有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点

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1、1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了 1Gy照 后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的 优势在于成本低，操作比较简单。低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子 版已有上传，感兴趣的可以去看。凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用 CASP 软件分析后，其曲线呈典型 的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调

2、低，否则 凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V, 200mA,20min,凋亡细胞观察宜选用10V；100mA,10min。2、中性单细胞凝胶电泳步骤：(以淋巴细胞为例)1) 淋巴细胞的提取 取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝，加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。 取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。 重复洗涤细胞两次。2) 琼脂糖玻片的制备 制好微型电泳槽。 使用两层凝胶法，第一层为100pl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶，第二层为75pl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶

3、和25pl淋巴细胞的混合液。3) 细胞裂解、电泳 好的玻片浸入新配的预冷的(4C)中性裂解液中裂解1.5h。 取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。 将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V,电流200毫安。4) 染色用溴化乙啶(2pg/ml)染色。用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。5) 读片和分析 用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片海张胶随机抓取 100 个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。 用 CASP 软件分析系统分析慧星图像。3、biomed96 : lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什

4、 么问题，望指教。铺3层胶,第一层100ul1 %regular胶,50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5 %低熔点胶,第三层100ul 0.5低熔点胶。裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解 1 小时 解旋液： EDTA1mM NaoH 300mM Ph13 孵育20分钟。电泳40分钟。染色： PI 50ug/ml 染色 15 分钟。结果是什么都看不到，好像一点都没染色。lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先 提出的中性和碱性条件，中性条

5、件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我 查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认 的：中性双链，碱性单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解 液 ph10 ，所以检测结果应是单链断裂。其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担 心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我 不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己 的瓜苦，呵呵），这样在实验操作

6、上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了， 从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。第三，解旋 20 分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、）， 我认为 20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI的 荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。 第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于 1.5 小时。第六，我不知道您用的什么细胞，

7、50000个细胞加入100ul0.5%低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。一般100ul0.5%低熔点胶中含400个细胞就足够了。还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开 自然光源，画蛇添足。只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它 肯定跑不了！biomed96：非常感谢lq6688老师，您的建议很有用。1我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一 个细胞都没见到，我以为是

8、细胞数过少，所以我就加大细胞：（ 根据您的指导，应该肯定可以排除这个可 能性了。2关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为15V 400mA,但我们实验室的电 泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的吧？ 3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（ 主要也是为了防止脱胶的问题。因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞 起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载 体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？4关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB,怕污染了荧光显微镜，根据文献

9、 建议的几种燃料，我选择了 PI,不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了 1mg/ml 出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我 会首先拉长裂解时间看看的。另外，我配的各种溶液成分是对的吧？5关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究 竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱 性的实验，再进行判断？6. 我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。关于数据分析的问题，是不是我用数码 相机拍下了照片就可用 C

10、ASP 了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。所以 还麻烦您提供下载的链接。再次感谢 lq6688 老师，希望您能继续指导我的实验。lq6688： SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文 献可查的。您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100应该是临用时加的吧， 另外我还加了 DMSO,也是临用时加的。 我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面 比较光滑，容易脱胶，文献多

11、用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改 良，在波片上人为作出两个小电泳槽，是用很窄的玻璃条封上的，这就看你的功夫了，不过这可是一劳永 逸的事，不会脱胶。作出的彗星图像用数码相机拍摄后转入计算机，然后就可以用 CASP 了，我想你的数码相机已经准备好了 吧，我用的是NIKON 4500,可以和荧光显微镜配套的。注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相 机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单。目 前国外有很多 SCGE 的自动成像分析系统，不过，价格也不菲，还是自己用相机拍的好。另外，我还是为你担心一个

12、问题， 100ul 胶含 50000 个细胞，出来的彗星图像可能密度太大，每个图像都 互相影响，将来无法用 CASP 分析，除非您的胶铺的很薄，不过，就我 的经验，不会很薄吧。下面就是CASP的链接，可以免费下载，使用也很简单，看看说明就可以了，祝你成功！4、 qyt：我现在想问的是1. 彗星试验的重复性好吗？2. 不太明白彗星和流式的组合可以检测到什么？3. 我做的是碱性，是不是一定加肌氨酸钠，因为不是很好溶解？4. 裂解液，电泳液，中和液有没有必要新鲜配置，因为我的裂解液在冰箱中放置 3天后会有结晶，但是加 热后会溶解5. 我也是按照三层胶铺的，不过每次总是会有脱胶的现象，搞得挺难受的。

13、6.验证试验的阳性对照应该选 什么啊？7. 不同的细胞的裂解时间应该不同吧，想问的是假如想评价药物，（兽药）应该选什么细胞比较合适啊？我 现在做的是vero，不过是看了别人的文献决定的，想听听大家的意见很多问题， 3Qlq6688： qyt 战友，就我的经验， SCGE 的重复性还是不错的，但要做到所有的试剂要同批配制，存 放时间不要过长，如我的试验，宁愿累几天，也不要把战线拉的太长，前期准备工作可以按部就班，如（肿 瘤接种、给药等），一旦用 SCGE 的时候，一定在较短时间完成，记得我最累的一天从 8 点上班，到晚上 11点半才回家，中间利用一点时间吃饭。因为裂解液时间长了会结晶，（浓度太高

14、了），正如您所说的。加 热磁力搅拌器搅拌后，还可以溶解，但是，还是不宜久存的。电泳液和 PBS 相对好一点。呵呵， SCGE 是 一个比较年轻的方法，潜力还没有完全发掘出来，与其它技术结合是必然趋势，就拿血液病来说吧， CD 分 子已经发现了很多了吧，给药后，用某种药物处理，然后用流式把细胞提取出来，再做SCG E,结果可以看 到哪种细胞对该药物敏感，有助于发现该药对哪类白血病敏感裂解液药新鲜配制， SCGE 中最难配的是裂解液，每次做的时候都要最先配制，而且用加热磁力搅拌器 不停搅拌，同时就可以干别的，完全溶解后再放入冰箱预冷。您的脱胶问题和biomed96战友一样，可以 该一下凝胶载体，磨

