酶组织化学刘学光ppt课件

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1、酶组织化学刘 学 光复 旦 大 学 基 础 医 学 院 病 理 学 系 酶 是 生 物 体 内 具 有 催 化 作 用 的 特 殊 蛋 白 质 一 般 催 化 剂 的 共 性 ： 1. 用 量 少 而 催 化 效 率 高 2. 不 改 变 化 学 反 应 的 平 衡 点 3. 可 降 低 反 应 的 活 化 能 作 为 生 物 催 化 剂 的 特 性 ： 1. 催 化 效 率 高 ： 比 其 他 催 化 反 应 高 10 7-1013倍 2. 高 度 专 一 性 3. 易 失 活 4. 酶 活 力 受 调 节 控 制 5. 酶 的 催 化 活 力 与 辅 酶 、 辅 基 及 金 属 离 子 有

2、 关 酶 的 分 类 、 命 名1.习 惯 命 名 法 ： 底 物 ， 所 催 化 的 反 应 性 质 ， 来 源 ， 其 他 特 点2.国 际 系 统 命 名 法 ： 酶 的 底 物 + 催 化 反 应 的 性 质3.主 要 分 类 ： 催 化 反 应 的 性 质 ， 六 个 大 类（ 1） 氧 化 还 原 酶 :氧 化 还 原 反 应（ 2） 移 换 酶 ： 功 能 基 团 的 转 移 反 应（ 3） 水 解 酶 ： 水 解 反 应（ 4） 裂 合 酶 ： 从 底 物 上 移 去 一 个 基 团 而 形 成 双 键 ， 或 其 逆 反 应（ 5） 异 构 酶 ： 同 分 异 构 体 的 相

3、 互 转 变（ 6） 合 成 酶 ： 连 接 酶 催 化 一 切 必 须 与 ATP分 解 相 偶 联 且 由 两 种 物 质 （ 双 分 子 ） 合 成 一 种 物 质 的 反 应 酶组织化学( Enzyme Histochemistry) 通 过 细 胞 内 固 有 的 酶 催 化 底 物 的 作 用 ， 并 借 助 显 色 反 应 ，在 切 片 或 涂 片 上 显 示 组 织 或 细 胞 中 内 源 性 酶 的 活 性 及 定 位 。 特 点 （ 1） 原 位 检 测 ： 组 织 定 位 （ 2） 显 示 酶 活 性 发 展 历 史l Klebs(1868)年 & Struve(1872

4、)证 明 中 性 多 核 白 细 胞 过 氧 化 酶 存 在l1939年 前 ， 研 究 细 胞 内 的 氧 化 反 应1939年 ， Takamatsu、 Gomori 碱 性 磷 酸 酶 （ 硫 化 钴 反 应 、 银 反 应 ） 随 后 ： 磷 酰 胺 酶 、 ATP酶 、 脂 酶 、 酯 酶 等 金 属 盐 法 ， 硫 化 钴 法 ， 偶 氮 色 素 法 ， 偶 氮 色 素 四 唑 盐 法 ， 磷 酸 化酶 组 织 化 学 证 明 法 l 电 镜 酶 组 织 化 学 ： 酶 更 精 准 的 定 位 1955年 Scheldon、 Brandes 金 属 沉 淀 法 1967年 Seli

5、gman 锇 黑 化 法l 免 疫 组 织 化 学 ： 抗 原 抗 体 反 应 +酶 反 应 1970年 Sternberger 酶 标 抗 体 法 基础知识（ 一 ） 细 胞 内 的 酶 的 特 性 * 水 溶 性 ， 易 扩 散 ， 难 溶 或 不 溶 于 有 机 溶 剂 * 有 机 溶 剂 不 同 程 度 降 低 酶 的 活 性 * 易 受 温 度 影 响 ， 对 热 耐 受 性 弱 * 对 干 燥 耐 受 性 强 （ 二 ） 酶 的 定 位 在 细 胞 内 或 超 微 结 构 中 存 在 于 特 定 部 位 浆 膜 5-核 苷 酸 酶 细 胞 膜 ATPase 线 粒 体 1. 酶 促

6、 反 应 细 胞 内 的 酶 催 化 分 解 合 适 的 底 物 ， 生 成 中 间 产物 ， 即 ： 初 反 应 物 (primary reaction product, PRP)。2. 显 色 反 应 其 中 之 一 再 与 辅 助 物 经 一 步 或 二 步 反 应 ， 生 成有 色 不 溶 水 的 终 反 应 物 (final reaction product, FRP) 沉 积在 原 位 以 显 示 酶 的 存 在 和 活 性 大 小 。酶组织化学的基本原理 Artifact PRP弥 散 定 位 不 准 确 受 3个 因 素 影 响 ： 1. 底 物 在 酶 催 化 下 水 解 的

