分子生物学常用技术及其应用

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1、分 子 生 物 学 常 用 技 术 及 其 应 用 主 要 内 容n 基 因 工 程n 重 组 DNA技 术 -基 因 工 程n 核 酸 分 子 杂 交 技 术n PCR 技 术n 基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 第 一 节基 因 工 程 n 基 因 工 程 的 基 本 概 念n 工 具 酶n 载 体n 重 组 DNA技 术 的 基 本 原 理n 重 组 DNA技 术 的 基 本 过 程n 基 因 工 程 在 医 学 中 的 应 用 一 、 基 因 工 程 的 基 本 概 念n DNA重 组 ： 不 同 来 源 的 DNA分 子 可 以 通过 末 端 共 价 连 接 而 形 成 重 新 组

2、 合 的 DNA分 子 的 过 程 。n 基 因 工 程 ： 将 基 因 进 行 克 隆 ， 并 利 用 克隆 的 基 因 表 达 、 制 备 特 定 的 蛋 白 或 多 肽产 物 ， 或 定 向 改 造 细 胞 乃 至 生 物 个 体 的特 性 所 用 的 方 法 及 相 关 的 工 作 。 二 、 工 具 酶n 限 制 性 核 酸 内 切 酶n 其 它 工 具 酶 1、 DNA连 接 酶 2、 DNA聚 合 酶 3、 逆 转 录 酶 4、 多 核 苷 酸 激 酶 5、 碱 性 磷 酸 酶 6、 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 三 、 载 体n 质 粒n 噬 菌 体n 粘 粒n 病

3、毒 四 、 重 组 DNA技 术 的 基 本 原 理 五 、 重 组 DNA技 术 的 基 本 过 程n 目 的 基 因 的 制 备 方 法 ： 1、 基 因 组 DNA文 库 2、 制 备 cDNA文 库 3、 PCR 4、 化 学 合 成 n 目 的 基 因 与 载 体 的 连 接 方 法 ： 1、 粘 性 末 端 连 接 2、 同 聚 物 加 尾 连 接 3、 平 末 端 连 接 4、 人 工 接 头 连 接 n 将 外 源 DNA导 入 宿 主 细 胞 方 法 ： 1、 转 化 2、 感 染 n 目 的 基 因 的 筛 选 和 鉴 定 方 法 ： 1、 遗 传 学 方 法 2、 分 子

4、 杂 交 法 3、 免 疫 学 方 法 n 克 隆 基 因 的 表 达 六 、 基 因 工 程 在 医 学 中 的 应 用n 医 学 基 础 的 研 究n 疾 病 的 诊 断 和 基 因 治 疗n 基 因 工 程 药 物n 转 基 因 动 物n 人 类 基 因 组 计 划n 蛋 白 质 工 程 第 二 节重 组 DNA技 术 -基 因 工 程 n 重 组 DNA技 术 是 现 代 分 子 生 物 技 术 发 展 中 最重 要 的 成 就 之 一 。 即 是 基 因 工 程 (Gene Engineering)的 核 心 技 术 。n 重 组 DNA技 术 （ Recombinant DNA T

5、echnique）是 人 类 根 据 需 要 选 择 目 的 基 因 （ DNA片 段 ）在 体 外 与 基 因 运 载 体 重 组 ， 转 移 至 另 一 细 胞或 生 物 体 内 ， 以 达 到 改 良 和 创 造 新 的 物 种 和治 疗 人 类 疾 病 的 目 的 。n 这 一 技 术 的 发 展 和 应 用 ， 关 键 在 于 限 制 酶 的发 现 和 应 用 。 一 、 限 制 酶 n 限 制 性 内 切 核 酸 酶 (restrictive endonucleases)， 又 称 限 制 酶 。 是 特 异 性 地切 断 DNA链 中 磷 酸 二 酯 键 的 核 酸 酶 （ “

6、分 子 手术 刀 ” ） 。n 发 现 于 原 核 生 物 体 内 ， 现 已 分 离 出 100多 种 ，几 乎 所 有 的 原 核 生 物 都 含 有 这 种 酶 。 是 重 组DNA技 术 和 基 因 诊 断 中 重 要 的 一 类 工 具 酶 。 1、 限 制 酶 的 命 名 n 根 据 其 来 源 命 名 。 如 ： 属 名 菌 株 名 E co R I 种 名 编 号n EcoRI来 源 于 大 肠 杆 菌 E.coli的 RY13菌株 ,I指 在 该 菌 株 中 分 离 的 第 一 个 限 制 酶 。 2、 限 制 酶 识 别 序 列 和 切 割 形 成 n 每 种 限 制 酶

