蓝藻CO2浓缩机制综述

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1、蓝藻CO2浓缩机制综述摘要：本文通过查阅了国内外各种藻内光合无机碳浓缩机制文献来探讨该藻CO2浓缩机制。从查阅的文献可以看出，藻最大光合放氧量为300molmg-1h-1，K1/2HCO3-为47.214.6M。在胞内碳酸酐酶抑制剂EZ100M存在条件下，该藻的最大光合放氧速率为240molmg-1h-1，K1/2KHCO3为113.238.8M，K1/2比未加抑制剂时高139.83%。在阴离子通道抑制剂DIDS200M存在条件下，该藻的最大光合放氧速率为280molmg-1h-1，K1/2为66.719.6M，K1/2比未加抑制剂时高41.31%。结果说明，胞内碳酸酐酶对提高藻细胞光合无机碳

2、亲和力有明显作用，藻细胞对胞外HCO3-的吸收与质膜上的阴离子通道载体的运输有一定关系。关键词：蓝藻 光合放氧速率 碳酸酐酶自从工业革命以来，人类活动的增加导致化石燃料的大量使用。据预测，大气CO2浓度在21世纪中叶将到达目前浓度的2倍，即700mol.mol-1,1 最终以引起温室效应。大气CO2的升高可能导致一系列的植物生理生态学效应，是当今全球关注的热门课题之一。近几年的研究证明，CO2浓度升高将对陆生植物的光合作用即初级生产力产生明显影响:2 在短期内将提高C3植物的光合速率，而在长期适应过程中可能导致光合速率的下降。3，4 与高等植物的研究相比，大气CO2浓度升高将对水生植物特别是藻

3、类影响的研究要明显落后10年。2 国外学者在70年代就提出大气CO2浓度升高也海洋生物关系的问题，5 80 年代初分析了大气CO2浓度升高可能对海洋表层海水的碳酸系统和pH产生影响。6 近年来，CO2浓度升高对海洋藻类的影响得到了研究。例如：Riebesell et al.(1993)通过室内实验推测CO2浓度升高将促进海洋微藻的产生；Hein & Sand-Jensen(1997)证明CO2浓度升高将提高海洋浮游植物的初级生产力。在光合固碳过程中，藻类包括海洋和淡水藻类像陆地高等植物一样以CO2为Rubisco的羧化底物。虽然CO2的分压在水中与在大气相比没有明显差异，但是水环境和陆生环境有

4、很大差异，在水环境中CO2的扩散速率比在空气中慢104倍9。因此海洋浮游植物的光合作用更易受CO2的可利用性限制。经实验说明，在海藻中普遍存在CO2的浓缩机制。CO2浓缩机制是藻细胞在低CO2浓度下有效进行光合作用的一种机制, 这种机制涉及到几种蛋白质，如无机碳的运输载体(ATP酶供应HCO3-的主动运输以能量)，一种或几种碳酸酐酶。碳酸酐酶carbonic anhydrase，CA是一种含Zn的金属酶，其功能是催化CO2和HCO3-之间相互转化，它是CCM的一个重要组成局部，在光合无机碳的固定方面发挥重要作用10。但是在不同的光合有机体中它的作用有着明显的差异11。在CO2浓缩机制中，碳酸酐

5、酶(CA)起了很重要的作用，它促使HCO3-和CO2之间的相互转换。即当外界CO2浓度较低时，胞外CA酶加速外面的HCO3-向CO2转化，CO2被运输进入细胞后，胞质CA酶又催化CO2向HCO3-的方向转化。大型海藻广泛分布于潮间带以下的渐深带，约占海洋初级生产力的10%11，在近岸碳循环中起重要作用。一些海藻的光合作用仅利用CO212，但是大多数海藻可利用HCO3-13，14。通常借助于细胞外表的碳酸酐酶将HCO3-转化成CO2，然后吸收和加以固定。在光合固碳过程中，藻类包括海洋和淡水藻类像陆地高等植物一样以CO2为Rubisco的羧化底物。虽然CO2的分压在水中与在大气相比没有明显差异，但

