基因诊断(3-LMJ)

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1、1 多 数 非 感 染 性 疾 病 发 生 的 根 本 原 因 是或 ； 感 染 性 疾 病 则 是 病原 体 入 侵 在 体 内 所 致 。授 课 老 师 ： 江 黎 明 15:35:22 2 一 、 基 因 诊 断 的 概 念 和 特 点三 、 常 见 的 基 因 异 常 及 其 检 测五 、 基 因 诊 断 在 法 医 学 上 的 应 用 15:35:23 3 通 常 是 指 利 用 分 子 生 物 学 的 方 法 技术 ， 直 接 检 测 体 内 DNA的 或 RNA的， 从 而 对 疾 病 作 出 诊 断 的 方 法 。 适 用 于 遗 传 性 疾 病 、 感 染 性 疾 病 、 肿

2、 瘤 等 多种 疾 病 的 诊 断 ， 以 及 个 体 识 别 和 亲 子 鉴 定 等 法 病学 领 域 。 15:35:23 4 （ l） 特 异 性 强 ： 直 接 检 测 导 致 疾 病 发 生 的 基 因 变 化 ；（ 2） 灵 敏 度 高 ： 所 采 用 的 分 子 杂 交 和 聚 合 酶 链 反 应 等 技 术 都 具 有 信 号 放 大 作 用 ；（ 3） 取 样 便 利 ： 一 般 不 受 组 织 或 时 相 的 限 制 ；（ 4） 早 期 诊 断 ： 易 在 疾 病 尚 无 临 床 表 现 时 作 出 诊 断 ；（ 5） 应 用 广 泛 ： 可 检 测 自 体 基 因 和 外

3、 源 基 因 。 15:35:23 515:35:23 64.DNA 芯 片 (DNA chip)技 术 Southern/DNA印 迹 、 Northern/RNA印 迹 (第 七 /六 章 )和 Western/蛋 白 质 印 迹 (第 九 /二 章 )1.斑 点 印 迹 (dot blotting)与 狭 缝 杂 交2. 组 织 原 位 杂 交 (tissure in situ hybridization )3. 等 位 基 因 特 异 性 寡 核 苷 酸 杂 交 (allele-specific oligonucleotide hybridization, ASOH) 15:35:24

4、 7 将 核 酸 (DNA或 RNA)样 品 点 在 NC膜 上 ， 变 性后 与 标 记 探 针 结 合 ， 显 影 或 显 色 ， 密 度 测量 ， 与 对 照 品 比 较 确 定 所 测 核 酸 量 的 高 低 。方 法 ：应 用 ： 主 要 用 于 检 测 细 胞 基 因 拷 贝 数 的 变 化 或 者mRNA含 量 的 变 化 。便 于 大 规 模 检 测 和 筛 选 ； 容 易 出 现 假 阳 性 。特 点 ： 15:35:24 Slot-blot结 果 GS-670型光 密 度扫 描 仪(Bio-Rad) 9 组 织 或 细 胞 (新 鲜 组 织 切 片 、 细 胞 涂 片 或

5、石 蜡 切 片 )样 品 做 适 当 处 理 (如 固 定 剂 、 蛋 白 酶 ， 使其 通 透 性 增 大 ， 标 记 探 针 进 入 细 胞 内 与 核 酸 杂 交 。方 法 ：应 用 ： 被 检 测 基 因 或 mRNA在 细 胞 内 的 检 测 及 定 位 。特 点 ： 被 检 被 检 细 胞 内 定 位 。 15:35:24 1015:35:24 11原 癌 基 因 ERBB-2(Her-2)， 基 因 扩 增 荧 光 原 位 杂 交 检 测15:35:24 2021年 5月 24日 15时 35分 12 13 根 据 已 知 基 因 突 变 位 点 的 碱 基 序 列 ， 设 计和

