生物信号检测及传感器第一节

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1、 生 物 传 感 器 的 分 子 识 别 元 件 又 称 敏 感 元 件 ,主 要 指 来源 于 生 物 体 的 生 物 活 性 物 质 （ 包 括 酶 、 抗 原 、 抗 体 和各 种 功 能 蛋 白 质 、 核 酸 、 微 生 物 细 胞 、 细 胞 器 、 动 植物 组 织 ） 、 生 物 衍 生 材 料 以 及 或 生 物 模 拟 材 料 等 . 生 物 传 感 器 的 分 子 识 别 元 件 的 生 物 反 应 原 理 : 酶 及 酶 反 应 人 工 酶 微 生 物 反 应 免 疫 学 反 应 分 子 模 版 高 分 子 molecular imprinting polymers 核

2、 酸 和 核 酸 反 应 核 酸 适 配 体 （ aptamers ） 催 化 抗 体 (抗 体 酶 ) 催 化 性 核 酸 （ 一 ） 、 什 么 是 酶 ？ 酶 是 活 细 胞 产 生 的 一 类 具 有 催 化 功 能 的 生 物 分子 ， 所 以 又 称 为 生 物 催 化 剂 Biocatalysts 。 绝 大 多 数 的 酶 都 是 蛋 白 质 。 酶 催 化 的 生 物 化 学 反 应 ， 称 为 酶 促 反 应Enzymatic reaction。 在 酶 的 催 化 下 发 生 化 学 变 化 的 物 质 ， 称 为 底 物substrate。 1) 结 合 部 位 Bin

3、ding site 酶 分 子 中 与 底 物 结 合 的 部 位 或 区 域一 般 称 为 结 合 部 位 。 2) 催 化 部 位 catalytic site 酶 分 子 中 促 使 底 物 发 生 化 学 变 化 的部 位 称 为 催 化 部 位 。 通 常 将 酶 的 结 合 部 位 和 催 化 部 位 总称 为 酶 的 活 性 部 位 或 活 性 中 心 。 结 合 部 位 决 定 酶 的 专 一 性 . 催 化 部 位 决 定 酶 所 催 化 反 应 的 性 质 。1. 酶 分 子 的 结 构 特 点 酶 分 子 中 存 在 着 一 些 可 以 与其 他 分 子 发 生 某 种

4、程 度 的 结 合的 部 位 ， 从 而 引 起 酶 分 子 空 间构 象 的 变 化 ， 对 酶 起 激 活 或 抑制 作 用 。3) 调 控 部 位 Regulatory site 酶 的 催 化 作 用 可 使 反 应 速 度 提 高 106 -1012倍 。 例 如 ： 过 氧 化 氢 分 解 2H2O2 2H2O + O2 用 Fe+ 催 化 ， 效 率 为 6*10-4 mol/mol.S， 而 用过 氧 化 氢 酶 催 化 ， 效 率 为 6*106 mol/mol.S。 用 -淀 粉 酶 催 化 淀 粉 水 解 ， 1克 结 晶 酶 在 65C条 件 下 可 催 化 2吨 淀

5、粉 水 解 。 1 高 效 性 酶 的 专 一 性 Specificity， 又 称 为 特 异 性 ， 是指 酶 在 催 化 生 化 反 应 时 对 底 物 的 选 择 性 酶 的 专 一 性 包 括 (1)结 构 专 一 性 绝 对 专 一 性 相 对 专 一 性 (2)立 体 异 构 专 一 性 光 学 异 构 专 一 性 几 何 异 构 专 一 性 酶 分 子 活 性 中 心 部 位 ， 一 般 都 含 有 多 个 具 有催 化 活 性 的 手 性 中 心 ， 这 些 手 性 中 心 对 底 物分 子 构 型 取 向 起 着 诱 导 和 定 向 的 作 用 ， 使 反应 可 以 按 单

6、 一 方 向 进 行 。 酶 能 够 区 分 对 称 分 子 中 等 价 的 潜 手 性 基 团 。 酶 促 反 应 一 般 在 pH 5-8 水 溶 液 中 进 行 ， 反 应 温 度 范 围为 20-40C。 高 温 或 其 它 苛 刻 的 物 理 或 化 学 条 件 ， 将 引 起 酶 的 失 活 。 如 抑 制 剂 调 节 、 共 价 修 饰 调 节 、 反 馈 调 节 、 酶 原 激 活及 激 素 控 制 等 。5.某 些 酶 催 化 活 力 与 辅 酶 、 辅 基 及 金 属 离子 有 关 。 催 化 氧 化 还 原 反 应 的 酶 ， 包 括 氧 化 酶 类 、 脱 氢 酶 类