6、是水环境和陆生环境有很大差异，在水环境中CO2的扩散速率比在空气中慢104倍15。现在的大气CO2浓度为360mol-1，与大气平衡时海洋表层水中无机碳浓度为2mmol/L18 oC，大约95%的无机碳形成为HCO3-，CO2为10mol-1。这个浓度比Rubisco饱和时所需的CO2浓度低很多，因此在缺乏CO2浓缩机制CCM情况下，海洋浮游生物在光照充足时期生长将受到无机碳的限制15，16。经过近20年的研究说明，许多海洋浮游生物具有无机碳浓缩机制CCM虽然这种机制在不同的生物体中其效率有较大差异17-21。研究说明，当CO2浓度很高时，碳酸酐酶活性降低或是消失，HCO3-的运输能力降低；当

7、生长在低CO2中时，微藻细胞对无机碳的亲和力大大增强，而且它会诱导产生CO2浓缩机制来适应这种低浓度的CO2环境，同时其生理状态也会发生变化。在蓝藻Synechcloccus中当细胞从高CO2条件转移至低CO2条件下时，它们也诱导形成高光合无机碳亲和力其亲和力一般比绿藻更高，而溶液中的总DIC可能是诱导CCM表达的关键信号分子22，23。因此，许多真核微藻和大藻以及所有的海洋细菌的光合速率都不受与大气CO2平衡时海水中无机碳浓度限制24，25。不过许多海草marine embryophytes, ie seagrasses的光合作用仍受海水中无机碳的限制25，26。但是海洋浮游植物的生长是否受

8、无机碳的限制还存在许多争议，还需要大量的实验来检验15。蓝藻水华爆发和蓝藻毒素已成为世界性环境问题，蓝藻水华污染所带来的主要危害之一是藻毒素的产生，在已发现的各种藻毒素中，微囊藻毒素的毒性较大，危害最严重。目前，有关微囊藻毒素的毒性研究大多数集中在动物、高等植物上。藻类作为水生生态系统的初级生产者，其种类的多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能27。蓝藻中特有的羧体是一个高度特化的结构，其外部由一层蛋白鞘包被，蛋白鞘具有阻止CO2扩散的功能。羧体的主要成分是CA和Rubisco，它的生物功能是把CA位点和Rubisco位点紧密结合在一起，通过CA催化细胞内HCO3-转化为CO2，提高

9、Rubisco位点CO2浓度，从而提高CO2固定效率9，10。碳酸酐酶carbonic anhydrase，CA是一种含Zn的金属酶，它催化CO2和HCO3-的相互转化。CA的分布在不同的藻类中有所不同，有的只存在于细胞内，有的那么在细胞内，外都有。藻类CA酶的生理功能同其分布位置密切相关，胞外CA使细胞能利用水体中的HCO3-。胞外CA存在时，水中的HCO3-在靠近细胞外表处脱水成CO2，随后经扩散或主动运输进入细胞内11。胞内CA的功能可能是提高Rubisco羧化位点的CO2浓度，胞内酶对于藻细胞在CO2固定过程中有效利用无机碳是非常重要的12。使用CA抑制剂的研究说明，CA活性的诱导对藻

10、细胞适应低CO2环境非常重要13。抑制剂对CA的不同影响主要与它对CA的亲和力和能否透过细胞膜有关。蓝藻既能够利用水中溶解的CO2，其吸收具有饱和动力学特征，说明在蓝藻中CO2吸收可能由膜上的运输载体完成14。蓝藻也能利用水体中的HCO3-，对HCO3-的吸收是一种主动运输方式，它逆电化学梯度进行运输，因此，必须有代谢能的提供。实验说明Na+/H+或Na+/HCO3-运输载体可能参与HCO3-的主动运输15，16。Synechococcus PCC 7942 中已经观察到Na+的流动可以满足HCO3-的胞内积累，其计量关系大约为2-3个Na+伴随一个HCO3-同向运输进入胞内17。Espie和