7、能 识 别 和 切 割 的 通 常 4 8个 核 苷 酸序 列 ， 称 为 限 制 性 位 点 或 切 点 。 如 ： Hare 5 -GGCC-3 Bam HI 5 -GGATCC-3 平 末 端 (blunt end) 对 称 轴 切 ， 连 接 效 果 差 切 割 形 成 粘 性 末 端 （ sticky end） 交 错 切 。 部分常用限制酶及切点 互 补 末 端 连 接 产 生 相 同 序 列 的 突 出 末 端 的 不 同 片段可 有 三 种 方 式 ：n 1)用 同 一 种 限 制 酶 切 割 ；n 2)用 识 别 相 同 靶 序 列 的 不 同 限 制 酶 切 割 ；n 3)

8、用 识 别 不 同 靶 序 列 但 可 产 生 一 致 的 粘性 末 端 的 限 制 酶 切 割 。 3、 特 点 ： n 根 据 上 述 限 制 酶 的 特 点 ， 在 基 因 工 程 和 基 因 诊断 中 的 重 要 用 途 ： 1) 不 论 DNA的 来 源 如 何 ， 同 一 种 限 制 酶 切割 后 产 生 的 粘 性 末 端 容 易 重 新 连 接 。 因 此 可 将不 同 种 属 的 DNA重 组 。 如 人 和 质 粒 DNA等 。 2) 用 于 人 类 基 因 组 的 DNA分 析 ， 具 特 定 的酶 切 位 点 。 3)Gene突 变 改 变 酶 切 位 点 的 消 失

9、或 新 产 生将 改 变 酶 切 片 段 长 度 。 应 用 于 限 制 性 片 段 多 态性 分 析 。 二 、 基 因 运 载 体 及 其 选 择 n 载 体 （ Vector） :将 外 源 目 的 DNA导 入 受 体 细胞 ， 并 能 自 我 复 制 和 增 殖 的 工 具 。 n 载 体 具 以 下 特 征 ：n 1)分 子 量 小 ， 便 于 携 带 较 大 的 DNA片 段 ， 能 进入 宿 主 细 胞 并 在 其 中 增 殖 ；n 2)有 多 种 限 制 酶 切 点 ， 每 种 限 制 酶 最 好 只 有单 一 切 点 ；n 3)被 切 割 后 的 载 体 ， 插 入 外 源

10、 DNA后 ， 不 影 响其 复 制 能 力 ， 并 有 可 选 择 的 标 记 基 因 （ 如 ，抗 药 基 因 ） 。n 常 用 的 载 体 有 ： 质 粒 ， 噬 菌 体 ， 粘 粒 ， BAC，YAC， PI等 。 （ 一 ） .质 粒 plasmid Plasmid 独 立 于 细 菌 染 色 体 外 的 双 链 环 DNA分 子 。 PBR322 大 肠 杆 菌 pSC101 Plasmid chromosome COIEI plasmid 革 兰 氏 阴 性 菌 pc194 scp12 真 核 生 物 -酵 母 质 粒 常 用 的 质 粒 如 pUC19， 多 连 接 子 MCS

11、。 插 入 外 源 基 因 片 段 长 度约 10kb。 将 外 源 基 因 插 入 到 MCS中 ， 随 质 粒 的 表 达 而 表 达 ，增 殖 而 扩 增 。 外 源 基 因 插 入 到 MCS后 ， -半 乳 糖 苷 酶 的 活 性丧 失 而 不 显 兰 色 -白 色 菌 落 。 如 果 不 插 入 外 源 基 因 ， 则 产 生兰 色 。 从 而 筛 选 阳 性 菌 落 。 EcoRI HindIII Ori复 制 起点LacZ APRpUC19 （ 二 ） . -噬 菌 体 ( phage)n 是 一 种 可 在 体 外 包 装 的 细 菌 病 毒 ,可 高 效 感 染大 肠 杆

12、菌 . -噬 菌 体 DNA是 线 状 双 链 DNA分 子 ,全 长 约 50kb,每 条 链 各 带 12bp长 的 单 链 互 补 末端 -粘 末 端 (COS序 列 )。 进 入 宿 主 细 胞 后 不 久 ，COS序 列 碱 基 配 对 环 化 。n 改 建 后 的 噬 菌 体 发 展 了 多 种 较 大 型 的 克 隆载 体 ， 如 ： n 1、 置 换 载 体 溶 解 途 径 载 体 和 外 源 DNA整 合 到 宿 主 菌 DNA中 。可 克 隆 23kb的 外 源 DNA。n 2、 插 入 载 体 裂 解 途 径 DNA在 宿 主 细 胞 中 复 制 ， 然 后 包 装 成噬