6、 制 备 与 野 生 型 或 突 变 型 基 因 序 列 片 段 互补 的 两 种 探 针 ， 分 别 与 被 检 DNA进 行 杂 交 ，确 定 基 因 突 变 存 在 与 否 ， 分 辨 纯 /杂 合 子 。方 法 ：应 用 ： 基 因 结 构 变 异 所 致 疾 病 的 诊 断 。特 点 ： 杂 交 条 件 要 求 严 格 ， 以 避 免 出 现 假 阳 性 或假 阴 性 。 15:35:24 14N： 正 常 基 因 ； H： 杂 合 子 基 因 ； M： 突 变 基 因 ASO1 ASO2NHM 15:35:24 15 DNA点 阵 (DNA array) 把 多 种 已 知 序列

7、的 DNA片 段 排 列 在 固 体 支 持 物 上 ， 同 时对 样 品 中 的 多 种 核 酸 进 行 检 测 和 分 析 。方 法 ：应 用 ： 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP)、 基 因 表 达 谱 和 遗 传性 疾 病 的 分 析 ； 病 原 微 生 物 的 大 规 模 检 测 。DNA微 阵 列 (DNA microarray) 通 过 计算 机 控 制 点 样 和 图 像 扫 描 的 高 密 度 集 成 探针 的 杂 交 技 术 。 15:35:25 16 (第 七 /七 章 ) 以 DNA分 子 为 模 板 ， 加 入 与 拟 扩 增 DNA片 段 两端 分 别 互 补

8、的 一 对 寡 核 苷 酸 链 作 为 引 物 ， 在 DNA聚 合 酶 的 催 化 下 ， 按 照 半 保 留 复 制 的 形 式 分 别 合成 两 股 新 的 DNA互 补 链 ， 可 使 两 引 物 间 的 DNA片 段拷 贝 数 增 加 一 倍 。 多 次 重 复 这 一 过 程 ， 可 使 这 段 DNA拷 贝 数 随复 制 次 数 以 指 数 形 式 扩 增 。 15:35:25 17 (1) 的 微 量 分 析 总 RNA(或 mRNA) ss-cDNA ds-cDNA PCR扩 增 PCR法 灵 敏 度 高 ， 对 模 板 DNA纯 度 要 求 不 高 ，且 样 品 用 量 极

9、 微 (如 一 滴 血 、 一 根 头 发 等 )。 15:35:25 18 (3)巢 式 -PCR(nested PCR) 用 2对 引 物 (外 引 物 、 内 引 物 )扩 增 ， 大 大 提 高了 扩 增 的 特 异 性(4) 不 对 称 PCR(asymmetric PCR ) 2个 引 物 浓 度 不 等 ， 一 般 采 用 50:1或 100:1 的 摩 尔 比 ， 主 要 获 取 单 链 DNA作 构 象 分 析 或 用 作探 针 。 15:35:25 19 (5)多 重 PCR(multiplex PCR) 在 同 反 应 体 系 中 加 入 多 对 引 物 ， 同 时 扩

10、增 同一 DNA样 品 中 的 多 个 不 同 序 列 区 域 ， 且 每 对 引 物所 扩 增 的 产 物 长 度 都 不 同 ， 可 根 据 电 泳 结 果 判 断是 否 存 在 某 些 基 因 片 段 的 缺 失 或 长 度 改 变 。(6)等 位 基 因 特 异 性 PCR(AS-PCR) 针 对 等 位 基 因 的 序 列 差 异 区 域 设 计 引 物 ， 使引 物 的 3 端 与 等 位 基 因 序 列 的 差 异 碱 基 对 应 ，仅 能 与 突 变 型 或 野 生 型 互 补 。 15:35:25 2015:35:25 21 PCR扩 增 时 ， Taq酶的 5 - 3 外

