体内药物分析

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1、 F分 析 方 法 的 设 计 依 据F分 析 方 法 建 立 的 一 般 步 骤F分 析 方 法 验 证 的 内 容 与 要 求F体 内 药 物 分 析 应 用 示 例本 章 内 容 提 要 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证 第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据建 立 分 析 检 测 方 法 的 主 要 依 据 待 测 药 物 的 理 化 性 质 及 在 生 物 体 内 的 存 在 状 况 分 析 测 定 的 目 的 与 要 求 生 物 样 品 的 类 型 与 预 处 理 方 法 实 验 室 条 件 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证 一 、 待

2、测 药 物 的 理 化 性 质 及 体 内 存 在 状 况准 确 测 定 生 物 样 品 中 的 药 物 或 其 特 定 代 谢 物 预 处 理 待 测 物 从 结 合 物 或 缀 合 物 中 释 放选 择 样 品 预 处 理 方 法 首 先 应 考 虑 待 测 药 物 的 理 化 性 质 药 物 在 生 物 体 内 的 存 在 状 况 药 物 在 生 物 体 内 的 生 物 转 化 (代 谢 )途 径第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据 (一 )待 测 药 物 的 理 化 性 质药 物 的 pKa值 、 亲 脂 性 、 溶 解 度

3、、 分 配 系 数 等 预 处 理 及 检 测 方 法具 有 亲 脂 性 在 适 当 的 pH值 下 用 溶 剂 萃 取具 有 强 极 性 或 亲 水 性 沉 淀 蛋 白 、 固 相 萃 取 、 离 子 对 萃 取 或衍 生 化 后 萃 取 等具 有 挥 发 性 GC测 定 法具 有 光 谱 或 电 化 学 特 性 分 析 检 测 方 法药 物 的 稳 定 性 萃 取 浓 缩 技 术对 酸 碱 不 稳 定 避 免 使 用 强 酸 或 强 碱 性 溶 剂 对 热 不 稳 定 避 免 高 温 蒸 发 溶 剂 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计

4、依 据 (二 )待 测 药 物 的 体 内 存 在 状 态与 血 浆 蛋 白 结 合 的 强 弱 及 结 合 率 的 高 低分 离 萃 取 方 法蛋 白 结 合 较 强 不 宜 直 接 采 用 溶 剂 萃 取体 内 浓 度 高 低 、 代 谢 过 程 及 其 代 谢 产 物分 析 检 测 技 术浓 度 较 低 （ 尤 其 有 代 谢 产 物 共 存 ）代 谢 产 物 的 干 扰 与 特 定 代 谢 产 物 的 同 时 测 定采 用 LC-MS、 EIA等 分 析 检 测 技 术 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据 二 、 分 析 测

5、 定 的 目 的 与 要 求体 内 药 物 分 析 的 目 的 影 响 分 析 方 法 的 应 用药 代 动 力 学 研 究 药 物 在 体 内 吸 收 、 分 布 、 代 谢 和 排 泄 过 程血 浆 浓 度 随 时 间 的 变 化 过 程 ； 代 谢 途 径 及 代 谢 产 物要 求 同 时 测 定 原 形 药 物 和 代 谢 产 物检 测 宽 线 性 范 围 (C max Cmax的 1/20)、 高 灵 敏 度 (10-9g/ml)和 高 专 属 性 (分 离 能 力 )(原 形 药 物 及 其 代 谢 产 物 的 分 离 )方 法 不 必 强 调 方 法 的 简 便 、 快 速 ；大

6、 多 采 用 色 谱 及 其 脱 线 或 在 线 联 用 技 术 ， 如 HPLC、 LC-MS 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据 二 、 分 析 测 定 的 目 的 与 要 求临 床 治 疗 药 物 监 测 有 效 治 疗 浓 度 范 围 内 药 物 浓 度方 法 尽 量 简 便 、 易 行 ； 适 用 于 长 期 、 批 量 样 品 的 测 定大 多 采 用 UV、 RIA或 EIA等中 毒 患 者 的 临 床 抢 救 药 物 浓 度 极 高方 法 不 必 强 调 方 法 的 灵 敏 度 ， 强 调 方 法 的 特 异 性 和

7、 分 析 速 度 大 多 采 用 色 谱 及 其 联 用 技 术 GC、 GC-MS、 RIA或 EIA 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据 三 、 生 物 样 品 的 类 型 与 预 处 理 方 法生 物 样 品 的 类 型 与 预 处 理 方 法 决 定 分 析 方 法 的 应 用以 血 浆 或 血 清 为 分 析 样 品采 用 蛋 白 沉 淀 -溶 剂 萃 取 预 处 理 技 术分 析 样 品 较 为 “ 干 净 ” ， 可 用 HPLC检 测用 RIA分 析样 品 的 预 处 理 方 法 可 较 为 粗 放 经 过 简 单

8、的 蛋 白 沉 淀 或 不 经 任 何 预 处 理 直 接 测 定 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据 四 、 实 验 室 条 件在 设 计 体 内 药 物 分 析 方 法 时 ， 还 应 充 分 考 虑到 实 验 室 现 有 的 或 有 可 能 在 其 它 实 验 室 使 用 的 仪器 装 备 ， 合 理 选 择 可 行 的 分 析 方 法 。第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 一 节 分 析 方 法 的 设 计 依 据 第 二 节 分 析 方 法建 立 的 一 般 步 骤 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立