7、 速 度 快 2. PRP在 缓 冲 液 中 的 弥 散 系 数 小 3. PRP与 辅 助 物 反 应 的 速 度 快 辅 助 物 浓 度 一 般 1 mg/ml 一般原则 最 大 限 度 保 存 酶 活 性 、 防 止 弥 散 、 保 证 反 应 产 物 的 特 异 性 1. 标 本 处 理 及 制 片 不 能 影 响 酶 活 性 和 分 布 2. 底 物 对 酶 有 特 异 性 ： 酶 抑 制 剂 /激 动 剂 检 测 特 异 性 3. 底 物 和 辅 助 试 剂 渗 透 好 ： 迅 速 ， 同 步 4. 辅 助 试 剂 不 能 影 响 酶 活 性 和 其 它 反 应 剂 的 渗 透 5

8、. PRP与 辅 助 试 剂 反 应 要 快 FRP必 需 是 水 不 溶 、 有 色 且 稳 定 的 物 质 6. 所 有 试 剂 不 能 与 组 织 细 胞 有 非 特 异 性 的 吸 附 主要步骤1.组 织 处 理 ： 不 固 定 （ 冷 冻 切 片 ， 新 鲜 ） 固 定 （ 特 殊 固 定 剂 ， 低 温 包 埋 ）2.孵 育3.显 色4.显 微 镜 下 观 察各 步 骤 需 要 注 意 的 问 题 ： 1. 组 织 处 理 ： “ 最 大 限 度 保 存 酶 活 性 ” 最 常 用 ： 新 鲜 组 织 ， 快 速 冷 冻 ， 冰 冻 切 片 长 期 保 存 需 密 封 ， -70

9、丙 酮 固 定 ， 低 温 脱 水 、 包 埋 （ eg. -谷 氨 酰 转 肽 酶 ） 常 规 方 法 （ 极 少 数 酶 类 ： 氯 乙 酸 酯 酶 ） 染 色 前 的 预 固 定 保 持 组 织 良 好 形 态 丙 酮 :氯 仿 =1 : 1 4 oC， 510 分 钟 多 聚 甲 醛 ， 甲 醛 ， 戊 二 醛 Note: 含 有 抑 制 酶 活 性 /细 胞 化 学 成 分 活 性 的 重 金 属 盐 Hg/Cr/Pb等 不 用 做 固 定 剂 固 定 方 法 ： 浸 泡 固 定 灌 流 固 定 细 胞 涂 片 、 培 养 细 胞 : 干 燥 、 密 封 、 低 温 2.切 片 制

10、作 : 一 般 8 12 m 3.缓 冲 液 ： 用 于 配 置 固 定 液 ， 漂 洗 液 ， 酶 反 应 孵 育 液 配 制 酶 反 应 孵 育 液 （ 1） 清 洗 器 皿 ， 过 酸 冲 洗 （ 2） 现 用 现 配 ， 保 持 新 鲜 （ 3) 严 格 配 比 ， 保 持 平 和 （ 4） 防 止 污 染 过 滤 为 佳 （ 5） 优 选 试 剂 ， 注 意 纯 度 4. 孵 育 反 应 a. 温 度 及 时 间 ： 37oC， 15-30min b. 孵 育 反 应 ： 切 片 孵 育 ； 漂 浮 孵 育 5. 酶 显 示 方 法 （ 1） 同 步 显 示 法 （ 2） 二 步 显

11、 示 法 （ 孵 育 后 偶 联 法 ） （ 3） 底 物 自 身 显 示 法 6. 酶特异性对照实验 用 酶 活 性 抑 制 剂 激 活 剂 采 用 无 底 物 的 孵 育 液 过 固 定 或 加 热 改 变 孵 育 液 选 择 PH值 细 胞 内 的 定 位 差 异 对结果分析要考虑的问题 经 冷 冻 和 原 位 固 定 后 ， 酶 究 竟 能 保 存 多 少 ? 酶 是 否 在 原 位 ? 反 应 酶 起 了 多 少 作 用 ？ 酶 的 活 性 是 否 代 表 了 细 胞 生 活 时 的 状 态 ? 沉 淀 的 产 物 是 否 代 表 酶 本 身 ， 时 间 延 长 是 否 会 有 改变