7、、 过氧 化 氢 酶 、 过 氧 化 物 酶 等 。 。 （ 1） 氧 化 酶 类 ： 催 化 底 物 脱 氢 ， 并 氧 化 生 成 H2O或 H2O2 。 例 ： 邻 苯 二 酚 氧 化 酶 （ EC 1.10.3.1， 邻 苯 二 酚 ： 氧 氧化 酶 ）1、 氧 化 还 原 酶 类 （ oxido-reductases） 2A2H+O2 2A+2H2O A2H+O2 A+H2O2 OH OH + O2邻 苯 二 酚 氧 化 酶 O O 2 + 2H2O2邻 苯 二 酚 邻 苯 醌 （ 2） 脱 氢 酶 类 ： 直 接 催 化 底 物 脱 氢 A2H + B A + B2H 例 ： 乳

8、酸 脱 氢 酶 （ EC 1.1.1.27， L-乳 酸 ： NAD+氧 化 还 原 酶 ） 乳 酸 丙 酮 酸COOHC HCH3H O + NAD+ COOHC OCH3 + NADH + H+乳 酸 脱 氢 酶 乙 醇 脱 氢 酶 催 化 反 应 时 为 两 分 子 “ 机 制 ” 。 一 是 锌 原 子 ，它 结 合 乙 醇 分 子 上 的 -OH基 并 定 位 。 另 一 个 是 NAD复 合因 子 （ 由 烟 酸 构 成 ） ， 决 定 催 化 反 应 的 特 异 性 水 解 酶 催 化 底 物 的 加 水 分 解 反 应 。 主 要 包 括 淀 粉 酶 、 蛋 白 酶 、 核 酸

9、 酶 及 脂 酶 等 。 例 如 ， 脂 肪 酶 (Lipase)催 化 的 脂 的 水 解 反 应 ：2、 水 解 酶 hydrolase H2OCOOCH2CH3R RCOOH CH3CH2OH 乙 酰 胆 碱 酯 酶 存 在 于 神 经 元 和 肌 细 胞 之 间 的 突触 上 作 用 :将 神 经 递 质 分 子 乙 酰 胆 碱 降 解 为 乙 酸 和胆 碱 活 性 中 心 处 在 一 个 深 沟 中 ， 在 沟 的 基 部 是 一 组由 丝 氨 酸 -组 氨 酸 -谷 氨 酸 组 成 的 三 氨 基 酸 序 列 ,其 大 小 正 好 可 使 乙 酰 胆 碱 掉 入 其 中 。 乙 酰

10、 胆 碱 酯 酶 是 人 体 中 反 应 最 快 的 酶 之 一 ， 降解 一 个 分 子 约 80 微 秒 。蛇 毒 阻 塞 活 性 位 点 并 限 制 酶 的行 动 沙 林 向 丝 氨 酸 转 移 上 一 个甲 基 磷 酸 酯 基 团通 过 一 种 药 物 毒 化 乙 酰胆 碱 酯 酶 来 试 图 扭 转Alzheimer 病 的 症 状 (四 )、 酶 生 物 传 感 器 中 几 个 常 用 术 语 酶 活 性 即 酶 促 反 应 速 度 ， 指 在 规 定 条 件 下 单 位 时 间 内 底 物 的 减少 量 或 产 物 的 生 成 量 。 底 物 浓 度 为 S ,产 物 浓 度 为

11、 P ,时 间 为 t， 反 应 速 度 为 vv =-d S /dt 或 v =d P /dt。注 ： 在 实 际 测 定 酶 促 反 应 速 度 时 ， 以 测 定 单 位 时 间 内 产 物 的生 成 量 为 好 。 1、 酶 活 性 2、 酶 活 性 单 位 的 计 算n步 骤 ： 运 用 公 式 进 行 计 算 。明 确 测 定 方 法 的 酶 单 位 定 义 ， 按 照 酶 单 位 定 义 确 定 物 质量 、 体 积 和 时 间 的 单 位 ，n计 算 公 式 : 产 物 的 增 加 量 每 单 位 规 定 的 保 温 时 间 1000（ ml）酶 单 位 /升 = 每 单 位

12、规 定 的 产 物 增 加 量 实 际 保 温 时 间 实 际 标 本 用 量 （ ml）分 光 光 度 法 测 定 的 公 式 ： （ A测 定 A对 照 ） V总 106 每 单 位 规 定 的 保 温 时间酶 单 位 /升 = L V标 实 际 保 温 时 间 3、 米 -曼 氏 方 程 ： Vmax Sv = S + Km 上 式 中 v代 表 反 应 速 度 ， Vmax代 表 最 大 反 应 速 度 ， S 代 表 底 物浓 度 ， Km称 为 米 氏 常 数 。4、 米 氏 常 数 的 定 义由 米 -曼 氏 方 程 可 以 导 出 ： （ Vmax-v） SKm = v当 v