9、 与 验 证 一 、 分 析 方 法 的 选 择体 内 药 物 分 析 方 法 的 设 计生 物 样 品 中 的 药 物 浓 度 决 定 分 析 方 法 的 首 要 因 素生 物 样 品 中 药 物 或 其 特 定 代 谢 产 物 的 浓 度 低 、 样 品 量 少 难 以 通 过 增 加 取 样 量 提 高 方 法 灵 敏 度 通 过 选 择 适 当 的 分 析 方 法 适 应 样 品 分 析 需 求体 内 药 物 分 析 中 常 用 分 析 方 法 特 点 见 表 4-1第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 二 、 分 析 方 法

10、 的 建 立 分 析 方 法 建 立 之 前查 阅 文 献 资 料 充 分 了 解 药 物 在 体 内 的 动 力 学 过 程 ， 使 所拟 定 的 分 析 方 法避 免 受 到 代 谢 产 物 的 干 扰 适 用 于 实 际 生 物 样 品 测 定第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 二 、 分 析 方 法 的 建 立 初 步 拟 定 分 析 方 法 后进 行 一 系 列 试 验 工 作 选 择 最 佳 分 析 条 件同 时 验 证 分 析 方 法 的 可 行 性 确 认 是 否 适 用 于 实 际 生 物 样 品F 分 析 方 法

11、 的 建 立 和 验 证 过 程 是 不 可 截 然 划 分 的 为 便 于 讨 论 而 分 别 叙 述F 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 (一 )检 测 条 件 的 筛 选标 准 物 质 照 拟 定 的 分 析 方 法 (不 包 括 生 物 基 质 的 预 处 理 )测 定 确 定 最 佳 分 析 检 测 条 件 (如 色 谱 条 件 )和 检 测 灵 敏 度HPLC 调 整 检 测 器 (类 型 、 条 件 ) 色 谱 柱 (型 号 、 牌 号 、 填 料 性 状 与 粒 经 、 柱 长

12、度 ) 流 动 相 (组 分 及 其 配 比 )及 其 流 速 柱 温 、 进 样 量 、 内 标 物 质 的 浓 度 及 其 加 入 量 等 使 各 物 质 具 有 足 够 的 方 法 灵 敏 度 (LOQ) 良 好 的 色 谱 参 数 (n、 R、 T) 适 当 的 保 留 时 间 (tR) 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 (二 )分 离 条 件 的 筛 选在 进 行 分 离 条 件 筛 选 时 ， 应 考 察 生 物 基 质 中 的 内 源 性 物 质 及 代 谢产 物 对 分 离 与 检 测 的 干 扰 ， 步 骤 如

13、下 ：1 空 白 溶 剂 试 验 溶 剂 (方 法 特 异 性 )2 空 白 生 物 基 质 试 验 endogenous pounds(方 法 特 异 性 )3 模 拟 生 物 样 品 试 验 方 法 效 能 指 标4 实 际 生 物 样 品 测 试 代 谢 产 物 (方 法 特 异 性 )第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 1 空 白 溶 剂 试 验待 测 药 物 的 非 生 物 基 质 溶 液 （ 通 常 为 水 溶 液 ） 采 用 拟 定 的 分 析 方 法 进 行 衍 生 化 反 应 、 萃 取 分 离 等 样 品 预 处

14、 理 （ 反 应 试 剂 、 衍 生 化 试 剂 、 萃 取 溶 剂 等 ） 测 定 响 应 信 号 （ 如 HPLC峰 面 积 或 峰 高 ）考 察 目 标 方 法 的 特 异 性 空 白 值 应 尽 可 能 小 ， 并 能 有 效 校 正 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 色 谱 分 析 法 可 通 过 改 变 反 应 条 件 、 萃 取 方 法 或 萃 取 条 件 （ 萃 取 溶 剂 的极 性 、 混 合 溶 剂 的 配 比 ， 固 相 萃 取 填 料 性 质 、 冲 洗 剂 与 洗 脱 剂 及 其 用量 等 ） ， 甚 至

15、 检 测 器 类 型 空 白 试 剂 信 号 应 不 干 扰 药 物 的 测 定 （ 如 R 1.5） 本 步 骤 主 要 考 察 需 经 化 学 反 应 的 预 处 理 过 程 ， 若 预 处 理 过 程 仅 为 生 物 样 品的 提 取 分 离 ， 则 可 不 进 行 该 步 骤 ， 直 接 进 行 空 白 生 物 基 质 试 验 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 2. 空 白 生 物 基 质 试 验空 白 生 物 基 质 (blank biological matrix) 如 空 白 血 浆 照 “ 1. 空 白 溶 剂 试

16、 验 ” 项 下 方 法 操 作考 察 目 标 生 物 基 质 中 内 源 性 物 质 对 测 定 的 干 扰 （ 方 法 特 异 性 ） 在 待 测 药 物 (或 特 定 的 活 性 代 谢 物 、 内 标 物 质 等 )的 “ 信 号 窗 ” （ 信 号 附 近 的 有 限 范 围 ） 内 不 应 出 现 内 源 性 物 质 信 号 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 3. 模 拟 生 物 样 品 试 验模 拟 生 物 样 品 (质 量 控 制 ,QC样 品 ) 空 白 生 物 基 质 中 加 入 待 测 药 物 照 “ 1.

