发光免疫技术

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1、第 十 章 化 学 发 光 免 疫 分 析 技 术 第 十 章 化 学 发 光 免 疫 分 析 技 术第 一 节 慨 述 一 、 化 学 发 光 二 、 化 学 发 光 效 率第 二 节 化 学 发 光 剂 和 标 记 技 术 一 、 化 学 发 光 剂 二 、 发 光 剂 的 标 记 技 术 第 三 节 化 学 发 光 免 疫 分 析 的 类 型一 、 直 接 化 学 发 光 免 疫 分 析二 、 化 学 发 光 酶 免 疫 分 析三 、 电 化 学 发 光 免 疫 分 析四 、 临 床 应 用 思 考 题小 结 发 光 免 疫 分 析 :是 将 发 光 分 析 和 免 疫 反应 相 结 合

2、 而 建 立 起 来 的 一 种 新 的 检 测微 量 抗 原 或 抗 体 的 新 型 标 记 免 疫 分 析技 术 。 第 一 节 概 述 放射免疫技术 酶免疫技术 发光免疫技术三 大 经 典 标 记 技 术 发 光 :是 指 分 子 或 原 子 中 的 电 子 吸 收 能 量 后 ， 由 基 态（ 较 低 能 级 ） 跃 迁 到 激 发 态 （ 较 高 能 级 ） ， 然 后 再 返 回到 基 态 ， 并 释 放 光 子 的 过 程 。根 据 形 成 激 发 态 分 子 的 能 量 来 源 不 同 可 分 为 :光 照 发 光 、 生 物 发 光 、 化 学 发 光 等 。 光 照 发 光

3、 （ photoluminescence） 是 指 发 光剂 （ 荧 光 素 ） 经 短 波 长 的 入 射 光 照 射 后 ， 电 子吸 收 能 量 跃 迁 到 激 发 态 ， 在 其 回 复 至 基 态 时 ，发 射 出 较 长 波 长 的 可 见 光 （ 荧 光 ） 。 生 物 发 光 （ bioluminescence） 是 指 发 生 在 生 物体 内 的 发 光 现 象 ， 如 萤 火 虫 的 发 光 ， 反 应 底 物 为萤 火 虫 荧 光 素 ， 在 荧 光 素 酶 的 催 化 下 ， 利 用 ATP能 ， 生 成 激 发 态 氧 化 型 荧 光 素 ， 它 在 回 复 基 态

4、 时多 余 的 能 量 以 光 子 的 形 式 释 放 出 来 。 化 学 发 光 （ chemiluminescence） 是 指 伴 随 化 学 反应 过 程 所 产 生 的 光 的 发 射 现 象 。 某 些 物 质 (发 光 剂 )在 化 学 反 应 时 ， 吸 收 了 反 应 过 程 中 所 产 生 的 化 学 能 ，使 反 应 的 产 物 分 子 或 反 应 的 中 间 态 分 子 中 的 电 子 跃迁 到 激 发 态 ， 当 电 子 从 激 发 态 回 复 到 基 态 时 ， 以 发射 光 子 的 形 式 释 放 出 能 量 ， 这 一 现 象 称 为 化 学 发 光 。一 、

5、化 学 发 光 一 些 化 学 反 应 能 释 放 足 够的 能 量 把 参 加 反 应 的 物 质 激发 到 能 发 射 光 的 电 子 激 发 态 ，若 被 激 发 的 是 一 个 反 应 产 物分 子 ， 则 这 种 反 应 过 程 叫 直接 化 学 发 光 。 反 应 过 程 可 简 单 地 描 述 如 下 ： A十 B C* C* C h 其 中 为 光 子 ， C*表 示 C处 于 单 线 激 发 态 。 若 激 发 能 传 递 到 另 一 个 未 参 加 化 学 反 应的 分 子 D上 ， 使 D分 子 激 发 到 电 子 激 发 态 ，D分 子 从 激 发 态 回 到 基 态

