidant activity in vitro of p

2、eptides obtained from oyster protein,the inhibition rate of alpha amylase,the screening rate of DPPH and the inhibition rate of superoxide anion were evaluated to screen the optimum protease.Results:The 5 mg/mL concentrations of peptides from oyster obtained by flavourzyme digestion had the most obv

3、ious inhibitory effect on a-amylase,and the IC50 value was 3.806 mg/mL.The 2 mg/mL concentrations of peptides from oyster obtained by chymotrypsin digestion had the highest clearance rate of DPPH,and IC50 value was 1.16 mg/mL.Meanwhile,the 2 mg/mL concentrations of peptides from oyster obtained by c

4、hymotrypsin digestion had the highest inhibitory effect on superoxide anion,and the IC50 value was 1.75 mg/mL.Conclusion:the peptides from oyster obtained by flavourzyme digestion and chymotrypsin digestion have great potentiality for hypoglycemic and antioxidant properties,and which are expected to

5、 provide a reference for the further study of peptides from oyster.% 目 的:利 用化学方法评价9种酶对牡蛎蛋白酶解所得多肽降血糖和抗氧化活性的影响,筛选 最佳酶的种类方法:以牡蛎蛋白酶解多肽对a-淀粉酶抑制率为指标评价其体外辅助 降血糖活性，以DPPH清除率、超氧阴离子抑制率为指标评价牡蛎蛋白酶解多肽的 体外抗氧化活性，筛选出最佳用酶结果:风味蛋白酶得到的多肽对a-淀粉酶的抑制 效果最好,5 mg/mL时抑制率达到67.13%,IC50值为3.806 mg/mL濂蛋白酶酶 解得到的多肽对DPPH的清除率最高,2 mg/mL时

6、清除率为58.09%,IC50值为 1.16 mg/mL;同时,糜蛋白酶酶解得到的多肽对超氧阴离子的抑制率也最高,2 mg/mL时抑制率为53.64%,IC50值为1.75 mg/mL.结论:风味蛋白酶和糜蛋白酶 酶解所得牡蛎多肽在降糖和抗氧化方面具有较大的潜力,为进一步开展牡蛎蛋白酶 解多肽的研究提供参考.期刊名称】食品工业科技年(卷),期】2018(039)003【总页数】4页(P28-31)【关键词】蛋白酶;牡蛎;a-淀粉酶抑制活性;降血糖活性;抗氧化活性【作 者】 赵荣涛;王宁丽;魏鉴腾;裴栋;刘晔玮;邸多隆【作者单位】 兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所,甘肃兰州730000

7、; 中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘 肃省天然药物重点实验室,甘肃兰州730000;青岛市资源化学与新材料研究中心,山 东青岛266000;中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化 学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室,甘肃兰州730000;青岛市资源化学与新 材料研究中心,山东青岛266000;中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北 特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室,甘肃兰州730000;青岛 市资源化学与新材料研究中心,山东青岛266000;中国科学院兰州化学物理研究所 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验

8、室/甘肃省天然药物重点实验室,甘肃兰 州730000;青岛市资源化学与新材料研究中心,山东青岛266000;兰州大学公共卫 生学院营养与食品卫生学研究所,甘肃兰州 730000;中国科学院兰州化学物理研究 所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室,甘肃 兰州 730000;青岛市资源化学与新材料研究中心,山东青岛 266000【正文语种】中文【中图分类】TS201.4牡蛎俗称耗、海蛎子,是一种高蛋白、低脂肪且营养丰富的食品,含有丰富的生理活 性物质,被称为“海牛奶”1。随着牡蛎养殖业的发展,牡蛎产量迅速增加,已出现供 过于求和价格下跌的趋势1,如何充分高效地利用牡蛎

9、资源、开发牡蛎高值化产品 已成为牡蛎产业面临的机遇和挑战。牡蛎中含有丰富的蛋白,现代研究表明,人类对 蛋白质的利用是将蛋白质酶解成小分子多肽或低聚肽吸收利用2。小分子多肽或 低聚肽具有不需消化直接吸收、不需消耗人体能量、吸收速度快、优先吸收、在人 体中合成蛋白质的速率较氨基酸快等诸多优点2。近年来对于牡蛎抗氧化和降糖的研究进展较多,例如,胡建恩等3对牡蛎进行研究,发 现牡蛎蛋白质的胃蛋白酶酶解产物在降血糖方面具有一定的应用价;雷丹青等4采 用牛胰蛋白酶酶解的方法制备牡蛎活性肽,发现牡蛎酶解活性肽中含有较多的必需 氨基酸及糖原等,牡蛎酶解活性肽能降低四氧嘧啶诱导的小鼠血糖;张泽等5采用邻 苯三酚