11、他的同事们证明A蓝藻在不同条件下，HCO3-的运输对Na+的依赖性不同；BNa+-依赖和Na+-非依赖性的HCO3-运输对EZ的敏感性不同。另一些实验说明，H+泵可能参与HCO3-的主动吸收。与ABC-和CmpA-载体具有同源序列的ATP-H+泵在蓝藻Synechococcus PCC 7942和Synechococcus PCC 6803 中参与HCO3-的主动运输，它可能就是蓝藻中的运输载体。但还需要大量研究工作18因此研究不同浓度的KHCO3对该藻的光合生理和初级生产力的影响，对人事该种的生态学规律有重要意义，也可为水华产生的机制提供一定的理论依据，为日后水华的治理提供更为坚实的理论根底

12、。本文主要是研究微囊藻的CO2浓缩机制，即通过各种抑制剂对该藻吸收外源无机碳的影响，来讨论其可能的运输机制。1.材料和方法：1.1 实验对象：铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa，藻种来自于中国科学院武汉水生生物研究所。1.2 微囊藻的培养条件：以BG11为根底培养基表1，将藻液接种到大培养瓶中。按BG11:A5=500:1的体积比参加A5溶液，以BG11:NaNO3=250：1的体积比参加NaNO3溶液(0.1molL-1)，置于人工气候箱ROH-01型中通气培养4-5天。培养温度为25 ，光照强度为90 molm-2s-1, 每天光照12小时。当细胞处在对数生长期时开始取

13、样，用于不同条件下的再培养。 表1 微囊藻BG11 培养成分 Table 1 composition of BG11 medium unit：mgMgSO4 7H2O 750 EDTA 10 Citric acid 60 FeSO4 7H2O 60 CaCl2 270 Na2SiO3 9H2O 580Na2CO3 200 K2HPO4 623注：按上述顺序依次参加称量好的药品溶入10L蒸馏水中每种药品在水中溶解完全后，再参加下一种药品1.3 测定方法： 光合放氧量测定：细胞的光合放氧测定用Clark-型氧电极Chlorolab2, Hansatech Instruments, 测定时反响杯的温

14、度为25 ，光强为400 molm-2s-1。在5000 g下离心5分钟，收集生长在对数期藻细胞，用H2SO4+Tris洗涤一次，然后悬浮在1.5 ml有20mmolL-1H2SO4Tris的缓冲液中pH 8.2，将悬浮液转移至电极反响杯。整个反响过程中反响杯中O2浓度通过吹N2保持在低于30%水平。首先在光照下让细胞把胞内“CO2耗竭，直至净放氧为零，然后每隔1-2分钟添加不同浓度的KHCO3(表2)，测定细胞的光合放氧速率。K1/2DIC值由无机碳依赖的光合放氧曲线通过Michaelis-Menten方程拟合给出。V=Vmax*S/(K1/2DIC+S)S：DIC或CO2浓度； V：给定无

15、机碳浓度下的净光合放氧速率； Vmax：饱和无机碳浓度下的净光合放氧速率； K1/2DIC：到达最大光合速率一半时所需的无机碳浓度。 叶绿素含量的测定： 按Chen的方法：将每次放氧量测定完后的藻液离心，倒掉上清液；用1ml甲醇浓度99.5%悬浮，置于冰箱内冷冻。取出冷冻的藻液离心，收集上清液：再用1ml甲醇悬浮藻细胞，第二次离心，收集上清液，合并两次上清液，用甲醇定容至10ml，于663nm处比色OD663。表2 参加的不同浓度KHCO3与反响杯中KHCO3最终浓度反响槽中最终浓度(M)参加的量(L) 参加的溶液浓度(mM)207.54407.54807.581607.5163207.532