12、 ， 有 没 有 扩 散 移 位 ？ 常用酶显示方法 （ 1） 同 步 显 示 法 ： PRP + 辅 助 物 有 色 FRP 某 些 金 属 本 身 或 化 合 物 生 成 颜 色 （ eg.金 属 离 子 沉 淀 反 应 ） 硫 化 钴 （ 黑 色 ） 硫 化 铅 （ 棕 黑 色 ） （ 2） 二 步 显 示 法 （ 孵 育 后 偶 联 法 ） 酶 与 底 物 作 用 产 生 的 PRP沉 积 于 原 位 ， 随 后 行 显 色 反 应 适 用 于 ： PH反 应 差 别 大 ； 底 物 /辅 助 物 易 分 解 局 限 ： 要 求 PRP弥 散 度 低 （ 3） 底 物 自 身 显 示

13、法 可 溶 有 色 底 物 不 溶 有 色 底 物 底 物 分 子 重 组 (1) 金 属 离 子 沉 积 法 酸 性 磷 酸 酶 Gomori反 应 （ 1941年 ） 以 beta-甘 油 磷 酸 钠 为 底 物 ， 在 酸 性 PH值 (4.4-5.5)下 ， 被酸 性 磷 酸 酶 （ ACP） 水 解 ， 释 放 出 磷 酸 盐 。 遇 铅 离 子 （ 硝 酸铅 /醋 酸 铅 ） 生 成 磷 酸 铅 (PRP)， 再 被 S2-置 换 ， 最 终 生 成 硫 化铅 棕 黑 色 沉 淀 。 酶 促 反 应 R-PO4Na2+H20 R-OH +Pb3(PO4) 2 显 色 反 应 Pb

14、3(PO4)2 + 3 S2- 3PbS （ 棕 黑 色 沉 淀 ） 该 方 法 金 属 离 子 容 易 反 应 ， 沉 着 颗 粒 微 细 ， 反 应 色 调 美丽 ， 反 差 明 显 。 ACPPb 2+ 激 活 剂 ： Mn2+ 抑 制 剂 ： NaF定 位 ： 溶 酶 体 ， ER， 胞 浆该 酶 活 性 比 较 高 的 器 官 ： 肝 、 肾 、 肠 、 脾 、 肾 上 腺注 意 事 项 : 铅 离 子 浓 度 是 关 键 ： 非 特 异 性 吸 附 ， NaF处 理 排 除 假 阳 性 孵 育 时 间 不 宜 过 长 ： 弥 散 ， 核 非 特 异 着 色 铅 法 适 用 于 :

15、ACP； 5-核 苷 酸 酶 ； G6P酶 ； 膜 ATPase； 线 粒 体 ATPase； TTPase(硫 氨 酸 焦 磷 酸 酶 ） （ 2） 偶 氮 盐 偶 联 反 应 人 工 合 成 的 酶 底 物 在 酶 的 作 用 下 产 生 PRP， 后 者 与 重 氮 盐结 合 ， 引 起 偶 联 偶 氮 反 应 ， 使 其 生 成 不 溶 性 的 偶 氮 色 素 碱 性 磷 酸 酶 a-萘 基 磷 酸 钠 磷 酸 氢 二 钠 + a -萘 酚 -萘 酚 + Fast Blue 偶 氮 染 料 （ 蓝 色 沉 淀 ） 酯 酶 、 转 肽 酶 、 肽 酶酶 +水 重 氮 盐 种 类 不 同

16、， 其 偶 氮 颜 色 多 样 （ 蓝 色 ， 紫 色 ， 红 色 ，褐 色 等 ） 常 用 重 氮 盐 : 坚 牢 兰 RR 坚 牢 兰 B 坚 牢 兰 RC 坚 牢 兰 TR 坚牢 兰 B 六 偶 氮 副 品 红 六 偶 氮 新 品 红 常 用 底 物 ： 萘 酚 AS-B1 萘 酚 AS-D 萘 酚 AS-MX 萘 酚 AS-TR 应 用 ： ALPase, ACPase 酯 酶 ， 转 肽 酶 ， 肽 酶 ， beta-葡 糖苷 酶 方 法 ： 同 时 偶 联 法 后 偶 联 法 ： 防 止 重 氮 盐 对 酶 的 抑 制 作 用 (3) 四 唑 反 应 底 物 氢 离 子 与 无 色

17、 四 唑 盐 结 合常 用 四 唑 盐 种 类 : 三 苯 四 唑 氯 化 物 TTC 蓝 四 唑 盐 BT 新 四 唑 盐 NT 硝 基 兰 四 唑 盐 (nitroblue tetrazolium, NBT) 四 硝 基 兰 四 唑 TNBT 噻 唑 兰 (3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL) 2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)红 色 / 蓝 色 沉 淀 脱 氢 酶 /氧 化 酶 被 还 原 单 胺 氧 化 酶 和 几 乎 所 有 的 脱 氢 酶 都 可 以 用 四 唑 反应 显 示 例 ： 四 唑 盐 法 显 示 琥 珀 酸