17、空 白 溶 剂 试 验 ” 项 下 方 法 操 作考 察 目 标 方 法 的 线 性 范 围 、 精 密 度 与 准 确 度 、 灵 敏 度 药 物 的 萃 取 回 收 率 等 各 项 技 术 指 标 同 时 进 一 步 检 验 生 物 基 质 中 内 源 性 物 质 以 及 可 能 共 同 使 用 的 其 他 药 物 对 测 定 的 干 扰 程 度 ， 即 方 法 特 异 性 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 色 谱 分 析 法 进 一 步 考 察 待 测 药 物 (或 内 标 物 )与 内 源 性 物 质 (或 其 它 药 物

18、 )的分 离 情 况 色 谱 峰 的 tR、 n 和 T 是 否 与 水 溶 液 的 一 致 色 谱 峰 是 否 为 单 一 成 分 标 准 曲 线 的 截 距 是 否 显 著 偏 离 零 点 等 内 源 性 物 质 是 否 对 待 测 药 物 或 内 标 物 质 构 成 干 扰第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 4. 实 际 生 物 样 品 的 测 试空 白 生 物 基 质 和 模 拟 生 物 样 品 试 验 确 定 的 分 析 方 法 及 其 条 件 不 能 完 全 确 认 是 否 适 合 于 实 际 生 物 样 品 的 测 定

19、 药 物 在 体 内 可 能 与 内 源 性 物 质 结 合 (如 血 浆 蛋 白 结 合 物 ) 或 代 谢 生 成 数 个 代 谢 产 物 及 其 进 一 步 的 结 合 物 (或 缀 合 物 )实 际 生 物 样 品 确 立 分 析 方 法 后 ， 尚 需 进 行 实 际 生 物 样 品 的 测 试考 察 目 标 代 谢 产 物 对 药 物 、 内 标 物 质 的 干 扰 情 况 进 一 步 验 证 方 法 的 可 行 性 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 二 节 分 析 方 法 的 建 立 步 骤 第 三 节 分 析 方 法验 证 的 内 容 与 要 求用 于 实

20、际 生 物 样 品 分 析 之 前验 证 (validation) 分 析 方 法 的 可 行 性 与 可 靠 性方 法 验 证 时 应 考 虑 影 响 分 析 方 法所 有 可 变 因 素 (采 样 ,样 品 制 备 ,色 谱 分 离 ,检 测 与 数 据 评 价 等 )使 用 的 技 术 指 标效 能 指 标 使 用 的 样 品通 常 采 用 模 拟 生 物 样 品 和 用 药 后 的 实 际 生 物 样 品 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证 验 证 步 骤首 先 为 分 析 方 法 的 验 证 特 异 性 、 精 密 度 与 准 确 度 、 回 收 率定 量 限 与 检

21、 测 限 、 溶 液 稳 定 性其 次 为 生 物 基 质 中 待 测 药 物 稳 定 性 的 验 证 室 温 放 置 、 冷 冻 （ 或 冷 藏 ） 、 冻 -融 循 环第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 验 证 的 效 能 指 标 与 基 本 要 求1 特 异 性 避 免 干 扰2 标 准 曲 线 与 线 性 范 围 覆 盖 所 有 浓 度 范 围3 准 确 度 与 实 际 状 况 相 符4 精 密 度 结 果 可 重 现5 定 量 限 达 到 峰 浓 度 的 1/10 1/206 稳 定 性 确 保 所 有 样 品 准 确

22、 测 定 7 提 取 回 收 率 确 保 准 确 度 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 一 、 方 法 特 异 性 (专 属 性 或 选 择 性 )方 法 的 特 异 性 (specificity)又 称 专 属 性 或 专 一 性 ， 通 常 与 选 择 性 (selectivity)互 用系 指 当 有 内 源 性 物 质 存 在 时 ， 方 法 准 确 测 定 待 测 物 质 的 能 力专 属 性 表 示 所 检 测 的 信 号 (响 应 )系 属 于 待 测 药 物 所 特 有 的选 择 性 系 指 将 待 测 物 质

23、 与 其 代 谢 物 及 同 服 的 其 它 药 物 加 以 区分 (分 离 )的 能 力特 异 性 函 盖 二 者 ， 以 验 证 所 测 定 的 物 质 与 待 测 药 物 的 同 一 性 考 察 一 个 分 析 方 法 是 否 具 有 特 异 性 ， 应 着 重 考 虑 以 下 几 点 ： 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 1. 内 源 性 物 质 的 干 扰比 较 待 测 药 物 或 其 活 性 代 谢 产 物 检 测 信 号对 照 品 （ 或 标 准 品 ）空 白 生 物 基 质模 拟 生 物 样 品 （ 空 白 生

24、 物 基 质 中 添 加 对 照 品 ）如 HPLC色 谱 峰 的 t R、 n 和 T 是 否 一 致 及 与 内 源 性 物 质 色 谱 峰 的 R确 证 内 源 性 物 质 对 分 析 方 法 有 无 干 扰 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2. 代 谢 产 物 的 干 扰比 较 模 拟 生 物 样 品 和 用 药 后 的 实 际 生 物 样 品 的 检 测 信 号与 代 谢 产 物 (在 实 际 样 品 中 tR 随 时 间 延 长 而 增 加 )的 R如 HPLC色 谱 峰 的 tR、 n 和 T 或 改 变 色