16、6401532160014.4100360015200560015200760015200960015200 计算： 叶绿素含量：Ca(ug*ml-1)=11.8*OD663*10/1.5 放氧量计算：Vumol*mg-1*h-1 =Rate*1000*60/Ca3.讨论关于无机碳浓缩机制CCM的研究工作在蓝藻和淡水绿藻中已经有很多报道12。在蓝藻Synechococcus中存在Na+依赖和非依赖的HCO3-吸收以及CO2吸收利用13。在绿藻Chlamydomonas reihardtii 和Chlorella sp.中已报道二者都能既主动吸收CO2又能吸收HCO3-14。关于无机碳浓缩机制C

17、CM调节机理的研究在蓝藻和绿藻中已经有不少的报道15,16。在绿藻Creindardtii 和Chlorella sp.中高CO2浓度5生长条件抑制了它们的CCM，降低了它们对外源无机碳的亲和力，而当从高CO2转移至低CO2浓度0.035时其CCM被诱导，提高了它们对外源无机碳的亲和力17。许多报道说明溶液中的CO2浓度可能使调节CCM表达的关键信号分子18。在蓝藻Synechococcus 中当细胞从高CO2条件转移至低CO2条件下时它们也诱导形成高光合无机碳亲和力其亲和力一般比绿藻更高。而溶液中的总DIC可能是诱导CCM表达的关键信号分子19。在CO2浓缩机制中，CA酶起了很重要的作用，它

18、促使HCO3-和CO2之间的相互转换20,21即当外界CO2浓度较低时，胞外CA酶加速外面的HCO3-向CO2转化，CO2被运输进入细胞后，胞质CA酶又催化CO2向HCO3-的方向转化。胞外CA是无机碳浓缩机制的重要组成局部，其对HCO3-亲和力的大小与K1/2值成反比，即K1/2值越大，表示对HCO3-亲和力越小，反之亦然。本实验是在有阴离子通道抑制剂EZ、DPC、SITS、DIDS条件下探讨微囊藻细胞在不同浓度HCO3-放氧量。对照组及加各种抑制剂后计算出的HCO3-的K1/2mol /L：ControlEZDPCSITSDIDS加Na+79819512757872951025026810

19、5不加Na+19026149571855311175719427从对照组可以看出，加Na+后，K1/2值减小，细胞对HCO3-的亲和力增大，由此可推测Na+与HCO3-的运输有关。我们由此得出以下结论：1. 与不加Na+相比，在加Na+条件下，藻细胞的无机碳亲和力显著提高。这与Synechococcus PCC 7942 中已经观察到Na+的流动可以满足HCO3-的胞内积累结果一致，这说明Na+/HCO3-运输载体可能参与HCO3-的主动运输；并且由本实验及前人的工作可以得出：参与HCO3-主动运输的Na+/HCO3-运输载体可能在蓝藻中普遍存在。2. 在抑制剂EZ存在条件下，藻细胞的无机碳亲

20、和力显著降低。我们发现：EZ是胞内CA的抑制剂，它抑制CA的活性，从而阻碍HCO3-进入细胞，由此可以说明胞内CA对HCO3-的运输非常重要。3. 在阴离子通道抑制剂DPC，DIDS存在条件下，藻细胞的无机碳亲和力都降低，这说明HCO3-进入细胞与阴离子通道有关。并且DPC的参加使藻细胞的无机碳亲和力显著降低，而DIDS的参加使藻细胞的无机碳下降不明显，这说明藻细胞HCO3-的运输通道可能对DPC敏感，而对DIDS不敏感。参考文献1 陆时万，徐祥生，沈敏健，吴国芳等 植物学(上、下)。高等教育出版社，1988.2 张其德，卢从明，冯丽洁等(1996)，CO2加富对紫花苜蓿光合作用原初光能转换的