11、切 酶 活 性将 探 针 酶 切 降 解 ， 使 报告 荧 光 基 团 和 淬 灭 荧 光基 团 分 离 ， 从 而 使 荧 光监 测 系 统 可 接 收 到 荧 光信 号 ； 每 扩 增 一 条 DNA链 ，就 有 一 个 荧 光 分 子 形 成 ，实 现 了 荧 光 信 号 的 累 积与 PCR产 物 形 成 完 全 同步 。 15:35:25 22 (三 ) 单 链 构 象 多 态 性 分 析 利 用 单 个 或 多 个 碱 基 不 同 、 但 序 列 长 度 相 等 的双 链 核 酸 分 子 ， 经 变 性 成 单 链 后 可 具 有 不 同 的 构 象而 在 中 性 PAGE电 泳

12、中 的 迁 移 率 不 同 ； 15:35:25 与 正 常 的 电 泳 图 型 对 照 ， 出 现 新 条 带 即 可 判 定存 在 碱 基 变 异 。 2315:35:26 24 1.限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 的 检 测3.单 核 苷 酸 多 态 性2.数 目 可 变 的 串 联 重 复 序 列 多 态 性 的 检 测(DNA polymorphism )(single nucleotide polymorphism, SNP )(variable number of tandem repeats, VNTR)(restriction fragment length poly

13、morphism, RFLP ) 15:35:26 25 VNTR的小 卫 星 DNA(minisatellite DNA):重 复 单 元 长 度为 670bp；微 卫 星 DNA(microsatellite DNA ):重 复 单 元 长度 为 16bp。短 串 联 重 复 DNA(short tandem repeat DNA,STR DNA):重 复 单 元 长 度 为 26bp。 15:35:26 26 限 制 酶 识 别 位 点 限 制 酶 识 别 位 点 15:35:26 27 当 某 种 限 制 酶 的 切 点 改 变 时 (由 点 突 变 、 单 个碱 基 的 插 入 或

14、缺 失 引 起 )， 用 该 种 限 制 酶 切 割 后 得到 的 DNA片 段 的 大 小 和 数 目 都 随 之 发 生 变 化 ， 通 过电 泳 分 析 即 可 作 出 判 断 。PCR-RFLP 设 计 适 当 的 扩 增 引 物 ， 使 扩 增 片 段 包 括 某 一 个或 数 个 限 制 性 内 切 酶 识 别 序 列 ， 在 PCR扩 增 后 用 该限 制 酶 切 割 PCR产 物 ， 根 据 电 泳 后 酶 切 片 段 长 度 变化 ， 即 可 作 出 诊 断 。 15:35:26 28 A B C D E F G DEFBGCA -GAATTC-CTTAAG-EFBG C +

15、DAEcoR 限制性内切酶位点的变化 15:35:27 29 (microdissection) 是 应 用 激 光 捕 获 显 微 镜 ， 在 高 倍 镜 下 选 择 几个 甚 至 一 个 细 胞 进 行 分 析 ； 可 用 于 石 蜡 包 埋 组 织进 行 回 顾 性 诊 断 。 是 切 割 分 裂 中 期 的 染 色 体 的 目 的 区 域 ， 如 某些 断 裂 或 易 位 、 倒 位 位 点 的 染 色 体 片 段 ， 再 进 行后 续 分 析 。 15:35:27 30 瑞 士 MII CellCut 全 自 动 激 光 显 微 切 割 （ 荧 光 ） 系 统 可 通 过 紫 外 激

16、 光 切 割 需 要 分 离 的 组 织 ， 然 后 通 过 有 黏 性 的Eppendorff管 盖 进 行 收 集 ， 这 样 就 可 以 将 特 定 类 型 的 细 胞 从 组织 切 片 上 分 离 下 来 。15:35:27 31 可 以 准 确 、 快 速 、无 损 伤 地 分 离 出 纯 净的 特 定 细 胞 或 组 织 ，保 持 细 胞 内 生 物 分 子的 完 整 性 ， 以 便 用 于后 续 的 DNA、 RNA和 蛋白 质 分 析 。 配 有 近 红 外 激 光(波 长 810nm)； 紫 外激 光 (波 长 349nm)；红 色 、 绿 色 、 蓝 色 三种 荧 光 滤