25、谱 条 件 (色 谱 柱 )再 比 较 确 证 其 它 代 谢 产 物 对 分 析 方 法 有 无 干 扰结 构 已 知 的 特 定 活 性 代 谢 物 的 测 定必 要 时 通 过 HPLC-DAD和 LC-MS确 证 色 谱 峰 的 单 纯 性 和 同 一 性对 于 结 构 未 知 的 代 谢 产 物 的 测 定 可 采 用 LC-LC-NMR进 行 结 构 的 初 步 推 测 后 ， 考 察 其 干 扰 情 况 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 3. 伍 用 药 物 的 干 扰TDM 时 还 要 考 虑 患 者 可 能

26、同 时 服 用 药 物 (通 常 为 数 有 限 )的 干 扰 比 较 待 测 药 物 及 可 能 同 时 服 用 药 物 的 模 拟 生 物 样 品 的 检 测 信 号如 HPLC色 谱 峰 的 t R、 n 和 T 是 否 一 致确 证 同 时 服 用 药 物 对 分 析 方 法 的 干 扰 情 况 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 4. 与 参 比 方 法 的 相 关 性除 上 述 方 法 外 ， 有 时 还 可 使 用 参 比 方 法 对 照参 比 方 法 一 般 选 用 特 异 性 强 、 准 确 度 高 、 线 性

27、 关 系 良 好 的 色 谱 法如 在 TDM中 使 用 UV(或 RIA)时 , 可 以 HPLC(或 GC)为 参 比参 比 方 法 测 定 结 果 为 横 坐 标 (X); 拟 定 方 法 结 果 为 纵 坐 标 (Y)用 最 小 二 乘 法 计 算 回 归 方 程 Y a bX (坐 标 标 度 相 等 )相 关 系 数 (r)表 示 两 种 方 法 测 得 结 果 的 一 致 性若 r 1， 表 示 拟 定 方 法 为 非 线 性 ， 如 RIA 中 抗 血 清 滴 度 选 择 不 当 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要

28、求 4. 与 参 比 方 法 的 相 关 性Y a bX截 距 (a) 表 示 拟 定 方 法 受 到 恒 定 干 扰 的 程 度 内 源 性 物 质 (UV)斜 率 (b) 表 示 拟 定 方 法 受 到 比 例 干 扰 的 程 度 标 记 抗 原 不 纯 (RIA)与 参 比 方 法 的 相 关 性 比 较 除 显 示 分 析 方 法 的 特 异 性 外斜 率 b表 示 两 种 方 法 测 得 结 果 的 一 致 性若 参 比 方 法 准 确 度 良 好 若 截 距 a0, 则 拟 定 方 法 的 准 确 度 (回 收 率 )为 100b(%) 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与

29、验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 二 、 标 准 曲 线 与 线 性 范 围标 准 曲 线 （ standard curve） calibration curve or working curve生 物 样 品 中 所 测 定 药 物 浓 度 与 响 应 的 相 关 性 （ 比 例 的 程 度 ）通 常 用 回 归 分 析 方 法 所 得 的 回 归 方 程 来 评 价除 少 数 方 法 （ 免 疫 分 析 法 ） 外 ， 标 准 曲 线 通 常 为 线 性 模 式回 归 分 析 法 为 最 小 二 乘 法 （ least squares）或 加 权 最 小 二 乘 法

30、 （ weighted least squares）线 性 范 围 （ linear rang） 标 准 曲 线 的 最 高 与 最 低 浓 度 的 区 间 模 拟 生 物 样 品 的 测 定 结 果 应 达 到 试 验 要 求 的 精 密 度 和 准 确 度 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 二 、 标 准 曲 线 与 线 性 范 围 (续 )标 准 曲 线 用 模 拟 生 物 样 品 建 立线 性 范 围 (不 包 括 零 点 )应 能 覆 盖 全 部 生 物 样 品 中 的 药 物 浓 度不 能 使 用 外 推 的 方

31、法 求 算 未 知 生 物 样 品 中 的 药 物 浓 度建 立 标 准 曲 线 所 使 用 的 模 拟 生 物 样 品应 使 用 与 待 测 的 含 药 生 物 样 品 相 同 的 生 物 基 质 制 备第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 标 准 曲 线 的 一 般 建 立 方 法 1. 标 准 系 列 溶 液 (非 生 物 基 质 溶 液 )的 制 备溶 剂 水 或 甲 醇 （ 或 其 他 适 当 溶 剂 ）浓 度 标 准 模 拟 生 物 样 品 中 药 物 浓 度 的 50倍 以 上 加 入 量 为 生 物 样 品 总 体

32、 积 的 2%以 下 避 免 标 准 模 拟 生 物 样 品 与 实 际 样 品 存 在 较 大 差 异浓 度 较 低 应 除 去 溶 剂 后 再 加 入 生 物 基 质 否 则 ,在 实 际 样 品 测 定 时 应 加 入 等 体 积 的 溶 剂 并 涡 旋 混 匀 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2. 标 准 系 列 溶 液 的 浓 度 范 围至 少 含 5 8个 浓 度 点 (不 包 括 零 点 ,即 空 白 )可 覆 盖 全 部 待 测 生 物 样 品 中 的 药 物 浓 度如 ： 1、 2、 5、 10、 20、

33、50、 100(等 比 梯 度 模 式 比 例 常 数 约 为 2)若 体 内 平 均 达 峰 浓 度 为 50， 其 1/20为 2.5设 定 最 高 浓 度 为 100， 最 低 浓 度 为 1 (个 体 差 异 )实 际 制 备 时 ： 500、 250、 100、 50、 20、 10 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 3. 标 准 系 列 模 拟 生 物 样 品 的 制 备 空 白 生 物 基 质 (如 血 浆 )加 入 标 准 系 列 溶 液 适 量 ， 涡 旋 混 匀为 防 止 在 标 准 溶 液 加 入 及 涡