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28、 HCO3-transportdistinguishes it from Na+-independent HCO3- transport and provides evidence forNa+/HCO3- symport in the cyanobacterium synechococcus UTEX 625. Plant Physiol. 104:1419-1428.14Sultemeyer DF, Fock HP, Canvin DT.1991.Active uptake of inorganic carbon byChlamydonomas reinhardtii: evidence

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30、centrate CO2 to increase the efficiency ofphotosynthetic carbon fixation? Plant Physiol, 1999, 119: 916.17 Sultemeyer DF, Miller AG, Epsie GS, Fock HP, Cavin DT. Active CO2 transport by the green algaChlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol, 1989, 89:12131219.18 Matsuda Y, Williams TG, Colman B. 199

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32、ntPhysiol.80:1038-1040.20 Imamura M, Tsuzuki M, Shiraiwa Y, Miyachi S. Form of inorganic carbon utilized forphotosynthesis in Chlamydomonas reindardtii. Plant Cell Physiol, 1983, 24: 533540.21 Tsuzuki M. Mode of HCO3- utilization by the cells of Chlamydomonas reindardtii grown underordinary air. Z P

33、flanzen Physiol, 1983, 110: 2937. 24 Tortell PD, Reinfelder JR, Morel FMM. 1997. Active uptake of biocabonate by diatoms. Nature 390: 243244.25 Beardall J, Johnston AM, Raven JA. 1998b. Environmental regulation of CO2 concentrating mechanisms in microalgae. Can J of Bot. 76:10101017.26 Raven JA. 199

34、7. Inorganic carbon acquisition by marine autotrophs. Adv. Bot. Res. 27: 85209.27食用蓝藻葛仙米的二氧化碳浓缩机制及其生理生态学研究,刘继勇，华中师范大学04级硕士论文；20040501。28 Kaplan A,Reinhold L.1999. CO2 concentrating mechanisms in photosynthetic microorganisms.Annu Rev Plant Mol Biol.50: 539-570.29 Espie GS,Kandasamy RA.1994.Monensin

35、inhibition of Na+-dependent HCO3-transport distinguishes it from Na+-independent HCO3- transport and provides evidence for Na+/HCO3- symport in the cyanobacterium synechococcus UTEX 625. Plant Physiol. 104: 1419-1428.30 Sultemeyer DF, Fock HP, Canvin DT.1991.Active uptake of inorganic carbon by Chla

36、mydonomas reinhardtii: evidence for simultaneous transport of HCO3- and characterization of active CO2 transport.Can.J Bot.69:995-1002.31 Goleman JR. The molecular and biochemical analyses of CO2-concentrating mechanisms in cyanobacteria and microalgae. Plant Cell Environ, 1991, 14:861867.32 Moroney

37、 JV, Somanchi A. How do algae concentrate CO2 to increase the efficiency of photosynthetic carbon fixation? Plant Physiol, 1999, 119: 916.33 Sultemeyer DF, Miller AG, Epsie GS, Fock HP, Cavin DT. Active CO2 transport by the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol, 1989, 89:12131219.34 Ma

38、tsuda Y, Williams TG, Colman B. 1999.Quantification of the rate CO2 formation in the periplasmic space of miceroalgae during photosynthesis. Plant Cell Environ. 22: 397-406.35 Mayo WP, Williams TG, Birch DG, Turpin DH. 1986. Photosynthesis adaptation by Synechococcus leopoliensis in response to exog

39、enous dissolved inorganic carbon. Plant Physiol.80:1038-1040.36 Imamura M, Tsuzuki M, Shiraiwa Y, Miyachi S. Form of inorganic carbon utilized for photosynthesis in Chlamydomonas reindardtii. Plant Cell Physiol, 1983, 24: 533540.37 Tsuzuki M. Mode of HCO3- utilization by the cells of Chlamydomonas reindardtii grown under ordinary air. Z Pflanzen Physiol, 1983, 110: 2937.22 陈雄文，高坤山。海产硅藻中肋骨条藻的光合生理研究。中科院水生所博士论文，2003，