完整版生长曲线的测定

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1、实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术 指导教师：张建丽姓名：高熹学号：1120152430测定细菌生长曲线一. 实验目的1 通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解细菌生长的特点，综合训练微生物实验 的基本实 验技能。2. 巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。3. 掌握用比浊法测定细菌的生长曲线。二. 实验原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行 培养，一 定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐 标，绘制的曲线叫 生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培 养时所表现出的群体生长规 律。依据其生长速率的不同，一般可

2、把生长曲线分为 延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。 将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基 中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、 对数生长期、稳定期和衰亡期四个 阶段。延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程 （不适应 者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长 短因素种、接种菌 量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为 1 4 小时。此期 中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中 间代谢产 物。对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的 几何级数 极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及

3、细菌代时而异） 。 此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研 究细菌性 状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。 稳定期：该期的生长菌群总 数处于平坦阶段， 但细菌群体活力变化较大细菌浓度 达到最大即环境最大容纳量。由于培 养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响， 细菌繁殖速度渐趋下降，相对细 菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平 衡。细菌形态、染色、 生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、 抗生素、以及 芽抱等。衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌

4、数 与培养时 间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩 认其形。生理代谢 活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响， 不会出 现象培养 基中那样典型的生长曲线。 掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病 原菌的生长，发现 和培养对人类有用的细菌。这 4 个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。 因此 通过测定 微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重 要的指导意义。测定微生物的数量有多种不同的方法， 可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度

5、与光密度（0D值）成正比，因此可利用 分光光度 计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的0D值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。三. 实验设备及材料准备好的大肠杆菌和枯草杆菌菌液、营养肉汤培养基、紫外可见分光光度计、比色 皿、恒温摇床、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、酒精灯、电炉、接种环、试管架、 锥形瓶、无菌吸管、烧杯、乳胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等。四. 实验方法步骤及注意事项实验步骤：配制营养肉汤培养基7营养肉汤培养基灭菌7配制大肠杆菌菌液标记f接种 f培养f测定f绘制生长曲线1. 配制营养肉汤培养基：以1000ml记，牛肉膏：3.0g、

6、蛋白胨：100g、NaCI:50g、 水：1000ml、pH:7.47.62. 营养肉汤培养基灭菌：将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121 C灭菌15mi n.3. 接种:用1mL无菌移液管分别移取1mL大肠杆菌菌液和1ml的枯草杆菌菌液至锥形瓶 中，并充分震荡均匀.4. 培养:将锥形瓶置于37 C下在恒温摇床上培养（150r/min ）。然后分别按对应时 间将锥形瓶取出，待培养结束时测定0D值。5. 测定:将培养的大肠菌群菌液用无菌移液管移取到比色皿中，选用600nm分光 光度计 上调节零点，用蒸馏水作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进 行测定，对浓度 大的菌悬液用自来水适当稀

7、释后测定，使其ODfi大约在0. 20.8之间，经稀释后测得 的0D值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的0D值。6. 绘制生长曲线：对所得数据进行生长曲线的绘制，分析实验结果。五. 实验结果大肠杆菌:时/mi n间0150250310340370400430460490520550Od0.60.81.52.02.33.13.53.74.04.45.05.2（倍 换算）数386766550000320808646429枯草杆菌:时间 /mi n0150250310340370400430460490520550Od0.50.30.30.20.30.50.70.91.21.61.72.2（倍 数换

8、算）619953992958744264145814六. 实验结果分析32O4 OU绘制枯草杆菌生长曲线绘制大肠杠;菌生长曲线1002U0JOO250 50bOO100 200JOC15UU标出生长曲线中1. 随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，大肠杆菌培养瓶味道很难闻，是因为大肠杆菌增长迅速，后来数量达 到顶峰， 此时培养基内的营养物质已被消耗殆尽， 大肠杆菌进行营养和空间的竞 争，有些大肠杆菌 死亡，最后数量不断减少，直至变为0。2. 通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解了细菌生长的特点，是:刚开始时细菌缓慢增长，后来增长迅速，呈“ J”型，最后细菌

9、生长缓慢，一段数量达到顶峰，在 时间内保持不变。3. 由实验结果来看，两个菌培养菌在对数期，未到衰亡期， 短， 考虑到测量的时间太10 个小时左右，因此，未到衰亡期。七. 思考题1. 绘制大肠杆菌和枯草杆菌在两种接种方法下的生长曲线。四个时期的位置和名称） 答：绘制出了生长曲线，只观察到了平缓期和对数期，大肠杆菌观察到即将开始 平稳期。2. 为什么用比浊法测定的细菌生长只是表示细菌的相对生长状况？ 答：因为比色法只能判断菌的相对密度， 而没有办法区分活菌和死菌，因此只能 表示细菌 的相对生长状况。3. 生长曲线中为什么会出现稳定期和衰退期？在生产实践中怎样缩短延迟期？ 怎样延长对数期及稳定期？

10、怎样控制衰退期？ 答：培养基的营养有限，在菌的数量达到环 境允许最大值时， 同种菌之间竞争剧 烈，故出现稳定期，随着营养的进一步消耗，菌没有足够的营养，出 现死亡，所 以出现了衰退期。缩短延迟期，可以采用营养成分与原来相近的培养基， 或 者采 用该种菌原来类似的生长条件与营养。延长对数期和稳定期，恒化器可以将微生 物保持在 对数期进行研究，恒浊器可以使细菌连续生长。控制衰退期可以及时补 充营养，分离出死 菌。4. 接种时种子在什么条件下为宜，液体种子比斜面种子为什么优越？ 答：左手持皿用拇指、食指和中指将皿盖揭开约 20-30 度左右,角度越小遭空气 污染的可 能性越小，并靠近酒精灯附近操作。右手持接种环，先在酒精灯灭菌， 然后取菌液，将沾 菌接种环在培养基的边缘划原始线， 而后使接种环在指力作用 下作轻快的滑移动作，从培 养皿的一个边缘滑向另一个边缘，滑动时用力要均匀， 切勿将接种环嵌入培养基内。 主要是活化菌种，调整菌种的生理生化状态。液体培养比固体发酵通气效果好， 利于大量 菌体生长。八. 实验反思1.应用一台仪器和一个比色皿测量，消除系统误差。2. 在比色皿中加液时，稀释时应该用枪头吹打均匀。