6、时 发 光 ， 这 种 过程 叫 间 接 化 学 发 光 。 反 应 过 程 可 表 示 如 下 ： A十 B C* C*十 D C十 D* D* D十 h 化 学 发 光 效 率 决 定 于 生 成 激 发 态 产 物 分 子 的 化学 激 发 效 率 （ CE） 和 激 发 态 分 子 的 发 射 效 率（ EM） 。 化 学 发 光 反 应 的 发 光 效 率 、 光 辐 射 的能 量 大 小 以 及 光 谱 范 围 ， 完 全 由 发 光 物 质 的 性 质所 决 定 ， 每 一 个 发 光 反 应 都 具 有 其 特 征 性 的 化 学发 光 光 谱 和 不 同 的 化 学 发 光

7、效 率 。二 、 化 学 发 光 效 率 第 二 节 化 学 发 光 剂 和 标 记 技 术 在 化 学 发 光 反 应 中 参 与 能 量 转 移 并 最 终以 发 射 光 子 的 形 式 释 放 能 量 的 化 合 物 ， 称 为化 学 发 光 剂 或 发 光 底 物 。 一 、 化 学 发 光 剂 能 作 为 化 学 发 光 剂 的 条 件 ： 发 光 的 量 子 产 率 高 ； 它 的 物 理 -化 学 特 性 要 与 被 标 记 或 测 定 的 物 质 相 匹 配 ； 能 与 抗 原 或 抗 体 形 成 稳 定 的 偶 联 结 合 物 ； 其 化 学 发 光 常 是 氧 化 反 应

8、的 结 果 ； 在 所 使 用 的 浓 度 范 围 内 对 生 物 体 没 有 毒 性 。 直 接 化 学 发 光 剂 直 接 化 学 发 光 剂 在 发 光 免 疫 分 析 过 程 中 不需 酶 的 催 化 作 用 ， 直 接 参 与 发 光 反 应 ， 它 们在 化 学 结 构 上 有 产 生 发 光 的 特 有 基 团 ， 可 直接 标 记 抗 原 或 抗 体 。 1. 吖 啶 酯 在 碱 性 条 件 下 被 H2O2氧 化时 ,发 出 波 长 为 470nm的 光 ， 具 有 很 高 的 发光 效 率 ， 其 激 发 态 产 物 N-甲 基 吖 啶 酮 是该 发 光 反 应 体 系 的

9、 发 光 体 。 2 三 联 吡 啶 钌 三 联 吡 啶 钌 RU(bpy)32+是电 化 学 发 光 剂 ， 它 和 电 子 供 体 三 丙 胺 （ TPA）在 阳 电 极 表 面 可 同 时 失 去 一 个 电 子 而 发 生 氧 化反 应 。 三 联 吡 啶 钌 电 化 学 发 光 剂 反 应 原 理 酶 促 反 应 发 光 剂 ： 是 利 用 标 记 酶 的 催 化 作 用 ， 使 发 光 剂 （ 底 物 ） 发 光 ， 这 一 类 需 酶 催 化 后 发 光 的 发 光 剂 称 为 酶 促 反 应 发 光 剂 。 1 鲁 米 诺 及 其 衍 生 物 2 AMPPD 1 鲁 米 诺 鲁

10、 米 诺 发 光 原 理 鲁 米 诺 增 强 发 光 反 应 原 理 2 AMPPD 3-(2 -螺 旋 金 刚 烷 )-4-甲 氧 基 -4-(3“ -磷 酰 氧 基 )苯 -1,2-二 氧 杂 环 丁 烷 1. 碳 二 亚 胺 （ EDC） 缩 合 法 二 、 发 光 剂 的 标 记 技 术 2. 过 碘 酸 钠 氧 化 法 3 重 氮 盐 偶 联 法 4. N-羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 活 化 法 1 发 光 剂 的 选 择 2 被 标 记 蛋 白 质 的 性 质 3 标 记 方 法 的 选 择 4 原 料 比 5 标 记 率 6 温 度 7 纯 化 与 保 存 影 响 标 记 的 因