13、 菌 体 ， 裂 解 宿 主 ， 释 放 噬 菌 体 。 可克 隆 5kb的 cDNA。 裂解途径 （ 三 ） .粘 粒 (cosmid vector)（ 30 40kb） 是 将 质 粒 和 噬 菌 体 改 建 的 一 种 载 体 .它 含 COS序 列 ,插 入 一 小 plasmid 而 得 名Cosmid。 改 建 后 的 粘 粒 含 有 噬 菌 体 的 复制 起 点 和 cos 末 端 。 全 长 8kb。 大 片 段 外源 DNA插 入 后 ， 在 体 外 包 装 进 而 被 克 隆 。可 包 装 30 45kb长 的 DNA片 段 ， 多 用 于 基因 文 库 构 建 。 (四

14、) 大 片 段 DNA克 隆 载 体 n 人 类 和 哺 乳 动 物 的 基 因 组 很 大 ，甚 至 许 多 单 个 基 因 也 相 当 大 （ 如 ：DMD gene 2300kb） ， 克 隆 分 析就 需 要 更 大 的 基 因 载 体 。 如 近 年来 构 建 的 一 些 载 体 ： BAC， PI，YAC等 。 1、 细 菌 人 工 染 色 体 （ bacterial artificial chromosome,BAC） n 优 点 ： 能 携 带 大 片 段 DNA，约 300kb。 在 每 个 细 胞 中 ， 一 个 载体 分 子 能 繁 殖 多 个 拷 贝 ，高 产 DNA。

15、n 缺 点 ： 会 出 现 插 入 片 段 在结 构 上 的 不 稳 定 ， 导 致 克隆 DNA部 分 的 缺 失 或 重 排 。为 克 服 上 述 缺 点 ， 人 们 采用 低 拷 贝 数 复 制 子 载 体 ，如 ， E coli中 的 F因 子 。此 质 粒 含 有 2种 基 因（ part A, part B） 。 每 个 E coli能 接 受 300kbDNA片 段 。 2、 噬 菌 体 PI载 体 和 PAC n PI噬 菌 体 与 噬 菌 体 一 样 ， 外 有 蛋 白 质壳 。 内 含 相 当 大 的 （ 110 115kb） 线 性DNA， 并 在 体 外 包 装 于 P

16、I壳 内 。 PI进 入宿 主 细 胞 后 环 化 ， 扩 增 。n 1994年 ， 有 人 将 PI和 F因 子 克 隆 结 合 产生 PI人 工 染 色 体 克 隆 系 统 -PAC。 3、 酵 母 人 工 染 色 体 （ yeast artificial chromosome, YAC）n 适 用于 克隆 大片 段DNA，0.22Mb YAC 的 主 要 功 能 成 份 有 三 ： n 1） 着 丝 粒 ： mitosis姊 妹 染 色 单 体 和 减 I同源 染 色 体 分 离 之 必 需 。n 2） 端 粒 ： 保 护 染 色 体 末 端 免 受 核 酸 酶 的 侵袭 。n 3） 自

17、 主 复 制 序 列 （ ARS） 元 件 ： 是 染 色 体 自主 复 制 的 复 制 起 点 。n 构 建 YAC需 要 4个 短 序 列 ： 2个 端 粒 ， 着 丝 粒 ，ARS元 件 ， 与 外 源 DNA连 接 成 线 性 DNA分 子 ，导 入 酵 母 细 胞 克 隆 。 三 、 DNA重 组 与 分 子 克 隆 化 n 为 获 得 所 需 的 基 因 或 特 异 序 列 ，需 从 细 胞 中 分 离 得 到 目 的 基 因 与载 体 DNA重 组 ， 并 用 适 当 方 法 在宿 主 细 胞 中 表 达 ， 扩 增 得 到 大 量相 同 的 DNA片 段 ， 称 为 DNA克

18、隆 ，亦 称 分 子 克 隆 。 基 本 原 理 与 过 程 ： 1、 分 离 纯 化 目 的 基 因 2、 目 的 基 因 + vector =重 组 DNA分 子 3、 重 组 DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 ， 并 在 其 内 增 殖 。 4、 筛 选 含 有 重 组 DNA的 细 胞 细 胞 克 隆 （ cell clone） ， 将 转 化 的 细 胞 置 于 琼 脂 表 面 ， 以 刺 激 细胞 克 隆 生 长 ， 这 些 细 胞 是 由 单 个 细 胞 形 成 的 遗 传相 同 的 细 胞 群 体 ， 故 称 细 胞 克 隆 。 再 将 每 个 克 隆移 至 液 体 培 养

