疫酶组织化学技术

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1、免 疫 酶 组 织 化 学 技 术 第 一 节 基 本 原 理 抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。 免疫酶组化 免疫学(抗原抗体反应) 酶细胞化学(底物显色反应)+特异性 敏感性 定位性 可视性 PAP法 免 疫 酶 组 织 化 学 基 本 组 成 ：抗原 抗体 放大系统 显色系统 ABC法 免 疫 酶 特 点 ： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广 一 、 酶 及 其 特 点 酶 选 择 标 准 ： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。第 二 节 酶

2、 和 底 物 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。 符 合 上 述 条 件 ： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶 （ 一 ） 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ H RP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 H RP穿透力强，易进入细胞内 （ 二 ） 碱 性 磷 酸 酶 （ AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制

3、作用 （ 三 ） 葡 萄 糖 氧 化 酶 （ GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性G OD 分子量大，穿透力较弱 二 、 底 物 及 其 特 点 酶底物酶底物酶产物（显色） H RP的 底 物 ： H RP的底物为低浓度的H 2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 H RP显 色 反 应 ： H RPH 2O2 H RPH 2O电子供体（氧化型） 电子供体 电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。 H RP常 用 的 电 子 供 体 ： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。

4、4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) 黄色 AKP底 物 ： AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色 第 三 节 酶 标 记 抗 体 法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 一 、 直 接 法原 理 ： H RP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原- 抗体 H RP复合物 组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法 步 骤 ：一步完成特 点 ：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种

5、标记 抗体只能检测一种抗原。 二 、 间 接 法原 理 ： H RP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 H RP复合物步 骤 ：二步法 组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法 特 点 ：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。 第 四 节 酶 抗 酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物 酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）H RP 一 、 PAP法原 理 ：抗原-特异性抗体-第 二抗体（桥抗体）- PAP复合物步 骤 ：三步法 组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法H RP 特

6、 点 ： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物 二 、 双 PAP法 ：原 理 ：在PA P的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物 组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法H RP 双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物H RP 步 骤 ：五步法 特 点 ：敏感性较高缺 点 ：但步骤多，费时，非特 异背景重 三 、 APAAP法原 理 ：抗原-特异抗体-第二 抗体- APAAP复合物步 骤 ：三步法 APAAP法 特 点 ：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机

7、溶剂 第 五 节 卵 白 素 -生 物 素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力 一 、 ABC法 Avidin Biotin Complex原 理 ：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin 酶素化BiotinAvidin - ABC 复合物 抗原-特异抗体- Biotin标记 第二抗- Avidin Biotin H RP 组织抗原第一抗体第二抗体H RP生物素卵白素ABC法 步 骤 ：三步法特 点 ：敏感性较高，特异性强， 应用范围广 某些脏器存在内源性生物素 干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应

8、 SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法 二 、 LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method原 理 ： Biotin标记第二抗体 LSAB法 H RP标记Avidin 抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin H RP复合物 步 骤 ：三步法特 点 ：敏感性高，特异性强， 方法简便 第 六 节 多 聚 合 物 酶 法 HRP-多聚合物-抗体 一 、 Epos法 Enhanced polymer one-step staining 多聚合物酶法 组织抗原一抗H RP

9、多聚骨架EPOS 方法 原 理 ：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和H RP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 H RP-多聚合物-特异性 抗体。 步 骤 ：一步法特 点 ：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵 二 、 EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System原 理 ： H RP -多聚合物-第二 抗体 组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步EnVision TM方法 特 点 ：敏 感 性 高 ：（1 mole复合物中含70mole H RP和10 mole第二抗体） 特 异 性 强 ： 复合物内无内源

10、性Avidin和Biotin的干扰。 第 七 节 基 本 操 作 步 骤 1. 抗原修复2.内源性过氧化物抑制3. 正常血清封闭4. 第一抗体5. 第二抗体6. 酶标记体7. DAB- H 2O2显色 第 八 节 抗 原 定 位 及 非 特 异 染 色 组 织 细 胞 固定问题 脱蜡不彻底 内源性过氧化物 内源性生物素 抗 原 抗原弥散 抗原异常表达 共同抗原决定簇 特 异 性 抗 体 非特异吸附 抗体不纯 交叉反应 第 二 抗 体 IgG交叉反应 二抗不纯 标 记 物 质量 纯度 标记水平 底 物 溶 液 DAB H 2O2 操 作 复染 抗体稀释度 孵育时间 PAS洗涤 第 九 节 免 疫 酶 方 法 评 价