13、= 1/2V max时 ， Km = S 。 因 此 Km值 为 反 应 速 度 相 当 于最 大 反 应 速 度 一 半 时 的 底 物 浓 度 。 Km值 是 酶 的 特 征 常 数 ， 具 有 重要 的 应 用 价 值 。 Km值 的 应 用1).鉴 定 酶 的 种 类 Km值 是 酶 的 特 征 常 数 ， 在 反 应 条 件 一 定 时 ， 只 与 酶 的 种 类和 底 物 的 性 质 有 关 ， 与 酶 的 浓 度 无 关 。 不 同 种 类 的 酶 其 Km值 不同 ， 对 于 一 种 未 知 的 酶 ， 可 在 规 定 的 条 件 下 测 定 其 Km值 加 以 鉴定 。 表

14、7-1 某 些 酶 的 Km值 酶 底 物 Km(mmol/L)乳 酸 脱 氢 酶 丙 酮 酸 0.017己 糖 激 酶 D-葡 萄 糖 0.05 D-果 糖 1.5 -半 乳 糖 苷 酶 D-乳 糖 4.0碳 酸 酐 酶 H2CO3 9.0过 氧 化 氢 酶 H2O2 25蔗 糖 酶 蔗 糖 28糜 蛋 白 酶 甘 氨 酰 酪 氨 酰 甘 氨 酸 108 2).反 映 酶 与 底 物 的 亲 合 力 Km值 越 大 ， 酶 与 底 物 亲 合 力 越 小 ，Km值 越 小 ， 酶 与 底 物 亲 合 力 越 大 。 3).选 择 酶 的 最 适 底 物 Km值 取 决 于 酶 的 种 类 和

15、 底 物 的 性 质 ， 在 酶 一 定 时 ， 不 同 底 物有 不 同 的 Km值 。 酶 活 力 测 定 时 ， 应 优 先 选 择 酶 的 最 适 底 物 ， 使 酶促 反 应 容 易 进 行 ， 并 节 省 底 物 用 量 。 4).计 算 不 同 底 物 浓 度 时 酶 促 反 应 速 度 相 当 于 最 大 反 应 速 度 的 比 率 根 据 米 -曼 氏 方 程 可 以 计 算 5).设 计 适 宜 的 底 物 浓 度 酶 促 反 应 进 程 曲 线 表 明 ， 只 有 初 速 度 才 能 真 正 代 表 酶 活 性 ， 一般 要 求 初 速 度 达 到 最 大 速 度 的 9

16、0% 95%、 底 物 消 耗 率 为 1% 5%。 这 样 既 可 以 近 似 地 表 示 酶 活 性 ， 又 不 致 于 使 底 物 浓 度 过 高 而 造 成 浪 费 。 1） .底 物 浓 度 在 低 底 物 浓 度 时 , 反 应 速 度与 底 物 浓 度 成 正 比 ， 表 现 为一 级 反 应 特 征 。 当 底 物 浓 度 达 到 一 定 值 ， 几乎 所 有 的 酶 都 与 底 物 结 合 后 ，反 应 速 度 达 到 最 大 值（ Vmax） ， 此 时 再 增 加 底 物浓 度 ， 反 应 速 度 不 再 增 加 ，表 现 为 零 级 反 应 。 2） .pH 在 一 定

17、 的 pH 下 , 酶 具 有 最 大 的催 化 活 性 ,通 常 称 此 pH为 最 适 pH。 3） .温 度 一 方 面 是 温 度 升 高 ,酶 促 反 应 速度 加 快 。 另 一 方 面 ,温 度 升 高 ,酶 的 高 级结 构 将 发 生 变 化 或 变 性 ， 导 致酶 活 性 降 低 甚 至 丧 失 。 因 此 大 多 数 酶 都 有 一 个 最 适 温度 。 在 最 适 温 度 条 件 下 ,反 应速 度 最 大 。 10 20 30 40 50 60 70 80 900 2040 6080 100 Temperature OC Relative Act ivity (%)

18、 2.基 于 抑 制 原 理 的 酶 生 物 传 感 器 能 够 和 酶 的 必 需 基 团 结 合 ， 改 变 必 需 基 团 的 结 构 和 性质 ， 从 而 引 起 酶 活 性 的 下 降 ， 甚 至 使 酶 的 活 性 完 全 丧失 的 现 象 称 酶 的 抑 制 作 用 。 能 引 起 抑 制 作 用 的 化 合 物 则 称 为 抑 制 剂 。 酶 的 抑 制 剂一 般 具 备 两 个 方 面 的 特 点 ： a.在 化 学 结 构 上 与 被 抑 制 的 底 物 分 子 或 底 物 的 过 渡 状态 相 似 。 b.能 够 与 酶 的 活 性 中 心 以 非 共 价 或 共 价 的

