目标产品的蛋白质分析检测.ppt

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1、目标产品的蛋白质分析检测技术与质量控制曹 纯 洁 2 主要内容 蛋 白 质 含 量 和 纯 度 氨 基 酸 的 分 析 蛋 白 质 的 分 子 量 测 定蛋 白 质 的 等 电 点肽 谱蛋 白 质 突 变 点 的 分 析蛋 白 质 的 二 硫 键 的 分 析 3 一 、 蛋 白 质 含 量 和 纯 度 蛋 白 质 浓 度 测 定 的 方 法 ： 凯 氏 定 氮 法 （ 繁 琐 ） 、 TCA比 浊法 、 双 缩 脲 法 （ 需 样 品 量 大 ,不 够 灵 敏 ） 、 福 林 -酚 法 和 紫外 线 法 。 已 知 摩 尔 消 光 系 数 时 ， 可 准 确 的 计 算 出 蛋 白 浓 度 ：

2、 公 式A=CL。 L为 内 径 。 C为 摩 尔 浓 度 。摩 尔 消 光 系 数 （ ） 的 定 义 为 ： 在 特 定 条 件 下 ， 一 定 波 长的 光 ， 光 径 为 1.00cm时 ， 通 过 所 含 吸 光 物 质 的 浓 度 为1.00 mol/L时 的 吸 光 度 。 未 知 摩 尔 消 光 系 数 时 ， 可 测 280nm和 260nm光 吸 收 值 ，用 公 式蛋 白 质 浓 度 （ mg/ml） =1.55A 280-0.76A260 =1.45A280-0.74A260 4 考 马 斯 兰 G-250法 ： 此 试 剂 在 酸 性 条 件 下与 蛋 白 反 应 ，

3、 当 吸 收 峰 由 465nm转 移 到 595nm，灵 敏 度 高 ， 测 定 蛋 白 的 浓 度 范 围 广 。 遗 传 工 程 产 品 蛋 白 质 的 纯 度 要 求 ： 95%、99%、 99.9%。 常 用 鉴 定 蛋 白 纯 度 的 方 法 ： 聚 丙 烯 酰 胺凝 胶 电 泳 和 SDS-PAGE、 毛 细 管 电 泳 （ CE） 、等 电 聚 焦 （ IEF） 、 HPLC（ 包 括 凝 胶 过 滤 、各 种 反 相 HPLC、 离 子 色 谱 、 疏 水 色 谱 ） 5 五 种 蛋 白 质 测 定 方 法 比 较方 法 灵 敏 度 时 间 原 理 干 扰 物 质 说 明凯

4、氏定 氮法 灵 敏 度 低 ，适 用 于 0.2 1.0mg氮 ， 误差 为 2 费 时 8 10小 时 将 蛋 白 氮 转 化 为氨 ， 用 酸 吸 收 后滴 定 非 蛋 白 氮（ 可 用 三 氯乙 酸 沉 淀 蛋白 质 而 分 离 ） 用 于 标 准 蛋 白 质 含 量 的 准 确测 定 ； 干 扰 少 ； 费 时 太 长双 缩脲 法 灵 敏 度 低1 20mg 中 速 2030分 钟 多 肽 键 碱 性Cu2 紫 色 络 合物 硫 酸 铵 ；Tris缓 冲 液 ；某 些 氨 基 酸 用 于 快 速 测 定 ， 但 不 太 灵 敏 ；不 同 蛋 白 质 显 色 相 似紫 外吸 收法 较 为

5、 灵 敏50 100g 快 速 5 10分 钟 蛋 白 质 中 的 酪 氨酸 和 色 氨 酸 残 基在 280nm处 的 光 吸 收 各 种 嘌 吟 和嘧 啶 ；各 种 核 苷 酸 用 于 层 析 柱 流 出 液 的 检 测 ；核 酸 的 吸 收 可 以 校 正Folin 酚试 剂法 灵 敏 度 高 5g 慢 速 40 60分 钟 双 缩 脲 反 应 ； 磷钼 酸 磷 钨 酸 试剂 被 Tyr和 Phe还原 硫 酸 铵 ；Tris缓 冲 液 ；甘 氨 酸 ；各 种 硫 醇 耗 费 时 间 长 ； 操 作 要 严 格 计时 ；颜 色 深 浅 随 不 同 蛋 白 质 变 化考 马斯 亮蓝 法 灵

6、敏 度 最 高1 5g 快 速5 15分 钟 考 马 斯 亮 蓝 染 料与 蛋 白 质 结 合 时 ，其 max由 465nm变 为 595nm 强 碱 性 缓 冲液 ；TritonX-100;SDS 最 好 的 方 法 ；干 扰 物 质 少 ；颜 色 稳 定 ； 颜 色 深 浅 随 不 同 蛋 白 质 变 化 6 新 的 方 法 ： 如 质 谱 法 ， 仅 pmol的 样 品 就能 测 定 ， 同 时 能 给 出 分 子 量 。 注 意 ： 只 用 一 种 鉴 定 蛋 白 纯 度 的 方 法 是 不够 ， 往 往 几 种 （ 方 法 ， 机 理 ） 结 合 使 用 。 7 二 、 氨 基 酸

