酵母三杂交筛选结题报告模板

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1、实 验报 告酵母三杂交筛选簧瑞源生物/II RUIYUAN BIOTECHNOLOGY酵母三杂交筛选pBridge-X-Y的相互作用蛋白实验结题报告目的：发现与pBridge-X-Y相互作用的蛋白。方法:以构建到pBridge载体上的X （MCSII位点）、Y （MCSI位点）基因为诱饵，筛选酵 母三杂交某物种文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分 析，确定与pGBKT7-X-Y相互作用的蛋白。材料:1. 诱饵克隆：pBridge-X-Y2 诱饵载体：pBridge3. 文库酵母质粒：pGADT7-某物种cDNA4. Clontech酵母三杂交系统5. 培养基:1

2、）.酵母完全培养基：YPDA： 1% Yeast extract 2% Tryptone, 2% Glucose, 0.02% Adenine。2）.酵母缺陷型筛选培养基：参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：SD-T： -trp；SD-L： -leu；SD-TL： -trp, -leu；SD-TH： -trp, -his；茅瑞輝生物/II RUIYUAN BIOTECHNOLOGYSD-TLH： -trp, -leu, -his；SD-THA： -trp, -his, -ade；SD-TLHM： -tr

3、p, -leu, -his, -met。3) .其他贮备液：10 x TE： 0.1 M Tris-HCl (pH7.5), 10 mM EDTA,高压灭菌;10 x LiAc： 1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌；第一部分将质粒转化受体菌Y2HGold中及其自激活检测11酵母转化将以下质粒分别转入Y2HGold酵母中：ReactionpBridge plasmid涂板种类备注1pBridge-X-YSD-T自激活检测2pBridge-YSD-T阴性对照1.2酵母转化方法1.从YPDA平板挑取Y2HGold单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml, 30C, 225 rpm，振 荡培养

4、18-20 h （过夜），至 OD6001.5。2转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml,使初始OD600=0.2, 30C, 225 rpm,振荡培 养 4-5 h,至 OD600=0.6-0.8。3.离心收菌，室温，4000 rpm, 5 min。4用 20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm, 5 min,弃上清。5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm, 5 min,弃上清。6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul （每个转化）， 备用。7. 每个1.5

5、 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，剧烈振荡1 min左右，至完全 混匀。懐瑞师生物/IIRUJYUAN BJOTECHNQLOSY50%PEG335O1 M LiAcssDNA (20 mg/ml)质粒DNA240 ul36 ul5 ul各5 ul8. 30C水浴孵育，30 min。9. 42C水浴热激，25 min。10.30C水浴复苏，30 min。11. 离心收菌，室温，4000 rpm, 5 min,弃上清。12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。13.30C恒温培养4天。1.3自激活检测随机挑取8个点用pBridge的载体

6、引物进行PCR验证，全部为正确克隆，随机取了三 个克隆点板至 SD-T、SD-TH、SD-THA、SD-THA+X-a-gal 板上,30 C培养 3-5d。其中 pBridge-Y 为阴性对照。实验组对照组SD-TSD-THSD-THASD-THA+X-aal图1自激活检测结果从图中可得，对照菌株pBridge-Y能在SD-T、SD-TH平板上生长，在SD-THA、SD-THA+X-a-gal平板上均不能正常生长。实验组pBridge-X-Y在SD-T、SD-TH平板上生长，在 SD-THA、SD-THA+X-a-gal 无生长现象。结论：pBridge-X-Y有轻微自激活现象。1.4 3A

7、T浓度抑制pBridge-X-Y自激活情况将上述pBridge-X-Y、pBridge-Y克隆分别用2 ml无菌ddH2O重悬，进行点板于SD-TH、SD-TH+10 mM 3AT、SD-TH+20 mM 3AT、SD-TH+30 mM 3AT、SD-TH+40 mM 3AT、SD-TH+50 mM 3AT、SD-TH+75 mM 3AT 的缺陷型平板中。具体情况如下：莽瑞涮生物/II RUrVUAN BIOTECHNOLOGYSJhil$ 卜 m-WinMdlT Sd-THtZZEXT WC.II： MnN.l.ll $ 111 4U iwM 和 I rli| 利mM 3 I iD-Jn-?