19、 方 式 形 成 比较 稳 定 的 复 合 体 或 结 合 物 。 抑 制 剂 与 酶 反 应 中 心 的 活 性 基 团以 共 价 形 式 结 合 ， 引 起 酶 的 永 久性 失 活 。 如 有 机 磷 毒 剂 二 异 丙 基氟 磷 酸 酯 。 A. 非 专 一 性 不 可 逆 抑 制 抑 制 剂 与 酶 分 子 中 一 类 或 几 类 基 团 作 用 ， 不 论 是 必 需 基团 与 否 ， 皆 可 共 价 结 合 ， 由 于 其 中 必 需 基 团 也 被 抑 制 剂结 合 ， 从 而 导 致 酶 的 失 活 举 例 : 巯 基 酶 的 抑 制 巯 基 酶 : 半 胱 氨 酸 残 基

20、侧 链 上 的 巯 基 （ -SH） 为 必 需 基 团的 一 类 酶 。 重 金 属 离 子 （ Hg 2+、 Ag+、 Pb2+） 及 As3+可 与 活 性 巯 基 不 可逆 结 合 ， 使 酶 活 性 被 抑 制 。 此 类 抑 制 剂 所 结 合 的 巯 基 不 局限 于 必 需 基 团 ， 故 又 称 为 非 专 一 性 抑 制 剂 。 二 巯 基 丙 醇 （ BAL） 或 二 巯 基 丁 二 酸 钠 治 疗 巯 基 酶 中 毒 B. 专 一 性 不 可 逆 抑 制 抑 制 剂 专 一 地 作 用 于 酶 的 活 性 中 心 或 其 必 需 基 团 ， 进 行 共价 结 合 ， 从

21、 而 抑 制 酶 的 活 性 举 例 : 羟 基 酶 的 抑 制 羟 基 酶 : 以 丝 氨 酸 侧 链 上 的 羟 基 (OH)为 必 需 基 团 的 一 类 酶 。 有 机 磷 杀 虫 剂 （ 敌 敌 畏 、 敌 百 虫 ） 、 二 战 时 使 用 过 的 毒 气DFP等 有 机 磷 化 合 物 能 专 一 地 与 丝 氨 酸 残 基 上 的 羟 基 结 合 ，这 类 具 有 专 一 作 用 的 抑 制 剂 常 称 为 专 一 性 抑 制 剂 。 催 化 乙 酰 胆 碱 水 解 的 胆 碱 脂 酶 是 羟 基 酶 。 有 机 磷 中 毒 时 此酶 活 性 受 抑 制 临 床 上 用 解 磷

22、 定 来 治 疗 有 机 磷 中 毒 。 可 夺 取 已 经 和 胆 碱 脂酶 结 合 的 磷 酰 基 ， 使 酶 复 活 。 基 于 抑 制 原 理 的 酶 传 感器 的 影 响 因 素 ：1.底 物 浓 度2.pH3.反 应 温 度 1、 酶 催 化 反 应 只 能 得 到 一 种 构 型 （ L-型 或 D-型 ） 的 光 学 产 物 ；2、 酶 常 常 存 在 着 底 物 或 产 物 抑 制 现 象 ， 造 成 反 应 转 化 率 降 低 ，生 产 能 力 低 等 问 题 ；3、 极 端 的 pH、 较 高 的 温 度 和 高 盐 浓 度 的 反 应 体 系 都 可 能 使 酶钝 化

23、， 失 去 部 分 甚 至 大 部 分 催 化 活 性 ；4、 大 量 的 氧 化 还 原 酶 、 转 氨 酶 等 需 要 等 计 量 反 应 物 的 辅 因 子存 在 才 能 表 现 催 化 活 性 ， 从 而 限 制 了 它 们 在 许 多 有 机 合 成反 应 中 的 应 用 ；5、 酶 通 常 在 水 溶 液 中 实 施 其 催 化 活 性 ， 对 于 大 多 数 有 机 化 学反 应 来 说 ， 使 用 的 溶 剂 是 非 水 溶 性 的 有 机 溶 剂 。 (五 )酶 催 化 反 应 的 某 些 缺 点 人 工 合 成 的 具 有 酶 活 性 位 点 的 有 机 分 子 包 括 结

