伪狂犬病检测方法

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1、十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A（标准的 附录）2 操作步骤2.1 病料的采集 对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、 肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4C送实验室检测。2.2 样品处理 待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生 理盐水或DME培养基制成1： 5乳剂，一70C反复冻融后，经3000rpm离心30 分钟后，取上清液经0.22卩m微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为 100

2、U/mL,70C保存作为接种材料。2.3 病料接种 将病料滤液接种已长成单层的 BHK-21 细胞，接种量为培养基 量的10%, 37C恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56C 水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37C温箱中培 养。2.4 观察结果 接种后 2448 小时， BHK-21 细胞应出现典型的细胞病变效应 （Cyto pathogenic effect, CPE）,表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE,应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2.5病毒的鉴定 将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合

3、酶链式反应、荧 光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应1材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、 氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C（标准的附录）引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434651bp之间217bp基因片段，由上海 生物工程公司合成。序歹U为，上游弓I物 P1： 5-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3， 下游弓I物 P2： 5-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR 扩增仪，电泳仪2 操作步骤：21 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于

4、待检活猪，用已灭菌 的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收 集于离心管内，-70C反复冻融3 次, 7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则 加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。 取上清液472.51,加入25p l 10%SDS和2.5l的20mg/ml蛋白酶K，50C水 浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500p l，涡旋20s。离心取上清液，加等 量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24： 1）抽提

5、 一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20p l双蒸水溶解，-20C贮存备用。2.3. PCR的操作程序 先将制备的模板DNA置100T水浴10分钟作变性处理, 然后立即放于冰浴中。PCR反应体系为：总体积25p 1，含有50m mol/IKCl,10m mol/L Tris-HCl （pH 9.0）, 0.1%Triton X-100 100mol/L dNTPs, 0.35卩 mol/L 引物，2 m mol/L MgCl2，及 0.5U Taq 酶，1p l 模板 DNA。2常用的反应体系组成如下2.5 l2.5 l2.0 l 各2.0 lI. 0 l2.0 lII. 0 l 约 20

6、l10 X缓冲液 15mM MgCl2 dNTPs 引物 Taq 聚合酶 DNA 模板 灭菌去离子水 矿物油扩増条件为：94C变性3分钟，进入循环，94C60秒，65C60秒，72C60 秒，40个循环后72C延伸5分钟。2.4 PCR产物的检测 PCR扩增产物在1 %的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭 染色，在紫外光下观察结果。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取 PCR产物用Sall酶切，酶切产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光 下观察并与标准分子量比较，可见产生的 140bp 和 77bp 两个片段。伪狂犬病荧光抗体试验1 材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯

7、），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。溶液配制见附录D（标准的附录）2操作步骤21 样品采集 扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如 不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。本法也可用于对疑似伪狂犬病 病毒的培养物进行鉴定。2. 2切片制备 将样品组织块切成1cm X1cm的面，不经任何固定处理，直 接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求57um，将切片展贴于0.8mm X1mm 厚的洁净载玻片上。2. 3固定：将切片置纯丙酮中固定 15 分钟，取出立即放入 0.01mol/L， pH7.2 的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗34次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色

8、。2. 4染色 将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37C作用30分 钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.09.5碳酸盐 缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。2. 5 观察 将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观 察。2. 6 判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中出现明亮的黄绿色荧光，判为伪狂 犬病病毒感染阳性。伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）1 材料准备0. 25%胰酶（配制见附录B）、BHK-21细胞,多道可调微量移液器，96孔细 胞培养板,C02培养箱，倒置显微镜。2 操作步骤2.

9、1病毒半数组织细胞感染量（TCID50 ）的测定：2.1.1 病毒培养和收获 将伪狂犬病毒接种于长成单层的 BHK-21 细胞，接种 量为液体培养基量的10%,37C培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。2.1.2病毒的滴定 用DMEM培养基将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10 1 10-2每个稀释度取100L加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25% 胰酶消化的BHK-21细胞100L （细胞含量以105/mL左右 为宜），每个稀释度 作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37C 5%CO2培养箱中。2.1.3 TCID50 计算 逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细 胞老化脱落

10、为止。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50 （具体的计算示例见 附录B）。2.2中和试验将无菌采集的待检猪血清置56C水浴灭活30分钟。用DMEM培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入 50 L 培养基，随后在第一孔中 加入经待检猪血清50L混合后，用微量移液器取出50L,加到第二孔中，混 匀后取出50L再加入第三孔中，依此类推。血清稀释度即为1： 2、1： 4、1： 8，每份待检血清稀释度作24个重复。将50L含200个TCID50的病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37C作用1小时，每孔中再加入100L经胰酶 消化分散的 BHK-21 细胞，同时设病毒对照、阳性血清、阴性血清

