小麦幼苗过氧化物酶

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1、小麦幼苗过氧化物酶同工酶的提取、分离 1、 掌 握 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 原 理 和 方 法 ；2、 掌 握 同 工 酶 的 概 念 ；3、 掌 握 实 验 试 剂 的 配 制 。一 、 实 验 目 的 ： 1、 同 工 酶 和 电 泳 概 念 ： 2、 影 响 电 泳 的 主 要 因 素 ： 3、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ PAGE） 4、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 结 构 上 的 特 点 ： 5、 凝 胶 的 质 量 决 定 因 素 ： 6、 不 连 续 PAGE的 原 理 ： （ 1） 三 个 不 连 续 性 的 表 现 ： (2) 不 连 续 系 统

2、中 的 三 种 物 理 效 应 ： （ 3） 浓 缩 效 应 产 生 的 原 因 ： 二 、 实 验 原 理 : 1、 同 工 酶 和 电 泳 概 念 ： （ 1） 同 工 酶 指 催 化 同 一 种 化 学 反 应 ， 但 其 酶 蛋 白 本 身的 分 子 结 构 组 成 却 有 所 不 同 的 一 组 酶 。 同 工 酶 与 生 物 的 遗 传 ， 生 长 发 育 ， 代 谢 调 节 及 抗 性 等都 有 一 定 的 关 系 ， 如 过 氧 化 物 酶 在 细 胞 代 谢 过 程 中 与 呼 吸作 用 ， 光 合 作 用 ， 及 生 长 素 的 氧 化 等 都 有 关 系 ， 测 定 PO

3、D活性 或 其 同 工 酶 ， 可 以 反 映 某 一 时 期 植 物 体 内 代 谢 变 化 。 （ 2） 电 泳 是 指 带 电 粒 子 在 电 场 中 向 与 其 自 身 所 带 电 荷相 反 的 电 极 方 向 移 动 的 现 象 。二 、 实 验 原 理 : 由有效迁移率mq/6r，则可推出：（1）带电颗粒的大小和形状： 颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；（2）颗粒的电荷数： 电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；（3） 溶液的粘度： 粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；（4）溶液的pH值： 影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电 泳速度越慢，反之越快； 2、 影 响 电 泳 的 主 要

4、 因 素 ： （ 5） 电 场 强 度 ： 电 场 强 度 越 小 ， 电 泳 速 度 越 慢 ， 反 之 越 快 ；（ 6） 离 子 强 度 ： 离 子 强 度 越 大 ， 电 泳 速 度 越 慢 ， 反 之 越 快 ；（ 7） 电 渗 现 象 ： 电 场 中 ， 液 体 相 对 于 固 体 支 持 物 的 相 对 移 动 ；（ 8） 支 持 物 筛 孔 大 小 ： 孔 径 小 ， 电 泳 速 度 慢 ， 反 之 则 快 。 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 是 以 聚 丙 烯 胺 凝 胶 作 为载 体 的 一 种 区 带 电 泳 。 这 种 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 单体 （ Ac

5、r） 和 交 联 剂 N， N -甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 （ Bis）在 催 化 剂 作 用 下 聚 合 而 成 的 ， Acr和 Bis在 具 有 自由 基 团 体 系 时 ， 就 会 聚 合 。 引 发 产 生 自 由 基 的 方 法 有 两 种 ： （ 1） 化 学 法 （ 2） 光 聚 合 法 。 3、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （ PAGE） （ 1） 化 学 聚 合 ： 引 发 剂 是 过 硫 酸 铵 (AP)， 催 化 剂 N、 N、 N 、 N 四 甲 基 乙 二 胺 （ TEMED） ， 它 的 碱 基 催 化 AP产 生 自 由硫 酸 基 ， 其 氧 原 子