24、 合 底 物 的 基 团 和 进 行 催 化 的 功 能 性 基 团 由 于 需 要 结 合 分 子 ， 因 此 人 工 酶 是 在 宿 主 分 子 ，如 环 糊 精 、 冠 醚 、 杯 芳 烃 等 环 状 分 子 的 基 础 上 进行 设 计 的 人 工 磷 酸 化 酶 (一 ) 、 微 生 物 反 应 的 特 点 微 生 物 反 应 过 程 是 利 用 微 生 物 进 行 生 物 化 学 反 应 的 过 程 . 酶 在 微 生 物 反 应 中 起 最 基 本 的 催 化 反 应共 同 特 点 :同 属 生 化 反 应 ,都 在 温 和 条 件下 进 行 ;凡 是 酶 能 催 化 的 反 应

25、 ,微 生 物也 可 以 催 化 ;催 化 速 度 接 近 ,反 应 动 力 学 模式 近 似 . 不 同 点 :微 生 物 细 胞 的 膜 系 统 为 酶 反应 提 供 了 天 然 的 适 宜 环 境在 多 底 物 反 应 时 ,微 生 物 更 适宜细 胞 本 身 能 提 供 所 需 的 各 种辅 助 因 子 和 能 量更 方 便 ,更 廉 价微 生 物 反 应 和 酶 促 反 应 的 比 较缺 点 : 标 准 难 建 立 ,反 应 途 径 繁多 ,易 受 环 境 干 扰 l1、 根 据 细 菌 的 营 养 类 型 分 类自养菌以简单的无机物为原料，合成菌体成分异养菌以多种有机物为原料，合成

26、菌体成分并获能量 2、 根 据 微 生 物 反 应 对 氧 的 需 求 与 否好 气 性 微 生 物 -必 须 在 有 空 气 的 环 境 才 易 生 长 繁 殖 的 微 生物厌 气 性 微 生 物 -必 须 在 无 分 子 氧 的 环 境 才 易 生 长 繁 殖 的 微生 物兼 性 微 生 物 -既 能 好 氧 生 长 ,又 能 厌 氧 生 长发 酵 （ 糖 酵 解 ） -厌 氧 菌 获 取 能 量 的 唯 一 途 径 ， 产 生 的 能量 较 少 。好 氧 呼 吸 需 氧 菌 和 兼 性 厌 氧 菌 的 主 要 获 能 方 式 ， 产 生 能量 较 多 。厌 氧 呼 吸 专 性 厌 氧 菌

27、 的 一 类 产 能 效 率 极 低 的 特 殊 呼 吸 方式 。 定 义 :是 利 用 微 生 物 完 成 定 量 分 析 任 务 的 学 科 . 在 有 些 情 况 下 ,微 生 物 测 定 法 比 化 学 方 法 更 专 一 和 灵敏 ,效 率 亦 更 高常 用 的 微 生 物 测 定 法 细 胞 增 殖 法 :某 些 菌 体 的 增 殖 速 度 与 必 需 营 养 物 质 的浓 度 成 正 相 关 ,而 抗 生 素 能 抑 制 菌 体 生 长 ,因 此 可 以 根据 菌 体 增 殖 速 度 可 以 测 定 抗 生 素 类 的 浓 度 . 呼 吸 法 :根 据 菌 体 在 同 化 底 物

28、 或 被 抑 制 生 长 时 的 CO2释放 或 O 2的 消 耗 进 行 测 定 菌 种 有 氧 30 C, 20小 时 培 养 6000 n/min 离 心 、 0.1 g 湿 细 胞 + 1.8 g 胶 原 纤 维 ， 混 匀 ， 滴 于 四 氟 乙 烯 膜上 ， 室 温 晾 干 ,浸 于 戊 二 醛 中 1分 钟 ， 4 C干 燥 ， 装 在氧 电 极 外 套 上测 定 原 理 及 过 程 ：响 应 参 数 和 条 件 ： 35 C, pH 7, 10-410-5mol/L,30 D底 物 葡 萄糖 果 糖 半 乳糖 蔗 糖 麦 芽糖 甘 氨酸 谷 氨酸相 对值 100 4 9 4 0

29、 4 0 BOD概 念传 感 器 原 理 ：细 菌 在 同 化 有 机 物 时 ，消 耗 氧 ， 其 程 度 与 同 化作 用 的 强 弱 ， 即 有 机 物的 浓 度 成 正 比 。 （ 一 ） 基 本 概 念 1. Immunity： 免 除 疫 病 、 抵 抗疾 病 2. 免 疫 系 统 ： 免 疫 器 官 ： (淋 巴 器 官 ) 免 疫 细 胞 :参 与 免 疫 应 答 或 与 免疫 应 答 有 关 的 细 胞 淋 巴 细 胞T 细 胞 抗 原 受 体 识 别 抗 原B 细 胞杀 伤 性 淋 巴 细 胞 (K细 胞 ) （ killer lymphocyte）自 然 杀 伤 细 胞