15、砂玻璃或自制微电泳槽，我用的自制微电泳槽，其实很简单，从不脱胶，另外 SCGE 最好在避光条件下操作，避免额外DNA损伤。阴性对照不必说了，阳性对照可以旋已知的对所研究药物（或 同类药物）极度敏感的细胞，如国外文献报道，用共济失调毛细血管扩张症患者的淋巴细胞做阳性对照 观察辐射或UV对正常人淋巴细胞DNA的损伤作用。不同细胞到底裂解多长时间我还没有看见相关文献， 但有文献报道，一般裂解1.52小时即可。您用的vero我不知道是什么药物？所以我不便发表意见，不 过我觉得先用淋巴细胞比较合适。当然还要看药物的靶细胞是什么。qyt：谢谢回答，你那是不是有comet-FISH的资料啊，你能大概给我解释

16、一下不？比如说方向，检 测的目标，还有啊我做的是一个兽药的毒性评价，不象你们做的是人医的，不象你们那么复杂，呵呵不过 对我的水平也就比较麻烦了。我现在做的vero是一种动物的细胞，对了，你说的磨砂的玻片是自己整的吧，我买了砂纸，不过自己搞了 半天觉得效果不是很好，你说的那种自制的微电泳槽能再详细一点介绍吗？我也学学， 3Qlq6688：因为作FISH的成本比较高，所以我没有作，我这有这方面的文献，用不同染色体探针标记 后，作SCGE，可以筛选出某种损伤因子（物理因子或化学因子等）的靶染色体是几号染色体。国内可能也 有人作过，您可以查一下文献，如果需要，我可以帮你查一些国内此方面的文献。CNKI

17、就可以。 毒性评价我觉得您用 VERO 细胞和淋巴细胞分别作一下，如果单纯发表文章还可以，如果作课题，最好再 加一点SCGE以外的指标，结果更全面，更合理，更完美，呵呵。磨砂玻璃片应该可以买到，自己作恐怕太麻烦了，而且作的也不好，和您一样，我当初也是自己作，自己 摸索，出来后更有成就感，呵呵，我们实验室以前有人作过，也是脱胶的问题，就半途而废了，后来一个 师兄又作SCGE,他走后我又把技术改良了一下，现在觉得比较成熟了。微电泳槽其实也不难作，用普通载玻片，用玻璃刀割出几条 2 毫米的细条，用这些细小的玻璃条在普通载 玻片上粘两个 1.5 厘米见方的槽，呵呵，微电泳槽就作好了，关键怎么割出那么细

18、的玻璃条，我刚开始怎 么也割不出，都要放弃了，后来发现工具不好，如果您要作的华建议您买一把好的玻璃刀， 100 多元，不 算太贵，用比较薄的载玻片，太厚了不好割，您就可以“庖丁解牛”了，不管作什么，好的工具是成功的开 始，磨刀不误砍柴功，还有就是胶水的选择，首先要不溶于水，还要牢固，我专门作过比较，买了好几种 胶，粘完后泡在蒸馏水里至少24 小时，筛选出最好的胶水，看广告没用，得靠实践，我作的微电泳槽可以 长期重复使用，所有的实验作下来，还是用那几个槽，很爽，所以叫一劳永逸。我作了 n次SCGE，从来 没有脱胶，您不妨试试，如果还有什么问题，尽管提，我会尽力而为。qyt： 1第三层胶的目的是什

19、么啊。还有啊这个试验为什么会选择低熔点的胶来混合细胞啊，低熔点和 正常熔点的胶在电泳过程中有什么不同，我觉得是不是第三层胶可以不用铺啊？2.我现在做的是 H2O2 嘛。它的剂量我是从 9.1，18.2, 27.3, 45.4, 91，182, 273, 454, 910，1820uM 的浓度，我发现前几个剂量的脱尾区别不是很大，是不是可以把这几个剂量去掉啊，我现在不是很会设计 试验剂量lq6688：您的问题很好，说明您善于思考，呵呵。细胞肯定要用低熔点胶混合，铺胶前低熔点胶PBS 溶解、煮沸，要温于37度水浴箱，再和细胞混合，不会破坏细胞，而正常熔点凝胶就做不到了，正常熔点 胶要煮沸后立即铺胶

20、，否则温度降低，就凝固了。 我也赞成您的想法，因为我就是用的双层铺胶法，根本不用铺第三层，有文献报道只铺一层胶，呵呵，那 就更简单了。我没做过H2O2,不敢妄加评论，但是，试验结果要通过科学的统计学分析后得出结论的，我不知道您说 的“区别不大”是否经过了统计学分析呢？如果预实验时您发现了前几个剂量的效应无差别的话，可以在正 式试验中保留其中的一个剂量，当然最主要的还要看它和阴性对照组之间有无差别。我觉得初次用这个方 法做毒性试验的话，一定要找到和阴性对照组之间有差别的最小剂量，然后剂量逐步提高，如知道半数致 死剂量就更好了，有了两个坐标，在这两个剂量之间选择剂量，当然，在大于半数致死剂量还要选择一定 剂量，随着剂量的增加，必然会出现从某一个剂量以后，大于此剂量的若干组之间都没有了差别，那就以 此剂量造成的损伤作为100%（如尾长、尾矩、OLIVE尾矩等等好多指标可测），首、尾都有了，中间就好 办了！可以根据这个剂量范围，继续做凋亡细胞率的观察，看看这个指标怎么样。