10、自氧化法测太平洋牡蛎,发现其原血浆、粗蛋白、血浆纯化蛋白均具有不同 程度的抗氧化效果;林海生等6制备了牡蛎蛋白酶解物,通过体外实验测定抗氧化活 性,发现其还原性较强,对羟基自由基和超氧阴离子均有较好的清除能力。本文利用多种蛋白酶将牡蛎蛋白水解成牡蛎多肽，以a-淀粉酶抑制率为指标评价牡 蛎多肽体外辅助降血糖活性，以DPPH清除率和超氧阴离子清除率为指标评价牡蛎 多肽体外抗氧化活性,筛选出最优的蛋白酶种类和酶解工艺,为其在食品、保健和医sffilMs和-CN-M將 H-TT 胆勺竖皿祐姮狛芒榕ffi眨足H2 (OTLU) sffisf 寸寸60巴曙nwlr 胆 Q 竖皿览眨畀iHueffim3、n

11、 口 01g s g m(寸巴曙nw1xr 胆勺竖皿览眨畀iHueffim、6、n g 01、6、n OT畀iHffl卅回fth邂n 0寸呂盘)SEaIw販轻呻燉小烝小扫忙 曙-H萍廉-KS8。理理趟坐旺屁映比呂耳刍如壕。糾理皿璧tt4w宾0700毒仪睚曲骰Bg旺壯通S曙怒題吉友益恥曙聲CNZT 。匸益恥曙-H卄驱連、屢H-煙她rf(sHs2%ob田、曙KU。06三 寸ssru。OS 田如S鰹M、(左刪H-) 寸曙吕ooHHd 羽墨壬刪H-)OI swHrnwB-H卄SSBEOIW糞 -nLUOILUOOLULXLU，寸Lu2CNLUI-ILU旺$ssCN 損壇俅CNSMI?i s寸Avsa破

12、Q甲邺竖皿噩$旺抑怅氓 左鰹来来0国皿总巍0T8unl 。雌决通皿础瀏俅昶胆Q七一p_eE9s H样品溶液配成5 mg/mL,加入a-淀粉酶溶液后在37 C下保温10 min,然后加入淀 粉溶液，反应15 min后加入1.0 mol/L盐酸溶液终止反应，得到反应液。同时用磷 酸盐缓冲液替代a-淀粉酶解液，作为空白。最后将反应液加蒸馏水至5 mL,波长 660 nm下测吸光度值。抑制率式(1)式中:阴性空白吸光度(Ab)-用磷酸盐缓冲液代替a-淀粉酶解液和多肽，所测吸光 值为Ab;阴性对照吸光度(Ac)-用磷酸盐缓冲液代替a-淀粉酶解液,所测吸光值为 Ac;样品空白吸光度(Asb)-所测吸光值为

13、Asb;样品对照吸光度(Asc)-所测吸光值为 Asc。1.2.3牡蛎多肽清除DPPH能力测定参照有关文献方法略作调整10-12。将2.5 mL 2 mg/mL的牡蛎多肽溶液添加到2.5 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液中，混匀, 室温下反应30 min,在波长517 nm处测定吸光值。清除率式(2)式(2)中:Ac-2.5 mL DPPH溶液加2.5 mL蒸馏水在517 nm处的吸光值;Aj-2.5 mL多肽溶液加2.5 mL无水乙醇在517 nm处的吸光值;Ai-2.5 mL多肽溶液加2.5 mL DPPH溶液在517 nm处的吸光值。1.2.4 牡蛎多肽抑制超氧阴离子能力的测定