11、，待检血清、 正常细胞对照。2.3 计算抗体中和效价 逐日观察，直至细胞对照出现老化脱落为止，按 Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。如抗体效价为1： 2及1： 2以上，则 判为伪狂犬病抗体阳性。伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）1材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶联免疫检测仪；溶液配 制见附录F（标准的附录）2 操作步骤：2.1包被将PRV抗原加入酶标板孔内，每孔100uL，37C作用1h后置4C冰 箱过夜。2.2洗涤弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干2.3封闭 各孔加入封闭液100uL 37C作用1h。按2.2步骤洗涤24 加入待检血清

12、待检血清经 56oC30 分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每 孔100uL，37C作用1h。重复2.2步骤。2. 5加入酶标抗体用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37C 作用1h。重复2.2步骤。2. 6 加入底物（OPD-H22）:每孔100uL，室温避光显色25分钟。27 终止反应 每孔加入 50uL 终止液终止反应。28测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。29血清阴阳性判定标准的确定 取60份经中和试验检测为PRV抗体阴性的 猪血清，按1:20稀释后进行间接ELISA试验，测定490nm波长处OD值，规定 以60份血清的平均OD值加上3倍标准差作为判定阴阳

13、性的临界值。伪狂犬病乳胶凝集试验 1材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液， 玻片，溶液配制见附录E（标准的附录）2 操作步骤：2 1 待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理2. 2将待检血清用稀释液作倍比稀释后，各取15“L与等量乳胶凝集抗原在洁 净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在35分钟内观察结果；可能出现以下 几种凝集结果，即：100%凝集：混合液透亮，出现大的凝集块75%凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集块50%凝集：约 50%乳胶凝集，凝集颗粒较细25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒出现如出现 50%凝集程度以上的（含

14、50%凝集程度），判为伪狂犬病抗体阳性， 否则判为抗体阴性。如为阴性，可用微量中和试验进一步检测。伪狂犬病琼脂扩散试验1 材料准备 琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清；优质琼脂粉、平皿2 操作步骤2. 1 0.8%琼脂板的制作 将1克琼脂粉溶于100毫升Tris盐酸缓冲液（Tris 6.5克，NaCl 2.9克，NaN3 0.2克，蒸馏水1000毫升，用HCl调pH值至7.2）中，趁热倾倒于玻璃平皿 上，厚度为2一3mm，待冷却凝集后，打孔，中央一孔，周围6孔，孔径为2mm，周围孔之间 距离2mm，周围孔与中央孔间距为4mm一6mm,用酒精灯微热封底。2 2 加样 将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周

15、围孔加经热灭活的待检血清，设 阴性血清和阳性血清对照。置温盒37C作用，2448小时后观察结果。2 3 结果判定 在抗原孔与待检血清孔之间出现白色沉淀线，抗体可判为阳性； 如待检血清抗体水平较低，可以观察到与待检血清相邻的阳性血清沉淀线末端略 向抗原抗弯曲。阴性血清与抗原孔之间则没有沉淀线。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验1 猪伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表 达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗 gG 蛋白的抗体。用于 伪狂犬病毒感染猪与 gG 基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。1. 1材料准备：伪狂犬病毒

16、gG蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射 gG 基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。12 操作步骤121 对照试验 检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立， 否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加 gG 蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射 gG 基因缺失疫苗血清加 gG 蛋白致敏乳胶抗 原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gG基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒 致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。122 检测试验1221 待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1. 2. 2. 2待检血清一滴，置于玻片上。加gG蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙 签混匀，

17、搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果（注：gG蛋白致敏乳胶抗 原与血清反应的凝集颗粒较细）；可能出现以下几种凝集结果，即：“+”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； “+”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少许凝集，液体呈混浊；“”液滴呈原有的均匀乳状。以出现“+”以上凝集者判为阳性凝集。2 猪伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gE鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gE基因的基因工程表 达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗 gE 蛋白的抗体。用于 伪狂犬病毒感染猪与 gE 基因缺失疫苗注苗猪的免疫

18、学鉴别诊断。1. 1材料准备：伪狂犬病毒gE蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、 伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。1.2 操作步骤1.2.1 对照试验 检测之前应做对照试验，出现如下结果试验方可成立， 否则应重试，如重试仍不出现如下结果则停止使用：伪狂犬病毒阳性血清加 gE 蛋白致敏乳胶抗原呈阳性凝集；注射gE基因缺失疫苗血清加gE蛋白致敏乳胶抗 原呈阴性凝集；伪狂犬病毒阳性血清与注射gE基因缺失疫苗血清加伪狂犬病毒 致敏乳胶抗原均呈阳性凝集。1.2.2 检测试验1. 2. 2. 1 待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理1. 2. 2. 2待检血清一滴，置