7、 分 析 检 测 法 的 种 类 ： 氨 基 酸 进 行 UV检 测 只 能 利 用 羧 基 （ -COOH）在 200 210nm处 的 吸 收 。 一 部 分 具 有 苯 环 的氨 基 酸 也 可 在 250 280nm检 测 ， 但 是 ， 一 般对 原 物 质 （ 氨 基 酸 ） 进 行 高 灵 敏 度 、 良 好 选 择性 的 分 析 比 较 困 难 。 因 此 ， 很 早 以 来 就 使 用 衍 生 法 ， 利 用 许 多 氨基 酸 构 造 中 存 在 的 氨 基 （ -NH2， -NHR） ， 使用 与 该 基 团 可 进 行 选 择 性 反 应 的 衍 生 试 剂 。 检 测

8、的 仪 器 ： HPLC或 氨 基 酸 分 析 仪 8 两 类 方 法 ： 柱 后 反 应 法 ： 将 游 离 的 氨 基 酸 经 色 谱 柱 分 离 后 ， 氨 基酸 再 与 显 色 剂 （ 茚 三 酮 吸 光 度 检 测 、荧 光 胺 、 邻 苯 二 甲 醛 荧 光 检 测 ） 作 用 ，然 后 导 入 检 测 器 。 优 点 ： 反 应 可 自 动 化 ， 定 量 定 性 、 重 现 性 优 异 。 由 于 反 应 前 试 样 成 分 在 柱 中 分 离 ， “ 杂质 ” 被 去 除 ， 比 较 稳 定 。 9 柱 前 衍 生 法 ： 将 各 种 氨 基 酸 和 荧 光 试 剂 先 作

9、用 生 成 衍 生物 ， 再 分 离 ， 直 接 检 测 衍 生 物 的 荧 光 。 特 点 ： 反 应 系 统 小 ， 试 剂 用 量 少 。 可 使 用 高 价 格 的 试 剂 ， 低 背 景 ， 可 提 高 灵敏 度 。 即 使 检 测 出 未 反 应 试 剂 ， 但 经 柱 分 离 ， 也不 会 影 响 检 测 。 10 氨 基 酸 水 解 方 法 ： 通 常 是 5.7mol/L HCl真 空 状 况 下 110 水 解 24h，也 有 在 150 下 快 速 水 解 4h。 不 同 条 件 下 ， 各 种 氨 基 酸 的 回 收 有 所 不 同 ， 且有 的 氨 基 酸 会 遭 受

10、 破 坏 （ 如 色 氨 酸 ） 。 保 证 氨 基 酸 分 析 准 确 性 的 方 法 ： 过 去 用 胰 岛 素 为 标 准 样 品 来 判 断 ， 近 年 来 采 用 “ 测 试 肽 法 ” ， 即 将 20种 常 见 氨 基酸 人 工 合 成 一 个 20肽 。 然 后 水 解 ， 每 种 氨 基 酸残 基 出 现 频 率 是 1， 易 于 校 正 回 收 。 11 新 的 方 法 ： 毛 细 管 电 泳 ， 仅 需 ng的 量 ， 分 辨 率 和 准确 性 均 比 SDS-PAGE好 。 质 谱 ， 灵 敏 度 和 准 确 性 都 很 好 ， 精 确 度达 0.01%。 12 13

11、三 、 蛋 白 质 分 子 量 的 测 定 早 期 方 法 ： 超 离 心 、 光 散 射 法 ， 需 较 高 级仪 器 和 较 多 的 样 品 ， 现 很 少 使 用 。 凝 胶 过 滤 法 测 蛋 白 质 分 子 量 。 如 Sephadex系 列 （ G75、 G100） 等 HPLC凝 胶 过滤 系 统 。 测 定 是 完 整 蛋 白 质 分 子 量 。 实 验 室 常 规 方 法 ： SDS-PAGE， 用 量 约1ug， 误 差 为 5-10%， 但 方 便 。 测 定 蛋 白 质亚 基 的 分 子 量 。 14 毛 细 管 等 电 聚 焦 电 泳 -电 喷 雾 质 谱 技 术（

12、CIEF-MS） ： 分 辨 率 极 高 ， 能 分 辨 的 等电 点 差 异 小 于 0.04pH。 一 些 标 准 样 品 用 此 法 分 析 可 发 现 亚 型 （ 分子 量 完 全 一 样 ， 等 电 点 不 同 ） 的 存 在 。 如 细 胞 色 素 C两 个 亚 型 分 别 为 9.60、 9.55。一 般 的 方 法 根 本 无 法 分 辨 。 15 四 、 蛋 白 质 的 等 电 点 等 电 聚 焦 法 ： 可 以 测 定 蛋 白 质 的 等 电 点 ， 同 时 可鉴 定 蛋 白 的 纯 度 。 毛 细 管 等 电 聚 焦 法 ： 能 测 定 偏 碱 性 的 蛋 白 质 的 等