34、 旋 混 合 时 造 成 的 损 失 先 加 入 标 准 溶 液 再 加 入 空 白 生 物 基 质 涡 旋 混 匀 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 4. 标 准 曲 线 的 绘 制以 待 测 药 物 的 检 测 响 应 (如 色 谱 峰 面 积 或 峰 高 ) 或 与 内 标 物 质 的 检测 响 应 的 比 值 (内 标 法 )(因 变 量 , y )对 模 拟 血 药 浓 度 (自 变 量 ,x)求 得 回 归 方 程 ( y a bx )及 其 相 关 系 数 ( )在 一 组 由 至 少 7个 浓 度 (不 包 括

35、 零 点 )构 成 的 标 准 曲 线 中 ， 至 多 可有 2个 浓 度 点 数 据 ， 可 予 剔 除 。 但 应 有 确 切 原 因 ， 如 ：样 品 处 理 有 损 失 、 色 谱 图 有 问 题 ， 或显 著 偏 离 标 准 曲 线 该 数 据 参 与 标 准 曲 线 回 归 后 ， 计 算 QC样 品 或 返 算 该 点 浓 度 时 显 著 偏 离 其 标 称 浓 度 (配 制 浓 度 ) 其 余 应 有 至 少 5个 浓 度 点 在 标 准 曲 线 上 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 5. 加 权 最 小 二

36、乘 法最 小 二 乘 法 每 个 浓 度 点 绝 对 误 差 (yi yi)赋 予 同 等 的 重 要 性 标 准 曲 线 上 的 高 低 浓 度 相 差 悬 殊 (范 围 达 102)低 浓 度 区 的 计 算 值 相 对 误 差 过 大 ， 难 以 满 足 规 定 要 求加 权 最 小 二 乘 法 回 归 计 算 时 增 加 一 个 权 重 因 子 (w)各 浓 度 的 响 应 值 与 回 归 值 的 相 对 离 差 平 方 和 达 到 最 小 式 中 ， wi为 标 准 曲 线 上 第 i个 浓 度 点 的 权 重 因 子 2 i ii y yy 2)( iii yyw 2)( ii y

37、y 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 1） 回 归 方 程 (y = a + b x)参 数 的 计 算 22b iiiii iiiiiiii xwxww ywxwyxww 222a iiiii iiiiiiiii xwxww yxwxwywxw i iiii w xwyw ba 或 ， 2 2/ /r iiiii iiiii wywyw wywbxaw 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2） 权 重 因 子 的 选 择加 权 赋 予 低 浓 度 点 以 更

38、大 的 权 重在 实 际 工 作 中 的 一 般 方 法当 wi=1/(yi)2时 ， 则而 y i与 xi成 正 比所 以 ， 令 wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通 常 取 wi=1/C2)当 高 浓 度 点 测 量 值 的 准 确 度 下 降 过 大低 浓 度 点 权 重 过 大 ， 降 低 低 浓 度 点 的 权 重 ， wi=k/xi 2)( iii yyw 2 i ii y yy 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 标 准 曲 线 的 限 度 要 求药 代 动 力 学 或 生 物 利 用 度 研 究标 准 曲

39、线 至 少 包 括 5个 浓 度 (通 常 为 5 8个 浓 度 ,不 包 括 零 点 )最 高 浓 度 应 高 于 达 峰 浓 度 (Cmax)； 最 低 浓 度 应 低 于 Cmax的10% 5%， 并 应 为 方 法 的 LOQ(非 LOD)回 归 方 程 的 截 距 应 接 近 于 零相 关 系 数 要 求 0.99(色 谱 法 )或 0.98(生 物 学 方 法 )若 非 线 性 ， 可 分 为 高 低 两 个 浓 度 区 间 (每 个 区 间 不 少 于 5个 浓 度 )， 分 别 加 权 回 归 如 1、 2、 5、 10、 20和 10、 20、 50、 100、 200 第

40、四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 三 、 准 确 度方 法 准 确 度 (accuracy)系 指 用 该 方 法 测 得 的 生 物 样 品 中 待 测 药 物 的 浓 度 与 其 真 实 浓度 的 接 近 程 度应 使 用 实 际 生 物 样 品 测 定 ， 但 实 际 生 物 样 品 的 浓 度 是 未 知 的所 以 ， 通 常 使 用 模 拟 生 物 样 品 测 定一 般 用 相 对 回 收 率 (relative recovery， RR) 或 相 对 误 差(relative error， RE)表 示 第 四 章 分

41、 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 1. 测 定 法取 空 白 生 物 基 质 （ 如 血 浆 ） 数 份 ， 照 标 准 曲 线 项 下 方 法 操 作 ，用 标 准 曲 线 计 算在 标 准 曲 线 范 围 内 制 备 质 控 (quality control， QC)样 品高 (接 近 上 限 )、 中 、 低 (接 近 LOQ) 3个 浓 度每 一 浓 度 至 少 5个 样 本与 随 行 的 标 准 曲 线 同 法 测 定 、 计 算 ， 每 个 样 品 分 析 测 定 1次 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三

42、节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2. 结 果 计 算 与 限 度 要 求计 算 测 定 值 M (measured)平 均 值 与 理 论 浓 度 (加 入 值 )A(added)比 值相 对 回 收 率相 对 误 差限 度 要 求相 对 回 收 率 应 在 85% 115% (LOQ附 近 80% 120%) RE在 15% (LOQ附 近 为 20%)）（ %100 AMRR ）（）（ %100%100 RRA AMRE 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 四 、 精 密 度方 法 精 密 度 (precisio