6、激 活 丙 烯 酰 胺 单 体 形 成 单 体 长 链 。 化学 聚 合 形 成 的 凝 胶 孔 径 较 小 ， 且 重 复 性 好 ， 用 来 制 备 分离 胶 ；（ 2） 光 聚 合 ： 光 聚 合 法 的 催 化 剂 是 核 黄 素 （ V B2） ， 光 聚 合 形 成的 凝 胶 孔 径 较 大 ， 且 不 稳 定 ， 适 于 制 备 大 孔 径 的 浓 缩 胶 。 聚 合 反 应 ：架橋物造成分枝端点自由基 可再延续freeradicalBis Bis聚合反应交错连结 自由基形成 （ 1） 聚 丙 烯 酰 胺 的 基 本 结 构 为 丙 烯 酰 胺 单 体 构 成 的 长 链 ， 链

7、 与 链 之 间 通 过 甲 叉 桥 联 结 在 一 起 ； （ 2） 链 的 纵 横 交 错 形 成 三 维 网 状 结 构 ， 使 凝 胶 具 有 分 子 筛 的 性 质 ；（ 3） 网 状 结 构 还 能 限 制 蛋 白 质 等 样 品 的 扩 散 运 动 ， 使 凝 胶 具 有 抗 对 流 的 作 用 ；（ 4） 长 链 富 含 酰 胺 基 团 ， 使 其 成 为 稳 定 的 亲 水 凝 胶 ；（ 5） 该 结 构 不 带 电 荷 ， 在 电 场 中 电 渗 现 象 极 为 微 小 。 4、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 结 构 上 的 特 点 ： （ 1） 凝 胶 度 ： 是 指 10

8、0mg凝 胶 溶 液 中 含 有 单 体 （ Acr） 和 交 联 剂 （ Bis） 的 总 克 数 ， 用 T%表 示 。（ 2） 交 联 度 ： 是 指 凝 胶 溶 液 中 ， 交 联 剂 （ Bis） 占 单 体 （ Acr）和 交 联 剂 （ Bis） 总 量 的 百 分 数 ， 用 C%表 示 。 一 般 浓 缩 胶 的 浓 度 为 7.5%， 分 离 胶 的 浓 度 为 10%。 5、 凝 胶 的 质 量 决 定 因 素 ： （ 1） 三 个 不 连 续 性 的 表 现 ： 凝 胶 由 上 下 两 层 组 成 ， 两 层 凝 胶 的 孔 径 不 同 ； 缓 冲 液 离 子 组 成

9、及 各 层 凝 胶 的 pH不 同 ； 在 电 场 中 形 成 不 连 续 的 电 位 梯 度 。 6、 不 连 续 PAGE的 原 理 ： 不 连 续 PAGE电 泳 胶 体 系 统 的 组 成 ：1 电 泳 系 统 pH 胶 体 浓 度缓 冲 液上层 (负极 )缓冲液2 样 本 溶 液 3 浓 缩 胶 6.7 4 分 离 胶 5 下 层 (正 极 )缓冲液 Tris-H ClTris-H ClTris-glycine Tris-H ClTris-glycine 8.3 8.0 8.9 8.3 5% 7% - - - (2) 不 连 续 系 统 中 的 三 种 物 理 效 应 ： 电 荷 效

10、 应 ： 酶 蛋 白 按 其 所 带 电 荷 的 种 类 及 数 量 ， 在 电 场 作 用 下向 一 定 的 电 极 以 一 定 的 速 度 泳 动 。 分 子 筛 效 应 : 相 对 分 子 质 量 或 构 型 不 同 的 蛋 白 质 通 过 一 定 孔 径 的分 离 胶 时 ， 所 受 摩 擦 不 同 ， 受 阻 程 度 不 同 ， 表 现 出 不 同的 迁 移 率 。 浓 缩 效 应 :使 待 分 离 样 品 中 的 各 组 分 在 浓 缩 胶 中 被 压 缩成 层 。 浓 缩 效 应 产 生 的 原 因 ：（ 1） 两 层 胶 的 孔 径 不 同 :酶 蛋 白 向 下 移 动 到 两