30、（ NK细 胞 ） （ natural killer cell） 3.免 疫 分 子 本 质 ： 免 疫 细 胞 分 泌 或 表 达 的 多 肽 、 蛋 白 质 功 能 ： 免 疫 识 别 、 免 疫 调 节 、 免 疫 效 应抗 体 、 补 体细 胞 因 子 分 化 抗 原T 细 胞 抗 原 受 体 （ TCR）B 细 胞 抗 原 受 体 （ BCR）组 织 相 容 性 复 合 体 (MHC分 子 ) 免 疫 系 统 的 基 本 功 能 ： 免 疫 防 御 、 免 疫 监 视 自 身 耐 受 、 免 疫 调 节 1） . 固 有 免 疫 应 答 （ 先 天 性 、 非 特 异 性 ） 组 成

31、 ： 固 有 免 疫 细 胞 介 导 Toll样 受 体 （ TLR） 生 理 屏 障 ： 皮 肤 、 粘 膜 吞 噬 细 胞 ： 特 点 ： 先 天 具 有 ， 无 特 异 性 ， 无 记 忆 性2） . 适 应 性 免 疫 应 答 （ 获 得 性 、 特 异 性 ） 组 成 ： T、 B淋 巴 细 胞 介 导 特 异 性 抗 原 受 体（ TCR、 BCR） 特 点 ： 后 天 获 得 ， 特 异 性 ， 记 忆 性 5、 抗 原 (Antigen, Ag)：能 够 引 起 机 体 产 生 免 疫 应 答 的 物 质 。1、 两 种 特 性 immunogenecity 免 疫 原性 ：

32、指 一 种 物 质 能 刺 激 肌 体 产生 免 疫 应 答 的 特 性 ， 即 物 质 产生 抗 体 或 激 活 淋 巴 细 胞 产 生 免疫 应 答 的 能 力 。 Activated B cellantibody antigenecity抗 原 性 ： 指 能 与 抗 体 特 异 性结 合 的 能 力 。具 有 免 疫 原 性 的 物 质 一 定 具 有 抗 原 性 ， 而 具 有抗 原 性 的 物 质 不 一 定 具 有 免 疫 原 性 。 定 义 :机 体 受 抗 原 刺 激 后 ,由 免 疫 活 性 细 胞 产 生 的 一类 能 与 抗 原 发 生 特 异 性 结 合 的 球 蛋

33、白 。 免 疫 球 蛋 白 Immunoglobulins (Ig):将 具 有 Ab活 性 及化 学 结 构 与 抗 体 相 似 的 球 蛋 白 统 称 为 免 疫 球 蛋 白 。 但 并 非 所 有 的 免 疫 球 蛋 白是 抗 体 如 骨 髓 瘤 蛋 白 和 本 周 蛋 白 VHCH1CH2C H3CH4 VLCL FabHinge region FcCOO NH3+可 变 区 (V) 1. 二 硫 键 连 接 的 四 条 肽 链 。2. Y形 对 称 结 构 ， 二 对 链 （ 重 链 ， 轻 链 ）3. 二 端 ， NH2末 端 , -COOH末 端4. 可 变 区 、 恒 定 区恒

34、 定 区 (C) 重 链 和 轻 链 （ Heavy C. 加 酶 标 抗 体 ；D. 加 底 物 。 测 定 底 物 的 降 解 量 抗 体 量 。 （ 3） 双 抗 体 夹 心 法 测 定 抗 原A. 将 抗 体 吸 附 于 固 相 表 面 ; B. 加 抗 原 ， 形 成 抗 原 -抗 体 复 合 物 ; C. 加 酶 标 抗 体 ; E. 加 底 物 。 底 物 的 降 解 量 抗 原 量 。 （ 4） 竞 争 法 测 定 抗 原A. 将 抗 体 吸 附 在 固 相 载 体 表 面 ; B. 加 入 酶 标 抗 原 和 待 测 抗 原 ， 竞 争 结 合 抗 体 ； 对 照 只 加 入

35、 酶标 抗 原 ； C. 加 底 物 。 对 照 孔 与 样 品 孔 底 物 降 解 量 的 差 未 知 抗 原 量 。 Molecular imprinting is making an artificial tiny lock for a specific molecule that serve as miniature key 共 价 型 :模 板 分 子 和 单 体 通 过 可 逆 的 共 价作 用 (如 形 成 可 逆 的 硼 酸 酯 和 席 夫 碱 )形 成 复合 物 非 共 价 型 :模 板 分 子 和 单 体 则 通 过 氢 键 、偶 极 、 离 子 、 金 属 螯 合 、 电