43、n )系 指 每 次 测 定 结 果 与 多 次 测 定 的 平 均 值 的 偏 离 程 度表 示 该 分 析 方 法 的 可 重 复 性 (reproducibility)反 映 分 析 方 法 的 可 操 作 性 ， 是 方 法 验 证 的 基 本 要 点 之 一实 际 生 物 样 品 的 量 有 限 (如 血 浆 ， 一 般 为 0.5 2ml)使 用 模 拟 生 物 样 品 测 定 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 1. 表 示 方 法方 法 精 密 度 一 般 用 标 准 偏 差 (standard deviatio

44、n， SD)或 相 对 标 准偏 差 (relative standard deviation， RSD)表 示 SD=RSD= =包 括 批 内 (within-run或 intra-assay)RSD日 内 (within-day) 和 批 间 (between-run或 inter-assay)RSD日 间 (between- day， day-to-day) 11 2 n XXnii i ）（ %100XSD ）（ %10011 2 Xn XXnii i 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2. 测 定 法 分 别 测

45、定 法 ( )照 准 确 度 项 下 方 法 ， 取 空 白 生 物 基 质 (如 血 浆 )数 份 ， 分 别 在 同 一批 内 和 不 同 批 间 制 备 高 、 中 、 低 3个 浓 度 的 QC样 品 ， 并 分 析 测 定批 内 RSD每 一 浓 度 5 6个 样 品 ， 每 个 样 品 测 定 1次 ， 用 随 行 标 准 曲 线分 别 计 算 3个 浓 度 及 每 1浓 度 的 RSD批 间 RSD每 1分 析 批 内 每 一 浓 度 制 备 1个 样 品 ， 每 个 样 品 测 定 1次 ； 用 随 行 标 准 曲 线 计 算 3个 浓 度 (每 一 浓 度 5 6个 分 析

46、批 数 据 )的 RSD 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2. 测 定 法 连 续 测 定 法 ( )若 实 际 样 品 测 定 所 用 的 分 析 批 次 少 于 5批 ， 也 可 进 行 3个 批 次 的连 续 分 析 (每 1浓 度 的 每 1批 次 为 5 6个 样 本 )方 差 分 析 法 批 间 RSD =批 内 RSD = = (%)1001 )(%)1001 1 2 XI XXnXISS Ii iA ）（ %100(%)100 X IN SSSSX INSS Atote ）（）（ %100)(1 1 21 2

47、 X IN XXnXXIi Ii inj ij 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 3. 限 度 要 求在 药 代 动 力 学 和 生 物 利 用 度 研 究 中对 g/ml级 水 平 的 RSD一 般 应 10%ng/ml级 水 平 的 RSD一 般 应 15%在 LOQ附 近 RSD应 20%。 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 五 、 定 量 限方 法 定 量 限 (limit of quantitation， LOQ)系 指 在 保 证 具 有 一 定

48、可 靠 性 (准 确 度 与 精 密 度 符 合 要 求 )的 前提 下 ， 能 测 定 出 生 物 样 品 中 药 物 的 最 低 浓 度又 称 为 方 法 灵 敏 度 (sensitivity)标 准 曲 线 上 的 最 低 浓 度 点 (最 低 浓 度 点 LOQ)要 求 应 能 满 足 测 定 3 5个 消 除 半 衰 期 后 生 物 样 品 中 的 药 物 浓 度准 确 度 在 80% 120%(或 RE在 20%的 范 围 内 )RSD 20% 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 六 、 稳 定 性 与 质 量 控

49、制稳 定 性 包 括 方 法 稳 定 性 和 样 品 稳 定 性方 法 稳 定 性 方 法 的 耐 用 性样 品 稳 定 性 生 物 样 品 的 存 放 条 件 和 时 间 、 冻 -融 循 环测 定 法 QC样 品 穿 插 于 实 际 样 品 测 定 全 过 程模 拟 (或 实 际 )生 物 样 品 及 其 预 处 理 后 的 待 测 溶 液 进 行 考 察要 求 准 确 度 85% 115%(RE在 15%范 围 内 )， RSD 15%第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 七 、 萃 取 回 收 率生 物 样 品 的 预 处

50、 理 方 法重 点 考 虑 方 法 准 确 度 (或 相 对 回 收 率 )， 操 作 简 便 、 快 速萃 取 回 收 率 (绝 对 回 收 率 ， absolute recovery)， 70%萃 取 回 收 率 与 相 对 回 收 率 的 意 义 不 同萃 取 回 收 率 考 察 生 物 样 品 预 处 理 过 程 造 成 的 药 物 的 程 度 损 失相 对 回 收 率 采 用 标 准 曲 线 可 准 确 计 算 生 物 样 品 中 药 物 浓 度第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 1. 测 定 法取 空 白 生 物 基

51、 质 (如 血 浆 )， 照 准 确 度 项 下 方 法 ， 制 备 高 、 中 、 低3个 浓 度 的 QC样 品 (每 一 浓 度 至 少 5个 样 品 )， 每 个 样 品 分 析 测 定 1次另 取 等 量 的 相 同 3个 浓 度 的 标 准 溶 液 ， 用 溶 解 模 拟 生 物 样 品 经 提取 处 理 后 的 残 渣 的 溶 剂 稀 释 至 同 体 积 ， 同 法 测 定A T经 萃 取 后 的 QC样 品 的 检 测 信 号 或 比 值 (内 标 法 )AS未 经 萃 取 的 标 准 溶 液 的 检 测 信 号 或 比 值 (内 标 法 )）（ %100 STAAR 第 四