11、 层 凝 胶 界 面 时 ， 阻 力突 然 加 大 ， 速 度 变 慢 。 这 样 ， 就 在 两 层 凝 胶 交 界 处 使 待 分 离 的 酶蛋 白 区 带 变 窄 ， 浓 度 升 高 。（ 2） 浓 缩 胶 中 产 生 不 连 续 的 电 位 梯 度 :在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 用 的 都是 Tris-HCl缓 冲 液 ， 但 上 层 浓 缩 胶 的 pH为 6.7， 下 层 分 离 胶 的 pH为 8.9。 HCl为 强 电 解 质 ， 不 管 在 哪 层 胶 中 几 乎 全 部 电 离 ， Cl布 满整 个 胶 ,待 分 离 的 酶 蛋 白 加 在 点 样 孔 ， 浸 在

12、pH8.3Tris-甘 氨 酸 缓冲 液 中 。 电 泳 一 开 始 ， 有 效 泳 动 率 最 大 的 Cl迅 速 跑 到 最 前 面 ， 成为 快 离 子 ， 在 pH为 6.7条 件 下 解 离 度 仅 有 0.1 1 的 甘 氨 酸 有 效泳 动 率 最 低 ， 跑 到 最 后 面 ， 成 为 慢 离 子 ， 这 样 在 ， 快 慢 离 子 之 间就 形 成 一 个 不 断 移 动 的 界 面 。 在 pH为 6.7条 件 下 带 有 负 电 荷 的 酶蛋 白 ， 其 有 效 泳 动 率 介 于 快 慢 离 子 之 间 ， 被 夹 持 分 布 在 界 面 附 近 ，逐 渐 形 成 一

13、个 区 带 。 在 浓 缩 胶 中 的 三 个 主 要 作 用 角 色 ：甘氨酸: pH=8.9 负电荷 pI=5.96不带电荷Cl-1:蛋白质(酶):小分子大分子 浓 缩 效 应 ：分离胶浓缩胶样本 8.96.7 离 子 缺 乏 空 间A B C+ +8.0 V=I/S 1、 实 验 材 料 ： 小 麦 幼 苗2、 仪 器 、 器 皿 ： (1)垂 直 板 电 泳 装 置 （ 电 泳 槽 ， 玻 璃 板 ， 胶 条 ， 电 泳 梳 子 ， 制 胶 架 等 ） ； (2)稳 流 稳 压 电 泳 仪 ； （ 3） 高 速 冷 冻 离 心 机 ； （ 4） 电 子 天 平 ； （ 5） 电 冰 箱

14、 ； （ 6） 瓷 盘 、 微 量 进 样 器 ；三 、 实 验 材 料 、 仪 器 和 试 剂 ： 3、 试 剂 ： （ 1） 1N HCl： 用 12N的 浓 盐 酸 来 配 制 ； （ 2） 分 离 胶 缓 冲 液 （ pH8.9的 Tris-HCl缓 冲 液 ） ： （ 3） 浓 缩 胶 缓 冲 液 （ pH6.7 Tris-HCl缓 冲 液 ） ： （ 4） 分 离 胶 丙 胶 贮 液 （ Acr-Bis贮 液 ） ： （ 5） 浓 缩 胶 丙 胶 贮 液 （ Acr-Bis贮 液 ） ： （ 6） 过 硫 酸 铵 溶 液 （ NH4） 2S2O8简 写 Ap： （ 当 天 配 制

15、） ； （ 7） 核 黄 素 溶 液 ： （ 8） 电 极 缓 冲 液 ： （ pH8.3Tris-甘 氨 酸 缓 冲 液 ） （ 9） 40%蔗 糖 ： （ 10） pH4.7乙 酸 缓 冲 液 ： （ 11） 样 品 提 取 液 ： （ 12） 0.5%的 溴 酚 蓝 ： 0.5g溶 于 100ml无 离 子 水 ； （ 13） 过 氧 化 物 酶 同 工 酶 联 苯 胺 染 色 液 ： 1g联 苯 胺 加 9ml冰 醋 酸 ， 溶 解 后 加 36ml水 用 时 加160ml水 ,加 Vc140.8mg,加 几 滴 30%过 氧 化 氢 原 液 。 联苯 胺 是 致 癌 物 质 ， 称