18、脱 氢 酶 以 琥 珀 酸 （ 钠 盐 ） 为 底 物 ， 在 酶 的 作 用 下 脱 氢 ， 人 工合 成 的 硝 基 蓝 四 唑 （ NBT） 为 受 氢 体 ， 还 原 为 紫 色 不 溶 物以 代 表 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 活 性 琥 珀 酸 脱 氢 酶 是 线 粒 体 的 标 记 酶 之 一 ， 存 在 于 所 有 有氧 呼 吸 的 细 胞 ， 以 心 肌 、 肾 曲 管 上 皮 、 肝 细 胞 含 量 最 丰 富 (4) 联 苯 胺 色 素 法过 氧 化 物 酶 （ 联 苯 胺 法 ） NH2NH 2 酶 + H2O2 NHNH 棕 色 沉 淀2H联 苯 胺 联 苯 胺 蓝

19、过 氧 化 物 酶 催 化 各 种 物 质 被 过 氧 化 氢 所 氧 化 见 于 乳 腺 、 甲 状 腺 、 唾 液 腺 、 肥 大 细 胞 等 髓 过 氧 化 物 酶 见 于 中 性 /嗜 酸 性 白 细 胞 及 其 前 体 细胞 ， 对 造 血 系 统 疾 病 的 鉴 别 诊 断 极 为 重 要 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） 作 为 大 分 子 示 踪 剂 DAB 3-二 氨 基 联 苯 胺 (5) 靛 蓝 反 应 底 物 被 酶 分 解 为 二 个 PRP， 其 中 之 一 可 在 一 定 条 件 下 形成 不 溶 的 靛 蓝 酯 酶 吲 哚 酚 酯 吲 哚 酚 + RCO

20、OH 2 吲 哚 酚 靛 蓝 胆 硷 酯 酶 、 磷 酸 酶 、 糖 苷 酶 、 非 特 异 酯 酶 酶 + 水氧 化 酶组织化学的应用 了 解 组 织 、 细 胞 的 代 谢 活 动 细 胞 类 型 的 判 断 了 解 细 胞 定 位 用 于 肿 瘤 的 研 究 用 于 免 疫 组 化 和 杂 交 组 化 的 显 示 手 段 （ 1） 观 察 组 织 细 胞 代 谢心 肌 梗 死 2小 时 琥 珀 酸 脱 氢 酶 细 胞 色 素 氧 化 酶 HE无 改 变 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 磷 酸 化 酶 Reyes Syndrome 又 称 脑 病 脂 肪 肝 综 合 征 ， 是 一 种 急 性

21、 脑 病 和 肝 脏 脂肪 浸 润 综 合 征 ,常 常 发 生 于 某 些 急 性 病 毒 性 传 染 病 以 后 ，多 见 于 儿 童 ， 临 床 表 现 为 ： 急 性 致 死 性 脑 病 、 脂 肪 肝 、肝 功 能 衰 竭 ， 高 血 氨 肝 细 胞 琥 珀 酸 脱 氢 酶 活 性 下 降 （ 2） 细 胞 类 型 / 细 胞 定 位 氯 乙 酸 酯 酶 中 性 粒 细 胞 （ 被 抗 CD66C, CD66D, CD88抗 体 的 免 疫 组 化 代 替 ） 非 特 异 性 酯 酶 Mf （ 被 抗 CD64、 CD68抗 体 的 免 疫 组 化 代 替 ） 乙 酰 胆 硷 酯 酶

22、 小 肠 神 经 节 细 胞 ATP酶 皮 肤 郎 罕 氏 细 胞 （ 3） 癌 前 病 变 的 标 志 以 肝 癌 发 生 为 例 早 期 ， HE无 明 显 变 化 ， 但 酶 组 织 化 学 观 察 到 糖 代 谢 紊 乱 肝 细 胞 癌增 生 结 节 GGTAFPG6P小 肝 细 胞过 渡 细 胞卵 圆 细 胞肝 细 胞 嗜 碱嗜 酸 （ 4） 免 疫 组 化 和 杂 交 组 化 的 显 示 方 法 与 酶 组 化 的 不 同 ， 在 于 是 检 测 引 入 酶 免 疫 组 化 常 用 HRP（ DAB + H2O2） 杂 交 组 化 常 用 AP （ BCIP + NBT ） 掌握内容 酶 组 织 化 学 的 基 本 原 理 光 镜 酶 组 织 化 学 的 基 本 方 法 几 种 重 要 的 酶 组 织 化 学 方 法 Thanks for your attentions!