17、光 片 。美 国 Arcturus公 司 的 Veritas激 光 捕 获 显 微 分 离 仪 15:35:27 PICS Altra II流 式 细 胞 仪 (分 析 分 选 )3215:35:27 33 该 法 是 基 因 诊 断 所 有 的 技 术 方 法 中 最 准 确 最可 靠 的 种 。 缺 点 ： 费 时 、 费 力 、 费 用 高 。 15:35:27 3415:35:27 35 狭 义 的 点 突 变 指 碱 基 替 代 ， 分 为 单 点 突 变 和多 点 突 变 ； 广 义 的 点 突 变 还 包 括 少 数 核 苷 酸 的 缺失 或 插 入 。 突 变 位 点 已 被

18、阐 明 的 遗 传 病 ， 可 采 用检 测 。 15:35:28 36 检 测 : (1)根 据 突 变 点 上 下 游 的 序 列 设 计 合 成 引 物 ， PCR 扩 增出 突 变 区 的 DNA片 段 。 15:35:28 37N： 正 常 基 因 ； H： 杂 合 子 基 因 ； M： 突 变 基 因 ASO1 ASO2NHM检 测 示 意 图 ) 15:35:28 38 初 筛 ： PCR-SSCP分 析 法确 认 ： DNA sequencing。 15:35:28 3915:35:29 40 可 供 选 择 的 方 法 ： PCR-RFLP分 析 、AS-PCR、 PCR-S

19、SCP及 DNA测 序 等15:35:29 原 因 ： -珠 蛋 白 链 第 6位 密 码 子 GAGGTG， 造 成 GluVal所 致 。 方 法 ： 设 计 一 对 引 物 PCR扩 增 可 得 294bp， Oxa NI 消 化 ， 电 泳 。294191103bp A A： 正 常 人B B： 纯 合 子 病 人C C： 杂 合 子 病 人结 果 ： 4115:35:29 42 1. 15:35:29 2. 。5 33 5（ 多 重 PCR的 引 物 设 计 示 意 图 ） 43 DMD基 因 定 位 于 人 类 X染 色 体 短 臂 Xp21.2上 。位 于 该 区 的 基 因 的

20、突 变 或 部 分 缺 失 ， 是 导 致 DMD的 原 发 病 因 。9个 易 发 生 缺 失 的 热 点区 片 段 ,它 们 分 别 位 于 外 显 子 4、 8、 12、 17、 19、44、 45、 48和 51。(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 15:35:29 44 同 时 用 双 重 扩 增 外显 子 17和 48区 域 内 的 2个 片 段 ， 可 检 测 出 75 左右 的 基 因 缺 失 型 患 者 ； 若 同 时 用 9对 引 物 多 重 扩 增 ， 则 可 以 检 测 到90 左 右 的 基 因 缺 失 型 患 者 。 15:35:2

21、9 45 基 因 从 一 条 染 色 体 的 正 常 位 置 转 移 到 其 他 染 色体 的 某 个 位 置 称 基 因 易 位 或 重 排 。 可 用 ， 可 在 染 色体 上 定 位 基 因 或 DNA片 段 及 它 们 彼 此 间 的 排 序 。 前 提 条 件 是 已 知 重 排 基 因 和 位 点 的 序 列 。 15:35:30 荧 光 原 位 杂 交 （ 双 色 FISH） 4615:35:30 47 基 因 扩 增 指 基 因 拷 贝 数 增 加 的 现 象 ,可增 加 几 十 到 上 千 倍 。 可 用 待 测 基 因 的 DNA片 段 或 cDNA片 段 为探 针 ， 基