13、电 点 ， 如 天 花 粉 蛋 白 的 等 电 点 测 定 。 16 五 、 肽 谱 肽 谱 技 术 ： 是 指 蛋 白 质 被 酶 解 或 化 学 降 解 后 肽段 的 分 离 分 析 或 制 备 。1、 裂 解 方 法 ： 用 酶 或 化 学 法 裂 解 蛋 白 质 成 肽 段 。 酶 解 ： 胰 蛋 白 酶 （ 切 碱 性 氨 基 酸 如 Arg,lys的 C端 ） Lys-C内 肽 酶 只 作 用 于 Lys-X键 ； 梭 菌 蛋 白 酶 只 作 用 于 Arg-X键 。 V8蛋 白 质 只 专 一 作 用 于 负 电 性 氨 基 的 C端（ Glu,Asp） ； 在 pH=4条 件

14、下 ， V8只 作 用 于Glu-X键 。 17 化 学 裂 解 ： 最 常 用 的 是 溴 化 氰 ， 作 用 于 Met C端 和其 次 一 个 AA的 肽 键 。 如 -干 扰 素 有 4个 Met， 可 被 裂 解 成 5肽 段 。 BNPS-3甲 基 吲 哚 、 N-氯 代 琥 珀 酰 亚 胺作 用 于 Trp-X键 上 ； 2-硝 基 -5硫 氰 基 苯 甲 酸 作 用 在 X-Cys键上 ； 羟 胺 作 用 在 Asn-Gly键 上 。 18 2、 肽 谱 分 析 HPLC主 要 是 用 RP-HPLC根 据 肽 的 长 短 和 疏 水 性来 分 离 。 当 肽 亲 水 性 强

15、， 用 HPLC不 能 带 留 在 柱 内 ， 达 不到 分 辨 效 果 ； 或 当 肽 疏 水 性 很 强 ， 粘 在 柱 上 洗 不下 来 时 ， 可 用 CE来 进 行 。 SDS-PAGE： 当 裂 解 成 的 肽 段 较 大 时 ， 可 进 行 。当 对 于 小 分 子 肽 时 ， 往 往 无 法 分 辨 。 质 谱 分 析 蛋 白 质 的 酶 解 产 物 ， 多 肽 出 现 先 后 按 分子 量 大 小 排 列 。 19 六 、 蛋 白 质 突 变 点 的 分 析例 子 ： 133AA， 第125是 一 游 离 Cys， 第 58位 和 第 105位 半 胱 氨 酸 形 成 二硫

16、键 （ 活 性 必 需 ） 。鉴 定 IL-2的 蛋 白 质 工 程 (Cys-Ser/Ala)突 变 点 ： 用TPCK-胰 蛋 白 酶 水 解 后 ， 进 行 RP-HPLC分 离 分 析 。 天 然 IL-2和 新 型 IL-2的 酶 解 图 谱 比 较 寻 找 有 差 别 的肽 进 行 顺 序 分 析 ； 荧 光 标 记 Cys残 基 ， 比 较 标 记 前 后 新 型 IL-2酶 解 图谱 的 差 别 ， 从 而 鉴 别 出 点 突 变 的 肽 ； 同 位 素 标 记 法 ； 利 用 IL-2只 有 一 个 色 氨 基 酸 ， 280nm主 要 是 色 AA吸收 其 次 是 酪 AA

17、和 苯 丙 氨 酸 ， 酶 解 后 分 别 用 214nm和280nm检 测 ， 可 找 到 含 色 AA的 肽 段 用 CE确 定 为均 一 AA序 列 分 析 证 实 新 型 IL-2的 Ser（ 125）取 代 了 Cys。 20 酶 解 后 ， 用 液 质 分 析 ， 寻 找 与 理 论 值 分 子 量 不 一 致的 肽 段 。 21 新 的 方 法 ： CE-MS联 机 来 检 测 IL-2突 变 点 ，更 快 速 和 准 确 。 22 七 、 蛋 白 质 的 二 硫 键 分 析 二 硫 键 的 错 配 ， 生 物 活 性 只 有 原 来 的 1/400。 分 析 方 法 ： IL-

18、2（ 3个 Cys） ： 用 同 位 素 标 记 ， pH=8.5用 3H-碘 代 乙 酸 处 理 IL-2， 只 有 游 离 的 巯 基 才 与 其 作 用 ，然 后 还 原 ， 再 用 14C-碘 代 乙 酸 烷 化 。 故 如 3H-标记 仅 在 肽 11上 ， 14C-的 放 射 性 全 在 肽 12和 肽 14上 ，则 和 天 然 结 构 是 一 致 的 。 SOD（ 3个 Cys） :可 用 同 样 的 方 法 。 直 接 分 析 二 硫 键 的 异 构 物 。 IL-2在 碱 性 条 件 下 形成 二 硫 异 构 体 （ 58与 125位 或 105与 125形 成 二 硫键 ） ， 反 相 色 谱 中 ， 它 们 的 疏 水 性 弱 些 ， 较 早 被洗 脱 出 来 。