19、于玻片上。加gE蛋白致敏乳胶抗原一滴，用牙 签混匀，搅拌并摇动1-2分钟，于3-5分钟内观察结果（注：gE蛋白致敏乳胶抗 原与血清反应的凝集颗粒较细）；可能出现以下几种凝集结果，即：“+”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明； “+”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊； “+”约一半乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊； “+”有少许凝集，液体呈混浊；“”液滴呈原有的均匀乳状。以出现“+”以上凝集者判为阳性凝集。伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别 ELISA1伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gG-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物 包被的ELISA板用来

20、检测动物血清中抗gG蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染 猪与gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。1 1材料准备：gG蛋白包被的ELISA板、酶标抗体，底物（OPDH2O2）,酶 联免疫检测仪；溶液配制见附录F（标准的附录）12 操作步骤：1. 2.1加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活后用保温液作40倍稀释，每 孔加入，37 C作用30min。1. 2.2洗涤 弃去孔内液体，每孔用200uL洗涤液洗3次，每次3min,用吸水 纸拍干。1. 2.3 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔 100uL， 37C 作用30min,重复2.2步骤。1. 24 加入底物（OPD-H

21、2O2）：每孔lOOuL，室温避光显色25分钟。1. 2. 5 终止反应 每孔加入 50uL 终止液终止反应。1. 2. 6测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。测定490nm波 长处OD值，记为P值，阴性对照OD值记为N值，N值如小于0.1时，按0.1 计算，大于0.1时为实际值。当阳性对照孔OD值一阴性对照OD值大于0.25时， 试验成立。1. 2. 7 结果判定：P/N22.1判为gG抗体阳性 P/NW1.9判为gG抗体阴性， 1.9PN2.1,判为可疑2 伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断（间接法）伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断是用伪狂犬病毒gE基因的基因工程表达产物 包

22、被的ELISA板用来检测动物血清中抗gE蛋白的抗体。用于伪狂犬病毒感染 猪与 gE 基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。2. 1材料准备：gE蛋白包被的ELISA板、酶标抗体，底物（OPDH2O2），酶 联免疫检测仪；溶液配制见附录F（标准的附录）2. 2 操作步骤：2. 2.1加入待检血清 待检血清经56oC30分钟灭活后用保温液作40倍稀释，每 孔加入，37 C作用30min。2. 2.2洗涤 弃去孔内液体，每孔用200uL洗涤液洗3次，每次3min，用吸水 纸拍干。2. 2.3 加入酶标抗体 用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔 100uL， 37C 作用30min,重复2.2步骤。2

23、. 2. 4 加入底物（OPD-H2O2）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。2. 2. 5 终止反应 每孔加入 50uL 终止液终止反应。2. 2. 6测定OD值 在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。测定490nm波 长处OD值，记为P值，阴性对照OD值记为N值，N值如小于0.1时，按0.1 计算，大于0.1时为实际值。当阳性对照孔OD值一阴性对照OD值大于0.25时， 试验成立。227 结果判定：P/N22.1判为gE抗体阳性 P/NW1.9判为gE抗体阴性 1.9P0250ml7. TMB 底物60ml8.终止液60ml二、样品的准备用样品稀释液按 1：20 稀释待检血清。（如

24、20ul 样品加 380ul 样品稀释液）。注意： 阴、阳性对照不稀释。每一样品必须更换吸嘴，并记录样品在板上的位置，在样品加到酶标孔内之前必 须混合均匀。三、洗涤液的准备浓缩洗涤液（10x）应置室温并摇动使沉淀的盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤 液（10x）应用蒸馏水或去离子水接1： 10稀释（如30ml浓缩洗涤液加270ml蒸馏水或去 离子水即可用于一块板的洗涤）。四、试验过程在使用之前所有试剂必须置室温并轻轻摇动或涡旋。 1取出酶标板并记录样品在板上的位置。2. 在A1、A2、A3孔内各加未稀释的阴性对照100ul。3. 在A4、A5、A6孔内各加未稀释的阳性对照100ul。4. 加10

25、0ul已稀释的样品（1： 20）到相应的孔内，每一样品应同时做2孔。5. 室温作用 30 分钟。6. 倾去孔内液体到废液缸内。7. 每孔用近300ul的洗涤液洗3-5次，每次洗后倾去孔内的液体。在加酶标抗体之前 应避免孔内干燥，最后一次洗涤后应在吸水材料上拍干酶标板。8. 在每一孔内加入 100ul 抗猪的酶标抗体。9. 室温作用 30 分钟。10. 重复步骤 6 和 7。11. 在每一孔内加入TMB底物溶液100ul。12. 室温显色15 分钟。13. 每一孔内加入 100ul 终止剂以终止反应。14. 空气调零。15. 在650nm测量并记录样品和对照的吸收值。16. 计算结果。五、结果阳