36、 荷 转 移 、 疏 水乃 至 范 德 华 力 相 互 作 用 形 成 复 合 物 ,非 共 价型 的 分 子 烙 印 是 一 种 分 子 自 组 装 的 过 程 。 （ 一 ） 、 核 酸 的 种 类 、 分 布 和 含 量 1. 种 类 脱 氧 核 糖 核 酸 （ DNA） 核 糖 核 酸 （ RNA） ： ribosome RNA(rRNA)、transfer RNA(tRNA)、 messenger RNA(mRNA) 2.分 布 DNA RNA 核 （ %） 98 90 3. 含 量 DNA恒 定 ， RNA与 细 胞 生 长 状 态 有 关 。 （ 三 ） 、 核 酸 的 功 能

37、R DNA-遗 传 、 RNA-参 与 蛋 白 质 合 成 。 (一 ). 概 念 是 一 种 具 有 催 化 功 能 的 抗 体 分 子 ， 在 其 可 变 区赋 予 了 酶 的 属 性 。n 酶 与 抗 体 的 差 别 ： 酶 是 能 与 反 应 过 渡 态 选 择结 合 的 催 化 性 物 质 ， 抗 体 是 和 基 态 分 子 结 合的 催 化 性 物 质 。 n 1 酰 基 转 移 反 应 a.光 聚 合 反 应 （ 二 聚 作 用 ） l1、 与 天 然 酶 相 比 抗 体 酶 的 特 点l 能 催 化 一 些 天 然 酶 不 能 催 化 的 反 应l 有 更 强 的 专 一 性

38、和 稳 定 性l 催 化 作 用 机 制 不 同l2、 抗 体 酶 和 非 催 化 性 抗 体 作 用 的 比 较l 更 高 的 反 应 特 异 性l 反 应 的 可 逆 性l 反 应 的 量 效 性l 反 应 过 程 l1、 过 渡 态 理 论 与 抗 体 酶l2、 抗 体 酶 催 化 的 三 种 重 要 反 应 机 制l 水 解 作 用 机 制l 基 团 转 移l 连 续 反 应 机 制l3、 抗 体 酶 催 化 反 应 的 介 质 效 应l 酯 解 反 应 中 介 质 效 应 ： 抗 体 酶 在 有 机 溶 剂 中 具 稳 定 性 。l 脱 羧 反 应 中 介 质 效 应 :有 机 溶

39、剂 引 起 脱 羧 反 应 速 率 增 加 。l 酰 基 转 移 反 应 中 介 质 效 应 ： 在 疏 水 溶 剂 中 ， 活 性 较 高 。 n 80年 代 初 期 ， 美 国 科 罗 拉 多 大 学 博 尔 德 分 校 的 Thomas Cech和 美 国 耶 鲁 大 学 的 Sidnery Altan各 自 独 立 地 发 现RNA具 有 生 物 催 化 功 能 .从 而 改 变 了 生 物 催 化 剂 的 传 统概 念 。 n 1982年 Cech等 发 现 四 膜 虫 细 胞 大 核 期 间 26SrRNA前 体 具有 自 我 剪 接 功 能 ， 并 于 1986年 证 明 其 内

40、 含 子 L-19IVS具有 多 种 催 化 功 能 。 1984年 Altman等 发 现 RNaseP的 核 酸组 分 M1RNA具 有 该 酶 的 活 性 ， 而 该 酶 的 蛋 白 质 部 分 C5蛋白 并 无 酶 活 性 。 n 为 此 ， T.Cech和 S.Altman共 同 获 得 了 1989年 度 诺 贝 尔化 学 奖 。n 某 些 RNA分 子 也 具 有 生 物 催 化 功 能 ， 被 称 为 Ribozyme。 核 酶 作 用 的 特 点 化 学 本 质 RNA 底 物 RNA 肽 键 -葡 聚 糖 分 支酶 反 应 特 异 性 (专 一 性 ）碱 基 催 化 效 率

41、 低 产 物 n 自 然 界 存 在 催 化 分 子 内 反 应 （ incis） 的 ribozyme(自我 剪 接 型 和 自 我 剪 切 型 )和 催 化 分 子 间 反 应 (in trans)的 ribozyme。 剪 接 型 核 酶 的 作 用 机 制 是 通 过 既 剪 有 接 的 方 式 除 去内 含 子 （ Intron).n 自 我 剪 接 ribozyme可 分 为 两 类 ： n 型 IVS： 均 与 四 膜 虫 大 核 rRNA前 体 的 IVS结 构 相 似 、 催 化 自我 剪 接 需 鸟 苷 （ 或 5鸟 苷 酸 ） 和 Mg2+参 与 。 n 型 IVS ：

