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1、正文果胶酶的固定化及其活力测定一、目的：果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。在果品加工业中， 果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减 少外源物质对果制品的污染。果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大 提高了产品生产成本。固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本 通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。二、原理：本实验固定化方法为共价结合法。以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。壳聚 糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（a -氨
2、基-1.4-B -葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用， 是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖 分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地 固定在壳聚糖分子上。果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用 DNS 法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖 共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深 浅成正比，在 540nm 下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。三、试剂及仪器仪器：冷冻离心机 分光光光度计 比色皿（8 只） 摇床 水浴箱 混合振荡器 天平 瓷盘 药匙 剪刀（
3、1 把） 记号笔（1 支） 通风橱 吸水纸 具塞刻度试管（4支） 三角瓶（2支） 烧杯（100mlX3个） 试管架（1个） 试管（6支）量筒（100mlX1个）滴管（16个）离心管（5mlX2 个,50mlX1个） 移液管架（1个）移液管（2mlX 3个,5ml X 1个）注射器（1支） 滴管（1个） 吸耳球（ 1 个） 洗瓶（1 个） 玻棒（ 1 个） 烧杯（300 mlX 5 个）试剂：乙酸乙酸钠缓冲液（ 0.2mol/L,pH5.0）磷酸缓冲液（0.1mol/L,pH7.0）3,5 二硝基水杨酸氢氧化钠 冰醋酸 丙三醇 戊二醛 无水乙醇 浓盐酸果胶酶 果胶 半乳糖醛酸 壳聚糖 蒸馏水若干
4、桶四、方法步骤1 载体的制备1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。1.2每组配制60ml 10%的NaOH溶液,均分到三个小烧杯中。用注射器吸取约3ml壳聚糖的溶液滴入 10%的NaOH溶液中，即得到壳聚糖的微珠。每组共做三份相同量的微珠，静置10min，蒸馏水浸洗 至中性，最后三份微珠各用20ml pH7.0的磷酸缓冲液浸洗一次（3min）。1.3 倾去磷酸缓冲液，进行下面步骤。2 载体的活化三份载体中各加入4%的戊二醛溶液约20ml,过夜或者室温活化5h,中间摇动。3 偶联3.1取果胶酶0.1g,加入18ml水、ml乙酸一乙酸钠缓冲液，摇床
5、上振荡提取5h, 8000rpm离心10min, 上清液即初始酶液，留2ml酶液置于一支干净的5ml离心管中4C备用，其余18ml酶液进行下面实 验。3.2水洗除去游离戊二醛（5minX5次）。3.3将活化的三份载体合并，用所剩酶液覆盖载体，4C过夜，中间摇动几次。4 活性的检测4.1水洗除去游离酶（2minX4次），回收在小三角瓶中的滤液即残余酶液置于4C备用。收集小球, 滤纸吸干，称重。另取两份各20粒微珠，各自称重，4C保存备用。4.2取两支试管编号按下表所述步骤加样，进行固定化酶的酶活测定（20粒固定化酶颗粒称重）：操作步骤对照管反应管10.4%果胶 4ml50C水浴中预热5min0.
6、4%果胶 4ml50C水浴中预热5min23ml pH5.0乙酸一乙酸钠缓冲液3ml pH5.0乙酸一乙酸钠缓冲液350C准确反应2h加入完整的固定化酶颗粒20粒50 C准确反应2h4立即置于沸水浴中，快速 加入完整的固定化酶颗粒20粒5沸水浴中煮沸5min立即置于沸水浴中煮沸5min4.3 游离酶的酶活测定取两支试管编号甲乙管按下表加样:操作步骤甲管乙管10.4%果胶 4ml0.4%果胶 4ml50C水浴中预热5min50C水浴中预热5min22ml pH5.0乙酸一乙酸钠缓冲液2ml pH5.0乙酸一乙酸钠缓冲液3加入初始酶液2ml加入残余酶液2ml50C准确反应2h50 C准确反应2h4
7、立即置于沸水浴中煮沸5min立即置于沸水浴中煮沸5min4.4定性实验：取两支试管分别加入对照管和反应管上清液各1ml，再分别各加入2ml无水乙醇（含1 %的浓盐酸），静置15min，观察两管有什么现象出现？为什么？4.5 酶活力测定步骤：4.5.1 标准曲线制作精确称取O.lOOOg半乳糖醛酸，用缓冲液定容至100mL,获得lmg/mL的半乳糖醛酸溶液。取6支 25mL的刻度试管编号,并按表1加入各种试剂。表1标准样配制试齐U mL试管号123456糖标准液(mg mL-1)00.20.61.01.21.6蒸馏水3,5-二硝基水杨酸5.05.05.05.05.05.0半乳糖醛酸含量mg00.
8、20.61.01.21.6加入试剂后在混合振荡器上振荡均匀，在沸水浴中加热5min,取出后立即用流水冷却，加蒸馏水定 容至25mL（以1号试管作为空白调零），在540nm波长下比色测定吸光度。以吸光度为纵坐标，半乳 糖醛酸含量为横坐标,绘制标准曲线。4.5.2另取两支试管分别加入对照管和反应管上清液各2ml，再分别加入3, 5 二硝基水杨酸5ml， 沸水浴保温5min,取出立即冷却。观察两管溶液颜色发生了什么变化？为什么？加蒸馏水定容到 25mL。以标准空白为基准调零，在540nm处测吸光度（吸光度要在0.0250.4之间，否则重新稀释）。4.5.3另取两支试管分别加入甲管和乙管上清液各2ml
9、，再分别加入3, 5 二硝基水杨酸5ml，沸水 浴保温5min,取出立即冷却。观察两管溶液颜色发生了什么变化？为什么？加蒸馏水定容到25mL。 以标准空白为基准调零，在540nm处测吸光度（吸光度要在0.0250.4之间，否则重新稀释）。五、结果分析1. 酶活力单位：酶在50C、pH5.0的条件下,1h分解果胶产生1mg游离半乳糖醛酸为1个果胶酶活 力单位。同理将缓冲液体积固定为3mL，将固定化果胶酶体积忽略，进行固定化果胶酶的活力测定。2. 酶活力计算：根据标准曲线，准确计算固定化酶活=?酶液初始总酶活二？ 残余酶液的酶活=?3. 酶结合效率及活力回收率的测定：分别按下式准确计算酶结合效率=（酶液初始总酶活一残余酶液的酶活）宁酶液初始总酶活X100% 酶活力回收率=固定化酶的酶活宁酶液初始总酶活X100 %六、注意事项：对酶的要求较高，操作注意细节问题。
果胶酶的固定化及其活力测定
