质粒构建流程

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1、质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用 没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1（+）,4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为 备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两 端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个

2、保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型（裂解液RL 4C、漂洗液RW -20C 保存）准备：冰盒、4C预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA套操作步骤：1）将1000M裂解液RL加入细胞中，混合5min。2）加200卩1氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。3）4C, 12000rpm 离心 10min。4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550卩1）5）加入1倍体积（550卩1） 70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4C,10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500卩1

3、去蛋白液RE, 12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700卩1去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500卩1去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，力口 50卩1 RNase free water于膜上，室温放置2min12）4C, 12000rpm 离心 60s13）点样：5卩1 RNA+ 1卩1 10Xbuffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V, 3min，可见3条亮带。14）-20C 保存2. RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript R

4、T reagent kit with gDNA eraser （-20C 保存）准备：冰盒，取出解冻，为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10卩1体系） 5 X gDNA eraser buffer2p! gDNA eraser1 p!Total RNA4讽可根据RNA浓度调整） RNase free water3p!PCR仪中进行，程序：42C, 2min一4C注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20卩1体系） 5 X primerScript buffer 24p! primerScript RT enzyme mix I1p! RT

5、 primer mix1 p! RNase free water4p11）反应液10p1PCR 仪：37C, 15min85C, 5s4C 注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中 3） 1.5m1EP管收集，-20C长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50p1体系如下：5XPS buffer10p1PCR程序：dNTP4p195 C5min ,dH2O32.5p195 C30sPrimerstar0.5p156 C30s丿35cyclecDNA1p1（可变）72 ClminR-primer1p172 C10minF-primer1p1注：可根据不同基因调节退货

6、温度，延伸时间，循环数。点样：5p1 PCR产物+ 1p1 6Xbuffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V, 15min4. PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microe1ute cyc1e-pure spin protoco1（OMEGA bio-tek） D6293-01 将PCR产物加入1.5m1EP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。 转移至HiBind MicroE1ution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g, 1min。 弃废液，加700p1 DNA wash buffer （含乙醇）到柱子，室温离心10000g,1min。

7、弃废液，重复 弃废液，空管离心13000g,1min 柱子放入新EP管，加10-20p1 E1ution buffer到膜上，室温孵育3-5min,离心10000g, 1min 电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带） 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5m1 EP管。 加等体积（1g=1m1） binding buffer （XP2）,60C金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄 色），混匀2min 溶液加入离心柱，离心10000g,1min，废液倒回再离一次 弃废液，加 300p1 binding buffer （XP2）,离心 10000g, 1min 弃废液，加 7

8、00p1 SPW washing buffer,离心 10000g, 1min 重复 空管离心13000g, 2min，弃废液，柱子转移到新EP管 加入 30-50p! elution buffer 于膜上，室温孵育 1 min，离心 13000g, 1min 电泳检测三、双酶切301反应体系如下：PCR纯化产物15p1Vector12gl10XM/L/K buffer3p!10XM/L/K buffer3gl3dH2O1013dH2O13gl酶A1p!酶A1gl酶B1y1酶B1gl反应条件：takara酶30C水浴1h65C金属浴10min终止反应 注：buffer类别依使用的酶具体选择，见

9、附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2卩12）酶切产物液相纯化3）20卩1连接体系（皆可）PCR产物5p!PCR产物6.3卩1pcDNA3.1pcDNA3.10.7卩110XT4buffer10XT4buffer2卩1T4 1igase1y1T4 ligase1卩13dH2O1013dH2O10pPCR仪中进行:22C, 30min-4C冰箱过夜注：连接产物-20C可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴 锅加热42C1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10皿加入100皿感受态细胞，或质粒1

10、-3卩1加入100卩1感受 态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42C, 45s，冰浴1min5）加900卩1 LB空培养基，摇菌150rpm, 37C, 1h6）浓缩离心13000rpm,1min,上清液留约2001重悬菌体，部分涂板（50-100卩1 ）7）完全吸收后，37C倒置培养12-16h六、菌落PCR3dH2O 35.711）以rTaq酶50卩1体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15卩1，体系如下:PCR程序：95 C5min95精选范本30s56 C30s 35cycle72 Clmin72 C10min10X buffer5p!MgCl23ylxdNTP4ylrTa

11、q0.3ylR-primer1ylF-primer1yl2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。 新划的板37C倒置培养12-16h。3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。七、测序1. 摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10皿枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37C。250rpm 摇菌 12-16h2. 送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序3. 比对 将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。（注：数据库中基因序列可能有

12、误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200皿80%灭菌甘油。2）再加入800皿箘液，轻混匀。3）液氮冻存。（一个基因冻2管即可）九、质粒提取 菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。试剂盒： AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g, 1min2）弃上清，加250yl solution I/ RNase A重悬菌落，混匀3）加250yl solution II,倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应

13、不超过5min）4）加入250皿solution III,立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。5）室温离心 13000g，10min6）上清液小心转入HiBind miniprep column（有套管），室温离心10000g, 1min7）弃废液，加500皿buffer HB,室温离心10000g, 1min8）选择性步骤：重复第7步9）弃废液，空管室温离心13000g, 2min10）柱子转入新EP管，加30-50卩1 elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min11）室温离心 13000g， 1min12）提取的质粒-20C保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空

14、白培养基）：1. 菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5a菌种，在LB平板上划线，37C倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37C, 250rpm,12-16h3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37C, 250rpm, 3h4）检测箘液 OD600 0.5 （0.3-0.4）6002. 感受态制备准备：0.1M CaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4C预冷。 步骤：1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4C离心3000rpm, 8min2）弃上清，0.1M CaCl210ml重悬（冰水中进行

15、，动作轻），两管合成一管3）冰上放置一段时间，4C离心2500rpm, 8min4）弃上清，0.1M CaCl210ml重悬，4C冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml，剩2ml,加加670皿80%甘油（箘液：80%甘油=3:1）,轻混匀6）1.5mlEP管分装，每管分装100皿，液氮冻存。试剂配制：1. 琼脂糖凝胶（1.2%） 琼脂糖粉 0.6g1XTAE 50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1M gold view核酸染料，混匀，倒板2.电泳缓冲液TAE （50X）2mol/L tris-碱242g1mol/L 冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0)18.622g二蒸水至1L 用NaOH调节pH至8.6，常温储存。用时稀释成1X溶液使用。3. LB培养基Yeast extract （酵母提取物）1gTryptone2gNaCl2gAgar powder （琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。4. CaCl2（0.1M）CaCl1.47gH O100ml2