免疫学实验报告

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1、免疫实验抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA）注入到健康动物例如鼠、兔的 机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中， 经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中 分离析出血清，从而获得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价 指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效 果。此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA）抗血清的制备过程，并通 过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。关键字：牛血清白蛋白（ BSA） 抗血清 抗体效价 免疫实验过程：本次实验一共

2、分为三个分实验：实验一：免疫 实验二：抽血、放血，分离抗血清 实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理 用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细 胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要 求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器： 1mL 注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3%5%苦味酸溶液或80%90%苦味酸，牛血清白蛋白（BSA） 三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为 1，左腰部为 2，左后腿为 3，头部为 4，背

3、部为 5，尾基部为 6， 右侧从前至后依次为 7、 8、 9。红色表示十位数,用黄色表示个位数。免疫前用金 属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。2、动物抓取及注射按 如下图所示抓取目标动物家兔为300600 口 g/次(400),每次不超过2mL；小鼠为10100 口 g /次(10-20, 2040 口 g / ml),每次不超过。小鼠腹腔注射 以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左(或右)下腹部刺入皮下， 使针头向前推?，再以45 度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤 及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。兔子可以分别尝试皮下（脚掌）、皮内、

4、耳静脉、肌肉注射 实验二：抽血、放血，分离抗血清一、采血小鼠采血（一）、尾部采血：需血量少时可用此方法。将小鼠放在在有开孔的离心管内， 显露尾部，将尾端剪去约5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。（二）、小鼠睚眦采血：将毛细管折断，使其断口锋利。采血时，左手拇指和食 指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静 脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。用毛细管的断口，右手拇指、 食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入 约23mm,手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入无菌离心 管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血

5、管，放松左手，出血即停止。用本法短 期内可重复米血。小鼠一次可米血一 ml，大鼠一次可米一。家兔的采血（一）、耳静脉抽血：将家兔置于兔固定箱内，对家兔进行耳静脉抽血，此法用 于小量抽血，验血测抗体效价，以便决定加强免疫或放血，与耳静脉注射方式相 反。（二）、心脏抽血：家兔固定（仰卧）-准确找到心脏部位-剪毛（心脏部位） -消毒-进针（50ml注射器接带硅胶管的12号针头）抽血，抽至50m 1,从硅 胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述 操作继续抽血,直至抽完。（三）、颈动脉放血：家兔固定（仰卧，身体及头部固定） -剪毛（颈部） -找 颈动脉管（消毒-剖开颈

6、部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红 色，有脉动） -小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等-开口（见图） -放血，接入100ml无菌空三角瓶。注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉 管！二、抗血清的分离，保存1、斜置装血液的三角瓶；2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4C）过夜；4、次日：估计分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为），混匀，分装小管，作好标记，-20 或-80C保存待测。实验三：酶免疫吸附试验法（ELISA ）测定

7、抗体效价一、ELISA 原理酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是在免 疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 ELISA 过程包括抗原 （抗体）包被在固相载体上，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原），生 成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生 成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。 二、实验仪器、材料、试剂仪器：酶标板，酶标仪、保鲜膜、排枪材料：牛血清白蛋白（BSA）抗原，10 口 g/ml溶液，包被液配制鼠抗BSA 待测抗体样品，用PBST从1：

8、1000开始倍比稀释，连续稀释8个 稀释度HRP标记羊抗小鼠IgG 二抗（按说明书稀释使用，用PBST稀释。试剂：包被缓冲液：MpH碳酸盐缓冲液（Na2CO3克，NaHCO3克，加水900ml， 调pH，再定容至1L）PBS 溶液（NaCl g, 或，KCl , KH2P04，蒸馏水定容至 1000ml,）PBST 洗涤液：含 % Tween 20 的 M 的 PBS （ pH ）底物溶液：（ 3,3,5,5-四甲基联苯胺）2M H2SO4 （市售浓硫酸为M,根据要配制的2M硫酸体积，吸管吸好相应体积浓硫酸沿着器壁缓慢加到水中）三、实验方法和步骤1加抗原：取酶标板，加入1001/孔的抗原溶液（

9、用包被缓冲液稀释，用排枪 加）2包被抗原：保鲜膜包好，37C 1h或4 C过夜（抗原分子通过疏水作用力结 合到96微孔板上）3.封闭:甩干后以PBST （200 口 1/孔）洗涤3次，3min/次，每孔加入100 口 15%（W/V）脱脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）。保鲜膜包好，37C， 2h后（封闭的 目的：降低背景干扰，避免假阳性），取出包被、封闭好抗原的酶标板,甩干孔内 液体。以PBST （200 1/孔）洗涤3次，3min/次4加待测血清：标记各孔，加入相应稀释度的抗体100U1/孔（用PBST稀释， 按示意图用单枪加）。37C，保鲜膜包好，60min后甩干孔内液体3468910111

10、2B1OOO XO X40 00Soo o Xi6ocdgaoo o x64000 X12800O XNC1000PC1000XC1OOO X200 O X4-ooc8ooD Xi6ood3200 o x6400O X12800D XNCPCXD1OOD X200O X400Boo D Xi6ood32000 x640aO X128000 xNCPCXE1OO O XO X40008oo D xi6ood20 00 X64000 X12800D XNCPCXF1OOO XS2OQO X4000SooD xi6ood320 00 X64000 X2800D XNCPCXG1OOO Xo x斗心c

11、mSoo o x16COOgaoa0 x640a0 XtSoo D XNCPCXXXXXXXXXXXXX5加二抗：以PBST （2001/孔）洗涤4次，3min/次。各孔加入酶标二抗100 口1/孔，37C，保鲜膜包好，45min后，甩干孔内液体6. 显色：以PBST （200 1/孔）洗涤4次，3min/次。加入TMB底物溶液50 口 L/ 孔，避光显色10min（抽屉中），然后每孔加入50 口1的2M硫酸终止反应7. 结果分析在酶标仪上，于450nm处测各孔OD值。阴性无色，OD小于；阳性黄色，3个重 复的平均值大于，且为阴性对照OD值的倍。打开“酶免大师”，登录密码“1234”，设置参数

12、，选“终点法检测”，建微板，点击“read”，等待读取各孔OD值，导出。结论：由于实验动物免疫效果不好等原因，所得OD值太小，小鼠免疫还可以，初步判 断抗原效价为一价。未免疫家兔的血清测定的OD值很小，说明实验材料没有很大的污染。穿插实验;玻片法血型鉴定实验材料：1、Ag：受检血样（红细胞悬液）2、Ab：标准抗A血清、标准抗B血清（单克隆抗体，不同于标准A型血清、B 型血清）。实验方法和步骤：1、受检抗原（血样）制备：用酒精棉球消毒手指-待干后用无菌 5#针刺消毒部位-取一滴血（大绿豆 大小）于盛有生理盐水的离心管中，混匀。2、加标准诊断血清到受检血样中，血型判定： 取干净6孔白瓷盘一块（两人用），三孔先各加一滴血样-前两孔分别加入一滴抗A、抗B鉴定血清-用两根无菌牙签分别对前两孔进行混合，水平摇动 2min后观察结果。实验结果分析