14、参照文献13-15的方法并适当进行 调整。取1.8 mL 2 mg/mL的多肽溶液加入到2 mL 0.1 mol/L TRIS缓冲液 (pH=8.2 )中，混合摇匀，在25 C水浴20 min,然后加入0.125 mL 3 mmol/L邻苯三 酚溶液(0.01 mol/L 盐酸溶液配制),快速混匀,倒入比色皿中,在320 nm 处测吸光度, 每隔30 s读数1次，测定4 min内的吸光度值变化，作吸光度随时间变化的回归方 程斜率为多肽自氧化速率V样品。对照组以0.125 mL双蒸水代替多肽溶液斜率 为V对照。超氧阴离子抑制率() =(v对照-V样品)/V对照X100式(3)1.3 数据统计分析

15、用IBM SPSS 21.0软件进行统计学处理，不同浓度的多肽溶液对a-淀粉酶抑制率、 DPPH清除率及超氧阴离子抑制率作图并进行曲线拟合，计算IC50值。2 结果与分析2.1牡蛎多肽对a-淀粉酶抑制作用的测定由于蛋白酶具有作用位点专一性的特点,因此不同蛋白酶对牡蛎蛋白的酶解程度不 同,且牡蛎多肽的功能性质也有所不同16。由图1可知，牡蛎多肽在5 mg/mL浓 度下，对a-淀粉酶均具有一定的抑制作用抑制率从28.15% 67.13%。其中风味 蛋白酶酶解所得的牡蛎多肽(ML4)对a-淀粉酶的抑制率最高，为67.13%。图1不同牡蛎多肽对a-淀粉酶的抑制率Fig.1 The inhibition

16、 rate on a- amylase of different concentration of oyster由图2可知,ML4对a-淀粉酶的抑制能力随其质量浓度上升呈现增强趋势,并且随 着质量浓度的增加,ML4对a-淀粉酶的抑制率增幅减慢。有文献报道12 mg/mL 的燕麦肽对a-淀粉酶的抑制率为65.88%17,而当牡蛎多肽质量浓度为5 mg/mL 时，对a-淀粉酶的抑制率为67.13%,取不同浓度的ML4对a-淀粉酶抑制率作图并 进行曲线拟合，得出ML4对a-淀粉酶的IC50值为3.806 mg/mL。在抑制率接近 的情况下,ML4的浓度远小于燕麦肽，说明ML4对a-淀粉酶的抑制效果优

17、于燕麦肽, 更具市场竞争力。图2 不同浓度ML4对a-淀粉酶的抑制率Fig.2 The inhibition rate on a- amylase of different concentration of ML42.2牡蛎多肽清除DPPH能力测定由图3可知，牡蛎多肽在2 mg/mL浓度下，对DPPH均具有一定的清除作用清除率 从44.95% 58.09%,均大于40%。其中糜蛋白酶酶解所得的牡蛎多肽(ML6 )对 DPPH清除率最高，为58.09%。图3不同牡蛎多肽清除DPPH的能力Fig.3 The ability of removingDPPH of different peptides

18、 from oyster谷胱甘肽是一种由三个氨基酸组成的小分子肽,是体内重要的抗氧化剂和自由基清 除剂19,因此取不同浓度的谷胱甘肽对DPPH清除率作图并进行曲线拟合(见图 4A),以期与DPPH清除率最高的ML6进行比较。同时，取不同浓度的ML6对 DPPH清除率作图并进行曲线拟合(见图4B),结果显示，谷胱甘肽的IC50为15.6 pg/mL,ML6的IC50为1.16 mg/mL,因此,ML6清除DPPH的能力为谷胱甘肽的 0.013倍，虽然其清除DPPH的能力不及谷胱甘肽，但其原材料牡蛎为一种食品，在满 足人体的营养需要的同时,还具有抗氧化作用,具有较好的应用前景。图 4 谷胱甘肽(A

19、)和 ML6(B)清除 DPPH能力 Fig.4 The ability of removing DPPH of glutathione(A)and ML4(B)2.3 牡蛎多肽抑制超氧阴离子能力测定由图5可知，牡蛎多肽在2 mg/mL浓度下，对超氧阴离子均具有一定的抑制作用抑 制率从11.01% 53.64%。其中糜蛋白酶酶解所得的牡蛎多肽(ML6)对超氧阴离子 的抑制率最高，为53.64%,结果与DPPH清除结果一致，说明ML6的抗氧化活性最 好。图5不同牡蛎多肽抑制超氧阴离子能力Fig.5 The ability of inhibiting superoxide anion of dif