19、 基 中 进 行 扩 增 。 5、 分 离 重 组 DNA克 隆 ： 即 收 获 扩 增 的 培 养 细 胞 ，并 选 择 分 离 重 组 DNA。 分 离 纯 化 目 的 基 因目 的 基 因 + vector =重 组 DNA分 子 重 组 DNA 和分 子克 隆 重 组 DNA和 分 子 克 隆 的 几 种 方 法 ：（ 依 目 的 基 因 的 来 源 ） 1、 从 基 因 组 中 分 离 目 的 基 因 在 细 胞 中 克 隆 2、 由 特 定 mRNA逆 转 录 合 成 cDNA后 再 进 行 克 隆 3、 化 学 合 成 目 的 基 因 进 行 克 隆 4、 PCR体 外 扩 增

20、目 的 片 段 进 行 克 隆 从 基 因组 中 分离 目 的基 因 在细 胞 中克 隆 筛 选 含 有 重 组 DNA的 细 胞 细 胞 克 隆 （ cell clone） 筛 查 含 有 目 的 基 因 的 细 胞 克 隆 四 、 目 的 基 因 表 达 n 上 述 细 胞 的 克 隆 系 统 可 直 接 导 入 的 目 基 因 扩增 ， 获 得 足 够 量 的 目 的 基 因 来 进 行 结 构 与 功能 的 研 究 。 n 重 组 DNA技 术 的 另 一 目 的 是 获 得 基 因 重 组 后 的产 物 RNA， 蛋 白 质 。n 就 是 将 目 的 基 因 与 表 达 载 体 重

21、组 ， 导 入 宿 主细 胞 进 而 表 达 出 相 应 的 基 因 产 物 （ 蛋 白 ） 。如 胰 岛 素 ， 干 扰 素 ； 生 产 疫 苗 的 抗 原 和 特 异的 抗 体 等 。 此 类 克 隆 系 统 称 为 表 达 克 隆 。（ expression cloning） . 目 的 基因 表 达 （ 一 ） 真 核 细 胞 的 基 因 在 原 核 细 胞（ 细 菌 ） 中 表 达 n 原 核 细 胞 中 缺 乏 真 核 基 因 表 达 装 置 （ 如 ， RNA剪接 因 子 等 ） ， 因 此 不 能 直 接 表 达 。 通 常 采 用 大 肠 杆 菌 为 宿 主 。 真 核 多

22、肽 的 表 达 要 求 ： 1） 适 当 的 cDNA（ 完 整 的 编 码 序 列 ） ； 2） 适 当 的 表 达 载 体 ， 提 供 特 定 多 肽 信 息 ； 3） 外 部 进 行 表 达 调 控 ， 表 达 系 统 设 计 有 启 动 子 。 产 物 特 征 ： 1） 真 核 细 胞 的 蛋 白 由 于 不 能 羟 基 化 而 不 稳 定 ； 2） 活 性 受 限 或 无 活 性 。 (二 ) 真 核 细 胞 基 因 在 真 核 细 胞 中 表 达 n 真 核 宿 主 细 胞 提 供 一 个 相 似 但 又 不 相 同 的环 境 。 常 采 用 酵 母 或 昆 虫 细 胞 作 为 宿

23、 主 。n 应 用 于 真 核 细 胞 蛋 白 质 的 大 量 制 备 ， 研 究特 定 基 因 的 表 达 。n 产 物 翻 译 后 羟 基 化 ， 羧 基 化 等 ， 有 加 强 蛋白 的 稳 定 和 功 能 活 性 。 五 、 基 因 文 库n 基 因 文 库 （ gene library） ,应 用 DNA重组 技 术 构 建 的 含 有 基 因 组 的 全 部 基 因 的DNA克 隆 。 （ 一 ） 构 建 基 因组 DNA文库 （ 二 ） 染 色 体 特 异 的 基 因 文 库 （ chromosome specific library） 单 个 染 色 体 细 胞 克 隆 （ 流