11、 素 第 三 节 化 学 发 光 免 疫 分 析 的 类 型 用 吖 啶 酯 直 接 标 记 抗 体 (抗 原 )， 与 待 测 标 本 中 相 应 的 抗原 (抗 体 )发 生 免 疫 反 应 后 ， 形 成 固 相 包 被 抗 体 -待 测 抗 原 -吖 啶 酯 标 记 抗 体 复 合 物 ， 这 时 只 需 加 入 氧 化 剂 （ H2O2） 和NaOH使 成 碱 性 环 境 ， 吖 啶 酯 在 不 需 要 催 化 剂 的 情 况 下 分 解 、发 光 。 由 集 光 器 和 光 电 倍 增 管 接 收 、 记 录 单 位 时 间 内 所 产 生的 光 子 能 ， 这 部 分 光 的 积

12、 分 与 待 测 抗 原 的 量 成 正 比 ， 可 从标 准 曲 线 上 计 算 出 待 测 抗 原 的 含 量 。一 、 直 接 化 学 发 光 免 疫 分 析 发 光YY Y磁 微 粒 被 测 抗 原 +抗 体 + 带 丫 啶 酯标 记 物 抗体 YY YYY YYY YYY 冲 洗 后 （ 1）加 入 H2O2（ pH10）直 接 化 学 发 光 的 机 理 磁 微 粒 模 式 图 YYYYYY Y Y Y Y YYYYYYYYYY YYYY YY Y YY YYY YY Y特 点 抗 原 和 抗 体 结 合 与 未 结合 部 分 的 易 分 离磁 微 粒 技 术 化 学 发 光 酶

13、免 疫 分 析 （ chemiluminescence enzyme immunoassay， CLEIA） 是 用 参 与 催 化 某 一 化 学 发 光 反 应 的 酶如 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） 或 碱 性 磷 酸 酶 (ALP)来 标 记 抗 原 或 抗体 ， 在 与 待 测 标 本 中 相 应 的 抗 原 (抗 体 )发 生 免 疫 反 应 后 ， 形 成固 相 包 被 抗 体 -待 测 抗 原 -酶 标 记 抗 体 复 合 物 ， 经 洗 涤 后 ， 加 入底 物 (发 光 剂 )， 酶 催 化 和 分 解 底 物 发 光 ， 由 光 量 子 阅 读 系 统 接收

14、， 光 电 倍 增 管 将 光 信 号 转 变 为 电 信 号 并 加 以 放 大 ， 再 把 它 们传 送 至 计 算 机 数 据 处 理 系 统 ， 计 算 出 测 定 物 的 浓 度 。二 、 化 学 发 光 酶 免 疫 分 析 该 分 析 系 统 采 用 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） 标记 抗 体 (或 抗 原 )， 在 与 反 应 体 系 中 的 待 测 标本 和 固 相 载 体 发 生 免 疫 反 应 后 ， 形 成 固 相 包被 抗 体 -待 测 抗 原 -酶 （ HRP） 标 记 抗 体 复 合物 ， 这 时 加 入 鲁 米 诺 发 光 剂 、 H2O2和 化 学

15、发光 增 强 剂 使 产 生 化 学 发 光 。 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 化 学 发 光 免 疫 分 析 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 化 学 发 光 免 疫 分 析 示 意 图 该 分 析 系 统 以 碱 性 磷 酸 酶 标 记 抗 体 (或 抗 原 )，在 与 反 应 体 系 中 的 待 测 标 本 和 固 相 载 体 发 生免 疫 反 应 后 ， 形 成 固 相 包 被 抗 体 -待 测 抗 原 -酶标 记 抗 体 复 合 物 ， 这 时 加 入 AMPPD发 光 剂 ，碱 性 磷 酸 酶 使 AMPPD脱 去 磷 酸 根 基 团 而 发 光 。 碱 性 磷 酸 酶

16、 标 记 的 化 学 发 光 免 疫 分 析 碱 性 磷 酸 酶 标 记 化 学 发 光 免 疫 分 析 示 意 图 分 配 样 品 ,磁 颗 粒和 试 剂 孵 育使 反 应 物结 合 在 磁 场 中清 洗 去 除未 结 合 物 质 加 入底 物产 生信 号 孵 育 ,促 使 信 号的 产 生 信 号检 测 电 化 学 发 光 免 疫 分 析（ electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA） 是 以 电 化 学 发 光 剂 三 联 吡 啶 钌 标 记 抗 体 (抗 原 )， 以 三 丙 胺 (TPA)为 电 子 供 体 ， 在 电 场 中 因 电 子