20、ferent peptides from oyster不同蛋白酶酶解所得牡蛎多肽中ML6对超氧阴离子抑制效果最好，因此取不同浓度 的ML6对超氧阴离子抑制率作图并进行曲线拟合(见图6),得出其IC50为1.75 mg/mL,且ML6对超氧阴离子的抑制能力随其质量浓度上升呈现先增强后趋于平 缓的趋势。图 6 ML6 抑制超氧阴离子能力 Fig.6 The ability of inhibiting superoxide anion of ML63 结论 在1.2.1酶解工艺下,本实验选用9种蛋白酶酶解牡蛎蛋白,得到牡蛎酶解多肽,并对 相应酶解牡蛎多肽的降糖活性及抗氧化活性进行评价。以a-淀粉酶抑

21、制率为指标， 牡蛎多肽均可抑制a-淀粉酶，其中风味蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽活性最高，为67.13%,说明牡蛎多肽具有较强的降糖活性;以DPPH清除率为指标，牡蛎多肽可清 除DPPH,其中糜蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽活性最高，为58.09%;以抑制超氧阴离 子为指标,牡蛎多肽可抑制超氧阴离子,依然是糜蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽活性最 高,为53.64%。实验结果表明,不同蛋白酶酶解所得牡蛎多肽的体外降血糖和抗氧 化活性不同,这可能与蛋白酶的种类有关,由于不同的蛋白酶作用的肽键位点不同,通 过水解得到不同特性的肽类,因此酶是影响牡蛎多肽活性的重要因素之一,通过实验 筛选最佳用酶,得到活性最高多肽,为牡

22、蛎多肽的开发及生物活性研究提供理论参数 参考文献【相关文献】1郭玉华牡蛎酶解工艺的研究几中国海洋药物,2008,27(2):37-41.2葛盛东.大豆小分子多肽制备工艺和检测方法的研究D.吉林大学,2008.3胡建恩，马驰宇，王刚，等牡蛎蛋白水解产物中a-葡萄糖苷酶活性抑制组分的分离与纯化J.大连 水产学院学报,2009,24(5):449-452.4雷丹青，张辉，廖共山，等广西北部湾近江牡蛎降糖作用的研究J.时珍国医国 药,2010,21(12):3125-3127.张泽，高淑悦,程继龙，等牡蛎血浆及其纯化蛋白抗氧化活性研究J.食品科技,2012,37(7):88-91.6 林海生，曹文红,

23、章超桦，等牡蛎蛋白酶解物的制备及其抗氧化活性研究J.食品工业科 技,2013,34(16):163-168.7 许旻,吴靖娜，苏捷，等.复合酶提取牡蛎抗氧化肽的工艺研究J 福建水产,2014,36(5):366-375.8 伍城颖，吴启南，王红，等.芡种皮多酚提取物体外抑制a-葡萄糖苷酶和a-淀粉酶活性研究J.食品 工业科技,2015,36(16):91-94,99.9 刘国玉，柳嘉，万宁，等小分子糖及糖醇体外抑制a-葡萄糖苷酶活性的影响J.食品与发酵工 业,2017,43(3):36-41.10 郑志强，李宝林,郝利民，等不同蛋白酶对小麦蛋白酶解物抗氧化活性的影响J.食品科 学,2017,3

24、8(7):161-166.11 黄莹莹固定化酶制备牡蛎ACE抑制肽及抗氧化肽D哈尔滨:哈尔滨工业大学,2013.12 贾韶千,李艳霞黄鳝鱼骨多肽制备及其抗氧化活性J.食品科学,2016,37:133-138.13 王宁丽.基于细胞代谢组学的抗氧化活性评价方法的建立及应用D.兰州:兰州大学,2016.14 王宁丽，魏鉴腾，裴栋，等锁阳水提物抗氧化活性评价J.食品科技,2016,41(2):237-240.15 胡翠珍，李胜，马绍英，等.响应面实验优化葡萄籽油提取工艺及其抗氧化性J.食品科 学,2015,36(20):56-61.16 韩青，周丽杰,李智博，等酶法制备联合Plastein反应修饰牡蛎ACE抑制肽工艺优化J.食品科 学,2017,38(6):104-110.17 庞小一,王静,张慧娟，等.燕麦肽的制备、抗氧化性及其对a-淀粉酶抑制作用的研究J.食品工业 科技,2013,34(20):163-168.