52、章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 2. 限 度 要 求萃 取 回 收 率 一 般 应 50%高 、 中 浓 度 的 RSD应 15%低 浓 度 的 RSD应 20%。 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 第 四 节 体 内 药 物 分 析 方 法应 用 示 例第 三 代 喹 诺 酮 类 广 谱 抗 菌 药 盐 酸 环 丙 沙 星 片 人 体 生 物 等 效 性 研 究一 、 文 献 调 研性 质 在 水 中 溶 解 ， 在 甲 醇 中 微 溶 ， 在 乙 醇 中 极 微

53、 溶 解 ， 在 氯仿 中 几 乎 不 溶 ， 在 氢 氧 化 钠 试 液 中 易 溶 ； 环 丙 沙 星 游 离 体 在 水 中 不 溶 ， 在 乙 醇 、 二 氯 甲 烷 中 极 微 溶 解 ， 在 稀 醋 酸 中 溶 解 。 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证 NOFNN O OH , HCl, H2O 药 动 学 参 数吸 收 过 程 空 腹 口 服 后 吸 收 迅 速 、 人 体 生 物 利 用 度 约 为 49% 70% Cmax 口 服 500mg后 平 均 Cmax为 2.4 2.6mg/LTmax 1 2h T 1/2 血 中 T1/2约 为 4h， 肾 功

54、能 减 退 时 稍 有 延 长 至 6h蛋 白 结 合 率 20% 40%代 谢 口 服 给 药 24h内 ， 40% 50%原 形 、 15%代 谢 物 经 肾 排 出 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 体 内 分 析 方 法RP-HPLC色 谱 柱 ODS色 谱 柱流 动 相 甲 醇 (乙 腈 )-磷 酸 (枸 橼 酸 )缓 冲 液 (三 乙 胺 调 节 pH2.33.5)， 或 离 子 对 色 谱 : 溴 化 十 六 烷 基 三 甲 基 铵 (氢 氧 化 四 丁 基 铵 )检 测 紫 外 或 荧 光 检 测生 物 样 品

55、 预 处 理蛋 白 沉 淀 法 甲 醇 、 乙 腈 或 高 氯 酸 沉 淀 蛋 白 后 直 接 进 样溶 剂 萃 取 法 二 氯 甲 烷 -异 丙 醇 、 氯 仿 -异 丙 醇 混 合 溶 剂 蛋 白 沉 淀 -溶 剂 萃 取 乙 腈 沉 淀 蛋 白 后 二 氯 甲 烷 -异 丙 醇 提 取 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 二 、 分 析 方 法 设 计1 分 析 方 法血 浆 蛋 白 结 合 率 低 (20% 40%)、 以 原 形 从 肾 排 泄生 物 等 效 性 研 究 测 定 血 浆 中 环 丙 沙 星 原 形 药

56、物 的 浓 度 -时 间曲 线 。 初 步 拟 定 ： 采 用 RP-HPLC法2 检 测 方 法紫 外 灵 敏 度 1ng， 若 取 血 浆 0.5ml， 采 用 3倍 量 乙 腈 沉 淀 蛋白 ， 取 上 清 液 100l进 样 ， 则 要 求 血 浆 中 环 丙 沙 星 浓 度 在 50ng/ml以 上 ，当 C max在 2g/ml以 上 (口 服 500mg)时 基 本 可 满 足 生 物 等 效 性 研 究 要 求荧 光 灵 敏 度 0.1ng， 能 满 足 本 试 验 要 求 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 二

57、 、 分 析 方 法 设 计 （ 续 ）3 样 品 制 备 方 法初 步 拟 定 采 用 简 便 、 快 速 的 乙 腈 沉 淀 蛋 白 后 取 上 清 液 直 接 进样 分 析 预 试 含 75%乙 腈 的 提 取 液 100l进 样 后 ， 色 谱 峰 理 论 板 数 、对 称 性 下 降 (前 沿 峰 )， 进 而 导 致 检 测 灵 敏 度 降 低 (峰 高 降 低 )经 进 一 步 试 验 ， 确 定 为 ：血 浆 0.5ml乙 腈 1ml沉 淀 蛋 白 二 氯 甲 烷 -异 丙 醇 (95:5)5ml萃 取 60 氮 气 流 吹 干 流 动 相 200l溶 解 20l进 样 灵 敏

58、 度 可 达 2ng/ml(血 浆 浓 度 )， 符 合 要 求 (Cmax 2g/ml) 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 三 、 实 验 方 案1 给 药 方 案20名 受 试 者 随 机 分 为 两 组 ， 每 组 10人第 1次 试 验 第 一 组 口 服 受 试 制 剂 (相 当 于 环 丙 沙 星500mg)， 第 二 组 口 服 相 同 剂 量 的 参 比 制 剂第 2次 试 验 第 1次 服 药 后 第 7天 开 始 ， 两 组 交 换 给 药第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析