17、转 移 而 发 生 特 异 性 化 学 发 光 反 应 ， 它 包 括 电 化 学 和 化 学 发 光 两 个 过 程 。 三 、 电 化 学 发 光 免 疫 分 析 在 电 化 学 发 光 免 疫 分 析 系 统 中 ， 磁 性 微 粒 为 固 相 载 体包 被 抗 体 (抗 原 )， 用 三 联 吡 啶 钌 标 记 抗 体 (抗 原 )， 在反 应 体 系 内 待 测 标 本 与 相 应 的 抗 原 (抗 体 )发 生 免 疫反 应 后 ， 形 成 磁 性 微 粒 包 被 抗 体 -待 测 抗 原 -三 联 吡 啶钌 标 记 抗 体 复 合 物 ， 这 时 将 上 述 复 合 物 吸 入

18、流 动 室 ，同 时 引 人 TPA缓 冲 液 。 当 磁 性 微 粒 流 经 电 极 表 面 时 ，被 安 装 在 电 极 下 面 的 电 磁 铁 吸 引 住 ， 而 未 结 合 的 标 记抗 体 和 标 本 被 缓 冲 液 冲 走 。 与 此 同 时 电 极 加 压 ， 启 动电 化 学 发 光 反 应 ， 使 三 联 吡 啶 钌 和 TPA在 电 极 表 面 进行 电 子 转 移 ， 产 生 电 化 学 发 光 ， 光 的 强 度 与 待 测 抗 原的 浓 度 成 正 比 。 电 化 学 发 光 免 疫 分 析 示 意 图 电 化 学 发 光 免 疫 测 定 示 意 图 标 记 磁 颗

19、粒 在 电 场 中 发 光 工 作 示 意 图 1.甲 状 腺 激 素 2 生 殖 激 素 3 垂 体 激 素 和 皮 质 激 素 4 贫 血 因 子 5 肿 瘤 标 志 物 6 感 染 性 疾 病 7 糖 尿 病 胰 岛 素 、 血 清 C-肽 、 血 浆 胰 高 糖 素 等 。 8 心 脏 标 志 物 9 病 毒 标 记 物 10 过 敏 性 疾 病 11 治 疗 药 物 监 测 四 、 临 床 应 用 1 什 么 是 发 光 免 疫 分 析 ？ 什 么 是 化 学 发 光 免 疫 分 析 ？2 化 学 发 光 与 荧 光 的 区 别 ？ 化 学 发 光 反 应 的 条 件 ？3 什 么

20、叫 化 学 发 光 剂 ？ 化 学 发 光 剂 必 须 具 备 那 些 条 件 ？4 吖 啶 酯 化 学 发 光 的 原 理 和 特 点 是 什 么 ？5 酶 促 反 应 的 发 光 剂 有 哪 些 ？ 其 发 光 原 理 和 特 点 是 ？6 三 联 吡 啶 钌 发 光 的 原 理 和 特 点 是 什 么 ？7 三 丙 胺 在 电 化 学 发 光 中 起 什 么 作 用 ？8. 发 光 剂 的 标 记 有 那 些 方 法 ？ 影 响 因 素 有 那 些 ？9 什 么 是 直 接 化 学 发 光 免 疫 分 析 ？ 其 特 点 是 什 么 ？10 什 么 是 化 学 发 光 酶 免 疫 分 析

21、 ？ 其 特 点 是 什 么 ？思 考 题 发 光 是 指 分 子 或 原 子 中 的 电 子 吸 收 能 量 后 ， 由基 态 跃 迁 到 激 发 态 ， 然 后 再 返 回 到 基 态 ， 并 释放 光 子 的 过 程 。 化 学 发 光 是 吸 收 了 化 学 反 应 过程 中 所 产 生 的 化 学 能 使 分 子 激 发 而 发 光 。 化 学发 光 免 疫 分 析 是 将 化 学 发 光 与 免 疫 反 应 相 结 合 ，用 于 检 测 微 量 抗 原 或 抗 体 的 标 记 免 疫 分 析 技 术 ，分 为 直 接 化 学 发 光 免 疫 分 析 ， 化 学 发 光 酶 免 疫分 析 和 电 化 学 发 光 免 疫 分 析 。小 结