42、结 构 与 四 膜 虫 的不 同 ， 而 与 细 胞 核 mRNA前 体 中 的 IVS相 似 。 它 催 化自 我 剪 接 反 应 不 需 要 鸟 苷 或鸟 苷 酸 参 与 ， 但 仍 需 Mg 2+ 引 导 序 列 保 守 序 列G结 合 位 点 类 内 含 子 有 一 个 保守 的 二 级 结 构 ：结 构 域 ： 两 个 保 守内 含 子 结 构 序 列EBS1,EBS2与 两 个 外显 子 结 构 序 列IBS1,IBS2互 相 配 对 。结 构 域 ： 高 度 保 守 ，催 化 活 性 必 需 。结 构 域 ： A 提 供 2-OH 类 内 含 子 二 级 结 构 模 式 5 3

43、n 自 我 剪 切ribozyme, 自 我 剪切 的 RNA结 构 有锤 头 结 构 和 发 夹结 构 ， 其 中 尖 头指 出 自 我 剪 切 的部 位 。 结 构 RNaseP是 内 切 核 酸酶 ， 是 核 糖 核 蛋 白体 复 合 物 .能 剪 切所 有 tRNA前 体 的5 端 ， 除 去 多 余的 序 列 ， 形 成 3 -OH 和 5 -磷 酸 末端 。 RNaseP所 识别 的 是 底 物 的 高 级结 构 。 RNaseP底 物 的 二 级 结 构剪 切 位 点 n 如 ： L-19IVS具 有 5种 酶 活 性 ， 可 催 化 多 种 分 子 间反 应 。 1、 转 核

44、苷 酸 作 用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC2、 水 解 作 用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC3、 转 磷 酸 作 用CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp4、 去 磷 酸 作 用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi5、 限 制 性 内 切 酶 作 用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN 1、 pH值 对 活 性 的 影 响 pH7 0 - 7 5 时 核 酶 活 性 最 高 。 2、 二 价 金 属 阳 离 子 对 活 性 的 影 响 Mg2+ Mn2+ 3、 抗 生 素

45、对 活 性 的 影 响 大 多 数 为 抑 制 效 应 4、 变 形 剂 对 活 性 的 影 响 5、 温 度 对 活 性 的 影 响 在 65 范 围 内 随 温 度 升 高 而 增 加 ， 37 时 均 有适 宜 的 活 性 。 以 动 植 物 组 织 薄 片 材 料 作 为 生 物 敏 感 膜 的电 化 学 传 感 器 称 为 组 织 电 极 ， 此 系 酶 电 极 的 衍生 型 电 极 动 植 物 组 织 中 的 酶 是 反 应 的 催 化剂 与 酶 电 极 比 较 ， 组 织 电 极 具 有 如 下 优 点 ： 1.酶 活 性 较 离 析 酶 高 . 2.酶 的 稳 定 性 增 大

46、. 3.材 料 易 于 获 得 . 动 物 肝 组 织 中 含 有 丰 富 的 H2O2酶 ，可 与 氧 电 极 组 成 测 定 H2O2及 其 它 过 氧 化物 的 组 织 电 极 1981年 Mascini等 研 究 了数 种 哺 乳 动 物 和 其 它 动 物 （ 鸟 、 鱼 、 龟 ）的 肝 组 织 电 极 ， 翌 年 ， 报 道 了 基 于 牛 肝组 织 的 H2O2电 极 取 0 1mm厚 牛 肝 一 片 ， 覆 盖 子 氧电 极 的 特 氟 隆 膜 上 ， 用 “ O”型 橡 皮 圈 固定 ， 即 成 牛 肝 组 织 电 极 在 pH6 80的缓 冲 液 中 ， 使 电 极 与

47、空 气 中 的 氧 平 衡 ，然 后 加 入 底 物 ， 底 物 为 浓 度 大 于 1O-5mol L H2O2溶 液 反 应 产 生 的 氧 气 到 达 氧电 极 的 特 氟 隆 膜 时 ， 使 电 极 输 出 增加 在 1 10-4mol/L底 物 浓 度 时 ，1 5min即 可 获 得 稳 定 电 流 ， 如 图 所 示 ： 若 向 溶液 中 通 以 氮 气 ，以 降 低 氧 的 溶解 度 ， 减 少 空气 平 衡 溶 液 中氧 的 残 余 电 流（ 约 10A） 至十 分 之 几 微 安 ，检 测 下 限 可 降低 至 1 X 1 0 - 5mol L， 相关 系 数 ： R=0 997（ n 9） 植 物 组 织 膜 电 极结 构 图 解 a一 水 瓜 , b一 果 皮 , c-中 果 皮 ,d-内 果 皮1-中 果 皮 组 织 薄 片2-固 定 化 骨 架3-透 气 健 , 4-垫 圈5-内 电 解 质6-复 合 PH电 极7-塑 料 电 极 体3-7为 二 氧 化 碳 气 敏电 极 结 构