16、取 时 应 戴 手 套 ； 1、 贮 液 的 配 制 ： 2、 凝 胶 的 制 备 ： 2.1 胶 板 的 制 备 ： 2.2 分 离 胶 的 制 备 ： 2.3 浓 缩 胶 的 制 备 ： 3、 酶 液 的 制 备 ： 4、 装 槽 、 点 样 ： 5、 电 泳 ： 6、 剥 胶 、 固 定 、 染 色 ： 四 、 实 验 步 骤 ： 2.1 胶 板 的 制 备 ： 2.2 分 离 胶 的 制 备 ： 按 下 表 制 备 分 离 胶试 剂 名 称 分 离 胶 缓冲 液 分 离 胶 丙胶 贮 液 Ap 无 离 子 水体 积 比 1 2 4 1取 用 量（ ml） 3 6 12 3 胶 灌 至

17、距 梳 子 齿 下 端 1cm 灌 毕 封 上 一 层 水加 速 聚 合 当 胶 与 水 出 现 清 晰 界 限 时 表 明 聚 合 好 。 2.3 浓 缩 胶 的 制 备 ： 按 下 表 制 备 浓 缩 胶 试 剂 名 称 浓 缩 胶 缓冲 液 浓 缩 胶 丙 胶贮 液 VB2 蔗 糖体 积 比 1 2 1 4取 用 量 1 2 1 4 用 滤 纸 吸 干 水 倒 入 浓 缩 胶 插 入 梳 子 封 水 ，照 光 当 胶 色 由 无 色 变 为 乳 白 色 表 明 聚 合 好 。 3、 酶 液 的 制 备 ： 称 取 小 麦 幼 苗 茎 部 . g 加 样 品 提 取 液1ml 于 冰 浴

18、中 研 成 匀 浆 然 后 以 2ml提 取 液 分 几次 洗 入 离 心 管 在 高 速 离 心 机 上 以 10000r/min， 离心 10min 倒 出 上 清 液 ， 以 5： 1与 溴 酚 兰 指 示 剂 混合 低 温 放 置 待 用 。 4.1 装 槽 ： 取 出 胶 板 下 端 胶 条 用 滤 纸 搽 净 凡 士林 油 将 胶 板 固 定 在 电 泳 槽 上 （ 凹 板 一 侧向 内 ） 上 下 槽 装 电 极 缓 冲 液 。 4.2 点 样 ： 轻 拔 电 泳 梳 子 用 微 量 进 样 器 点 样 每 孔 约 30 l。 5、 电 泳 ： 接 通 电 源 稳 流 调 节 电

19、 流 到 每 孔1mA左 右 当 溴 酚 蓝 前 沿 进 入 分 离 胶 后 ，可 适 当 加 大 电 流 待 前 沿 下 行 到 距 胶 末1cm处 ， 停 止 电 泳 。 6、 剥 胶 、 固 定 、 染 色 ： 将 凝 胶 板 取 下 放 入 装 水 瓷 盘 中 剥下 胶 片 并 浸 洗 二 次 倒 去 水 加 入 固 定液 10分 钟 倒 去 固 定 液 加 显 色 液 （ 联 苯胺 ） ， 显 色 观 察 记 录 。 1、 绘 制 酶 谱 ； 五 、 结 果 与 计 算 ： 六 、 思 考 题 ：1、影响电泳的主要因素有哪些？ 2、 浓 缩 效 应 产 生 的 原 因 ？3、 简 答 不 连 续 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 中 的 三 个 不 连 续 ， 及 三 种 物 理 效 应 。