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1、实 验 二 、 哺 乳 动 物 组 织 DNA的 快 速 分 离 与 基 因 的 PCR 扩 增 一、 实验目的1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总DNA的原理 与技术，为PCR分析，RFLP分析，基因文库的构 建，基因检测等研究打下基础； 三 、 实 验 仪 器 、 材 料 与 试 剂1、 实 验 仪 器 与 材 料 ： 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 ， 恒 温 水 浴 ， 真 空 泵 ， PCR仪 ， 台 式冷 冻 离 心 机 、 灭 菌 的 微 量 离 心 管 、 凝 胶 电 泳 系 统 ， 凝 胶 成像 系 统 ， 冰 箱 、 微
2、量 移 液 器 、 组 织 匀 浆 器 ， 制 冰 机 ， 一 次性 使 用 塑 料 手 套 和 乳 胶 手 套 ， 猪 肝 组 织 。2、 实 验 试 剂 ： 细 胞 裂 解 缓 冲 液 10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS， 70% 乙 醇 ， 异 丙 醇 ， 醋 酸 钾 (pH=4.8) 60ml的 5mol/L KAc, 11.5mL 冰 醋 酸 ， 28.5 ml H 2O， TE (pH 8.0)或 无 菌 水 ， 无 DNase的 RNase A (10mg/ml)， 蛋 白酶 K(20 mg/mL)； TaKaRa
3、Taq (5U/ L)， 10 PCR Buffer (Mg2+ Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)， 猪 肝 基 因 组 DNA， 引 物（ Forward primer and Reverse primer)。 四 、 实 验 操 作 步 骤（ 一 ） 、 猪 肝 组 织 DNA的 抽 提1、 切 下 10-20 mg 组 织 ， 在 液 氮 中 碾 磨 成 粉 末 。2、 将 粉 末 转 入 1.5 mL 离 心 管 中 ， 加 0.6 mL 细 胞 裂 解 缓 冲 液 和 3 L 蛋 白 酶 K， 混 匀 ， 置 于 55 水 浴 中 3 h 以 上 ,但
4、 不 要 超 过 16 h。3、 消 化 液 降 至 室 温 ， 然 后 加 入 2 L无 DNase的 RNase A，混 匀 。 37 水 浴 中 放 置 0.5 h。4、 将 样 品 降 至 室 温 ， 加 入 200 L 醋 酸 钾 溶 液 ， 剧 烈 震荡 20 sec 使 其 充 分 混 合 。 冰 上 放 置 5 min。5、 12000 g 离 心 5 min （ 4 ） 。 1、 设 计 PCR反 应 程 序 94 预 变 性 2 min后 开 始 以 下 循 环 94 30 sec 55 30 sec 25 cycles 72 30 sec 72 5 min； 4 冷 却 恒 定 。（二）、PCR扩增基因片断 基因组DNA电泳图RNA提取电泳图 PCR结果图
哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增