26、性对照的平均值（PCX）与阴性对照的平均值（NCX）之差（P-N）大于或等于0.15 XX时试验方成立。而且阴性对照平均值（NCX）必须小于或等于0.15。X 如果试验不成立，可能操作有误，试验应在熟悉产品说明书后重试。每一样品内针对PRV抗体的有无是由样品与阳性对照的比率（S/P）来确定。阳性对照 已标准化且有很高水平的PRV抗体。六、结果的说明1. S/P比值小于0.4的样品确定为PRV抗体阴性。2. S/P比值大于或等于0.4的样品确定为PRV抗体阳性。在该试验中定为阳性的样品 应再用“伪狂犬病抗体确认试剂盒”来进一步证明其阳性的真假。七、计算1. 阴性对照平均值（NCX）的计算A A（

27、650） +A AX（650） +A A（650）0.06+0.063+0.069NCX= 1阳性对照平均值（PCX）的计算 A A（650） +A AX（650） +A A（650）0.313+0.299+0.33 例如：=0.064 333S/P 比值的计算Sample A（650）NCXS/P= X PCXNCX例如：某样品平均值=0.3500.350-640.286S/P= = =1.140.314-0.0640.250（华中农大覃雅丽、唐勇译）伪狂犬病gE抗体试剂盒（进口）一、试剂贮存在2-7 C1. PRV 包被酶标板6块2. 抗PRV-gE辣根过氧化物酶（HRP）连结物（酶标抗体

28、）60ml3. 阴性猪血清对照-不与 PRV-gE反应的猪血清5ml4. 阳性对照血清-抗 PRV-gE5ml5. 样品稀释液120ml6. 洗涤液（IOC235ml7. TMB 底物60ml8. 8终止液60ml二、样品的准备用样品稀释液按 1：2 的比例稀释待检血清。每一样品必须更换吸嘴，样品加到酶标孔 内之前必须混合均匀。三、洗涤液的准备浓缩洗涤液（IO*）应平衡到室温，摇动使沉淀的盐能充分溶解。在用之前，浓缩洗涤 液（10x）应用蒸馏水或去离子水按1： 10稀释（如30ml浓缩洗涤液加270ml蒸馏水 或去离子水即可用于一块板的洗涤）。四、试验过程在使用之前所有试剂必须平衡到室温，用前

29、轻轻摇动混匀。1取出酶标板在记录纸上标记好样品在板上的位置。2. 在A1、A2、A3孔内各加100ul阴性对照（1:2稀释）。3. 在A4、A5孔内加入100ul阳性对照（1:2稀释）。4. 加 100ul 已稀释的样品（1： 2）加到相应的孔内。5. 于室温放置1小时或者于2-7C过夜。6. 倾去孔内液体到废液缸内。7. 每孔用近300ul的洗涤液洗3-5次，每次3-5分钟。每次洗后倾去孔内的液体，在洗涤 的过程中应避免孔内干燥，最后一次洗涤后应在吸水材料上拍干酶标板。10. 在每一孔内加入100ul抗PRV- gE的酶标抗体。11. 室温放置20分钟。10.重复步骤 6 和 7。17. 在

30、每一孔内加入TMB底物溶液100ul。18. 室温显色15 分钟。19. 每一孔内加入 100ul 终止剂以终止反应。20. 对空调零。21. 在 650nm 测量并记录样品和对照的吸收值。22. 计算结果。五、结果阳性对照的平均值(PCX)与阴性对照的平均值(NCX)之差(P-N)大于或等于0.3 XX时试验方成立。如果试验不成立，可能操作有误，试验应在熟悉产品说明书后重试。每一样品内针对PRV-gE抗体的有无是由样品与阴性对照的比率(S/N)来确定。六、结果的说明3. S/N比值小于或等于0.60的样品确定为PRV-gE抗体阳性。4. S/ N比值小于或等于0.7但是大于0. 6的样品应该重新检测，如果检测结果还是如此, 则应跟踪该动物，过一段时间之后再进行检测。5. 如果S/N值大于0.7,则该样品中没有抗PRV-gE的抗体，呈阴性反应。注意：为了确证，所有的阳性样品都需要做重复。七、计算4. 阴性对照平均值(NCX)的计算A A( 650) +A AX( 650) +A A( 650)NCX= 12 3 35. 阳性对照平均值(PCX)的计算A4A( 650) +A5AX( 650)NCX= 4 52 S/N比值的计算Sample A( 650)S/N= NCXX(华中农大覃雅丽、唐勇译)NCX= 4 56 例如：=0.314