8、 mW SaI实验组对照组图2.加3AT抑制结果从图中可知pBridge-X-Y、pBridge-Y在3AT抑制浓度为10mM时，没有自激活现象。结论：选用10mM3AT作为后续筛库浓度。第二部分文库筛选用含有pBridge-X-Y诱饵质粒的Y2HGold酵母菌株作为受体菌制备感受态，将文库质 粒 pGADT7-某物种 cDNA 转入其中，涂 SD-TLH，SD-TLH+10mM3AT, SD-TLHM， SD-TLHM+10mM3AT 筛选平板。21文库DNA转化方法：1. 从SD-T平板挑取单菌种接于液体SD-T培养基50 ml，30C, 225 rpm，振荡培养24 h。2. 转接于YP

9、DA液体500 ml，使初始OD600=0.2,30C,225 rpm，振荡培养4-5 h,至OD600=0.6。3. 离心收菌，室温，4000 rpm， 5 min。4. 用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm， 5 min,弃上清。5. 用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm, 5 min,弃上清。6. 用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm , 5 min,弃上清。7. 向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。50%PEG335O1 M

10、 LiAcssDNA (10 mg/ml)文库质粒DNA9.6 ml1.44 ml300 ul25 ug8. 30C水浴孵育，30 min。9. 42C水浴热激，25 min。10. 30 C水浴复苏1 ho 11.离心收菌，室温，4000 rpm , 5 min,弃上清，用6 ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH,SD-TLH+10mM3AT, SD-TLHM, SD-TLHM+10mM3AT平板各 5 块。弊瑞簿生物/ II RUIYUAN BIOTECIHNQLO6Y12. 30C恒温培养3-7天，观察

11、菌落生长。13.挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH+10mM3AT和SD-TLHM+10mM3AT筛选平板中继续培养3-5天。21筛库结果在 SD-TLH，SD-TLH+10mM3AT, SD-TLHM，SD-TLHM+10mM3AT 筛选平板中筛选获得阳性酵母克隆。结果如下图所示:SD-TLH+10mM3ATSD-TLHM+10mM3AT图3.筛库结果筛库结果：筛库的 SD-TLH，SD-TLH+10mM3AT，SD-TLHM，SD-TLHM+10mM3AT平板上菌落生长，所以从平板上挑取了 96个克隆进行PCR验证。第三部分酵母阳性克隆鉴定及测序比对为了鉴定SD-TLH+10mM3A

12、T和SD-TLHM+10mM3AT平板中筛选到的阳性克隆分别是 什么基因，需要将这些阳性克隆从酵母细胞中扩增出来进行DNA测序，并与GenBank数据 库中的序列进行BLAST比对分析。注:扩增阳性克隆使用的是南京瑞源生物技术有限公司自主研发的一款快速扩增酵母阳 性克隆试剂盒(Yeast Colony Rapid Detection Kit 货号：RY8001)。测序比对结果茅瑞师生物/IIRUIYUAN BIOTECHNOLOGY96个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，测序成功42个，经过Seqman、BLAST比对，去 除空载和重复序列最终获得30个不同的序列。吉果表明它们分别属于30种不同的

13、蛋白编码 基因。第四部分酵母阳性克隆回转验证将上述划线于SD-TLH+10mM3AT和SD-TLHM+10mM3AT缺陷型平板上长出的阳性克 隆转化子分别用无菌水稀释后点至SD-TL、SD-TLH+10mM3AT、SD-TLH+10mM3AT+xo-gal、 SD-TLHM+10mM3AT、SD-TLHM+10mM3AT+x-a-gal 缺陷平板，30C恒温培养 3-4 天。 结果如下：5D Tl.SI) n和 IflmM 3ATSI) Tl.l lDmM 1ATSD TI.HM IDmM 对TSDTI.FIM IQthM 3AT-+X-L-gLLl图4.回转验证结果回转验证结果：筛选得到的30个酵母阳性克隆，都能在SD-TL缺陷型平板上正常生长；其中部分克隆在SD-TLH+10mM3AT平板上不能生长，而在SD-TLHM+10mM3AT平板上能正常生长，表 明X促进互作。南京瑞迴生物分子技术服务平台高通莹酵母戏杂交文库筛选组学Y2H-Seq 高通呈骤母单杂交文库懦选组字YIH-Seq 高通雷膜蛋白酵母亚杂文库弼透组字 高通量筛选非生物胁迫基因组学 高通星筛选信号眩分泌蛋白质组学TF Centered YIH -Motif元件筛选 CUT-TAG/EMSA/Pulldown