59、 方 法 的 验 证 与 要 求 三 、 实 验 方 案 （ 续 ）2 血 样 的 采 集 与 处 理分 别 口 服 给 药 前 和 给 药 后 0.25、 0.5、 1.0、 1.5(tmax)、 2.0、 3.0、4.0、 6.0、 8.0、 12.0和 24.0(57个 t1/2)小 时由 肘 正 中 静 脉 取 血 4 ml立 即 移 入 经 肝 素 处 理 的 离 心 试 管 中 ， 静 置 5分 钟 后 ， 离 心 15分 钟(3000rpm)， 分 离 血 浆 -20 冰 箱 中 保 存 待 测 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验

60、 证 与 要 求 三 、 实 验 方 案 （ 续 ）3 血 样 分 析 法色 谱 条 件高 效 液 相 色 谱 仪 (包 括 LC-10ATvp泵 ， RF-530荧 光 检 测 器 )；色 谱 柱 为 Kromasil ODS-AP(200mm 4.6 mm， 5m)流 动 相 为 乙 腈 -0.025mol/L磷 酸 溶 液 (86:14)， 流 速 1.0ml/min检 测 波 长 为 ex=277nm， em=445nm柱 温 为 40 。 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 三 、 实 验 方 案 （ 续 ）3 血 样

61、 分 析 法血 浆 样 品 的 预 处 理取 血 浆 0.5ml， 加 内 标 溶 液 (10g/ml诺 氟 沙 星 甲 醇 溶 液 ） 50 l、 乙腈 1.0ml， 涡 旋 混 合 30s， 离 心 5min， 取 上 清 液 1ml， 加 二 氯 甲 烷 -异 丙醇 (95:5)混 合 溶 剂 5ml， 涡 旋 振 荡 1min， 离 心 5min， 弃 去 上 层 水 相 ， 吸取 下 层 有 机 相 ， 60 下 氮 气 流 吹 干 ， 残 渣 加 流 动 相 200l， 涡 旋 溶 解30s， 离 心 5min， 取 上 清 液 20l进 样 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立

62、 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 四 、 分 析 方 法 验 证1 方 法 特 异 性环 丙 沙 星 峰 tR=12.4min， 诺 氟 沙 星 (内 标 物 质 )tR=10.9min， 各 峰 均获 得 完 全 分 离 ， 内 源 性 物 质 峰 (与 空 白 血 浆 样 品 一 致 )tR=8.6min对 测 定无 干 扰 志 愿 者 用 药 后 的 血 浆 样 品 色 谱 图 中 环 丙 沙 星 与 内 标 物 质 峰 与 模 拟血 浆 样 品 中 环 丙 沙 星 与 内 标 物 质 峰 的 t R、 T、 n和 R均 一 致 ， 峰 形 相 同 。故 不

63、 认 为 代 谢 物 有 干 扰 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 四 、 分 析 方 法 验 证 (续 )2 标 准 曲 线标 准 系 列 溶 液 取 盐 酸 环 丙 沙 星 ， 加 水 制 成 1、 2、 5、 10、 20和 50g/ml的 标 准 系 列 溶 液 ， 冰 箱 保 存标 准 系 列 模 拟 血 浆 样 品 取 空 白 血 浆 0.5ml， 加 环 丙 沙 星 标 准系 列 溶 液 各 50l， 配 制 成 相 当 于 浓 度 为 0.1， 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0 g/ml的 QC样

64、 品 ， 冰 冻 (-20 )测 定 法 取 QC样 品 ， 照 “ 血 浆 样 品 的 预 处 理 ” 项 下 方 法 操 作 ，以 环 丙 沙 星 浓 度 C为 横 坐 标 ， 环 丙 沙 星 与 内 标 物 质 的 峰 面 积 比 值 Y为 纵坐 标 ， 用 加 权 最 小 二 乘 法 经 Excel运 算 ， 求 得 的 直 线 回 归 方 程 为 ： Y=1.33C-0.02583， R2=0.9951(C=0.1 5.0 g/ml) 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 四 、 分 析 方 法 验 证 (续 )3 方

65、法 精 密 度 与 准 确 度QC样 品 浓 度 为 0.1、 0.5 和 2.0 g/ml分 析 批 次 3批 ， 每 批 5 样 品测 得 浓 度 0.0988、 0.4537 和 2.128 g/ml准 确 度 RE(%) -1.2%、 -9.3% 和 6.4%精 密 度 批 内 (%) 6.7%、 4.6% 和 3.9% 批 间 (%) 8.9%、 9.6% 和 12.3% 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 四 、 分 析 方 法 验 证 (续 )4 方 法 定 量 限受 试 制 剂 和 参 比 制 剂 的 Cmax分

66、 别 为3.2020.496和 3.3000.730 g/ml方 法 的 LOQ为 0.1 g/ml 0.16 g/ml (C max的 1/20)准 确 度 和 精 密 度 均 符 合 要 求 ： RE为 -1.2% 日 内 RSD为 6.7% 日 间 RSD为 8.9% 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求 四 、 分 析 方 法 验 证 (续 ) 第 四 章 分 析 方 法 的 建 立 与 验 证第 三 节 分 析 方 法 的 验 证 与 要 求血 浆 冰 冻 血 浆 冻 融 残 渣 冷 藏 室 温 放 置时 间 （ d） As/Ai 循 环（ 次 ） As/Ai 时 间（ d） As/Ai 时 间（ h） As/Ai0 2.7286 0 4.3595 0 2.9892 0 3.426310 2.9113 1 4.4902 1 2.9781 8 3.435020 2.7819 2 4.3139 2 3.0595 24 3.43515 样 品 稳 定 性 四 、 分 析 方 法 验 证 (续 )6 提 取 回 收 率取