24、 式 C仪 ） 细 胞 染 色 体 染 色 体 文 库 染 色 体 区 带 区 带 特 异 （ 显 微 切 割 ） DNA文 库 （ 三 ） cDNA文 库 （ cDNA library） cDNA文 库构 建 ： 特 定 组 织细 胞 一定 发 育阶 段 总 mRNA 核 酸 分 子 杂 交 技 术 第 三 节 n 一 、 分 子 杂 交 的 原 理 DNA双 链 分 子 加 热 变 性 解 链 后 ， 如 控 制 好条 件 ， 缓 慢 降 温 ， 两 条 链 之 间 可 以 根 据 碱 基 互补 的 方 式 再 重 新 形 成 双 链 。 （ 复 性 ） 如 把 不 同 的 DNA单 链

25、分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ，或 把 DNA与 RNA放 在 一 起 ， 只 要 在 DNA或RNA的 单 链 分 子 之 间 存 在 着 一 定 程 度 的 碱 基 配对 关 系 ， 就 可 在 不 同 的 分 子 间 形 成 杂 化 双 链 ，这 就 叫 核 酸 分 子 杂 交 。 用 途n 研 究 DNA分 子 中 某 一 种 基 因 的 位 置 ， 两种 核 酸 分 子 间 的 相 似 性 即 同 源 性 ;n 也 可 用 于 检 测 某 些 专 一 序 列 在 待 检 样 品中 的 存 在 与 否 等 。 二 、 分 子 杂 交 的 基 本 方 法n Southern印 迹

26、杂 交 n Northern印 迹 杂 交 n 斑 点 及 狭 缝 印 迹 杂 交 n 原 位 杂 交 三 、 探 针 技 术n 1、 探 针 （ probe)： 一 小 段 已 知 序 列 的 用 同 位素 、 生 物 素 或 荧 光 染 料 标 记 它 的 末 端 或 全 链 的多 聚 核 苷 酸 链 。n 2、 探 针 技 术 ： 将 探 针 与 固 定 在 NC膜 上 的DNA或 RNA进 行 结 合 反 应 ， 探 针 的 序 列 如 果与 NC膜 上 的 核 酸 序 列 相 互 补 ， 就 可 以 结 合 到膜 上 的 相 应 区 带 ， 经 放 射 自 显 影 或 其 他 检 测

27、 手段 就 可 以 叛 断 膜 上 是 否 有 同 源 的 核 酸 分 子 存 在 。 第 四 节PCR 技 术 n 何 谓 PCR？ 是 体 外 有 引 物 介 导 的 特 定 DNA序 列的 酶 扩 增 反 应 。 一 、 PCR的 基 本 原 理n 根 据 碱 基 配 对 原 理 利 用 DNA聚 合 酶 和dNTP的 参 与 下 ， 引 物 依 赖 于 DNA模 板 特性 引 导 了 DNA合 成 。 二 、 PCR的 基 本 反 应n 以 DNA为 模 板 的 反 应n 以 mRNA为 模 板 的 反 应n PCR产 物 的 积 累 规 律 三 、 PCR的 主 要 用 途n （ 一

28、 ） 目 的 基 因 的 克 隆 1 利 用 特 异 性 引 物 以 cDNA或 基 因 组 DNA为 模 板 获 得 已 知 的 目 的 基 因 片 段 ； 2 利 用 简 并 引 物 从 cDNA文 库 或 基 因 组 文库 中 获 得 具 有 一 定 同 源 性 的 基 因 片 段 ； 3 利 用 随 机 引 物 从 cDNA文 库 或 基 因 组 文库 中 随 机 克 隆 基 因 。 n （ 二 ） 基 因 的 体 外 突 变n （ 三 ） DNA的 微 量 分 析 第 五 节DNA芯 片 技 术 n DNA芯 片 技 术 的 概 念 和 主 要 类 型n DNA芯 片 技 术 的 基

29、 本 原 理 和 方 法n DNA芯 片 技 术 的 应 用 第 五 节基 因 诊 断 与 基 因 治 疗 一 、 基 因 诊 断n （ 一 ） 基 因 诊 断 的 常 用 技 术 方 法 1、 核 酸 分 子 杂 交 2、 聚 合 酶 链 反 应 (PCR) 3、 单 链 构 象 多 态 性 检 测 4、 限 制 性 内 切 酶 酶 谱 分 析 5、 DNA序 列 测 定 6、 DNA芯 片 技 术 （二）、基因诊断的应用 1、 遗 传 性 疾 病 2、 遗 传 易 感 性 疾 病 3、 感 染 性 疾 病 4、 肿 瘤 5、 法 医 鉴 定 和 组 织 配 型 二 、 基 因 治 疗n 基 因 治 疗 的 概 念 n 基 因 治 疗 的 基 本 程 序n 基 因 治 疗 研 究 的 主 要 内 容 或 策 略n 基 因 治 疗 的 应 用 与 展 望