22、 因 组 DNA 采 用 适 当 的 限 制 酶 酶 切 后作 Southern印 迹 杂 交 分 析 。 15:35:30 48 1.限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (RFLP)2.数 目 可 变 串 联 重 复 序 列 (VNTR)多 性 多 态 性 位 点 周 围 DNA序 列 已 知 时 ， 可 用 PCR/ RFLP分 析 。 针 对 串 联 重 复 序 列 两 侧 的 DNA序 列 设 计 引 物 ，PCR 扩 增 后 电 泳 。 15:35:30 49 1 .mRNA 的 相 对 定 量 分 析 放 射 或 非 放 射 标 记 的 cDNA探 针 与 待 测 RNA杂 交

23、 ，经 显 影 或 显 色 ， 与 正 常 对 照 比 较 即 可 定 量 待 测 RNA。 对 电 泳 凝 胶 中 的 扩 增 产 物 cDNA行 光 密 度 扫 描 ，计 算 模 板 mRNA的 量 ； 若 dNTPs 带 放 射 性 标 记 ， 作放 射 活 性 测 定 ， 并 由 此 推 算 mRNA的 含 量 。 15:35:30 50 (1)采 用 一 系 列 已 知 不 同 浓 度 的 与 待 测 mRNA序 列 相 同但 长 度 不 同 的 内 对 照 mRNA， 在 同 一 体 系 中 一 同 进 行 RT-PCR(加 32p-dCTP)， 扩 增 产 物 经 电 泳 分 离

24、 ， 分 别 测 定 两 者放 射 性 强 度 ， 绘 制 标 准 曲 线 即 可 查 出 特 异 mRNA的 量 。 (2) 。 (2)先 分 析 RT-PCR产 物 电 泳 条 带 长 度 ， 后 测 序 确 认 。 (1)采 用 Northern印 迹 杂 交 法 检 测 某 种 特 异 的 mRNA的 长度 有 否 改 变 ； 15:35:30 2021-5-24 51 52 人 类 基 因 组 DNA序 列 中 存 在 众 多 的 多 态 遗 传 标记 ， 除 非 同 卵 双 生 ， 几 乎 没 有 任 何 两 个 人 的 DNA分析 图 谱 会 完 全 相 同 ， 称 为 DNA指

25、 纹 。 人 类 基 因 组 中 存 在 有 大 量 的； 可 分 为 小 卫 星 DNA、 微 卫 星 DNA/短 串 联重 复 (STR) 。 VNTR位 点 的 平 均 杂 合 度 在 70% 左 右 ， 存 在 极 为 广 泛 ，分 布 十 分 理 想 ， 且 检 测 方 法 简 便 ， 以 取 代 RFLP而 成 为 构 建连 锁 图 谱 的 新 标 记 。 15:35:31 53 1985年 ， 英 国 遗 传 学家 Jeffreys等 用 串 联 重 复序 列 (TR)的 核 心 序 列 为 探针 进 行 RFLP分 析 ， 检 测 到许 多 高 度 可 变 区 (HVR)，所

26、得 图 谱 具 有 高 度 的 个 体特 异 性 ， 达 到 了 如 同 人 类指 纹 那 样 的 高 度 专 一 性 ，称 为 DNA指 纹 图 谱 (DNA fingerprinting)。 Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 15:35:31 54 法 医 学 中 基 因 诊 断 的 目 的 主 要 是 个 体 识 别和 亲 子 鉴 定 。 以 往 法 医 学 鉴 定 中 应 用 的 是 血 型 、 血 清 蛋白 型 、 红 细 胞 酶 型 和 HLA分 型 、 单 位 点 特 异 性探 针 RFLP分 析 ； 个 体 分 辨 力 不 够 ， 只 能 排 除 ，不 能 做 到 统 一 认 证 。 15:35:31 55 法 医 案 检 中 的 基 因 诊 断 技 术 VNTR（可变数目串联重复序列/小卫星）的核酸分子杂交分析 STR（短串联重复序列/微卫星）的PCR分析 SNP的基因芯片检测 15:35:31 56亲权鉴定与DNA指纹图由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。 15:35:31 血 迹 中 的 DNA5715:35:31