脐血干细胞分化与应用.ppt

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1、干细胞医疗论坛http:/ “干细胞”的概念在数十年前就已有介绍，但是直到目前，仍然还无法从形态或表型界定干细胞，而只能根据其功能定义。干细胞具有两种特定的功能。 增殖功能指干细胞具有自我更新能力，可以生成更多的干细胞； 分化功能则指干细胞能分化成为各种祖细胞，后者可以进一步分化成各种特定成熟细胞系。因此，目前干细胞的最好界定方法是功能学法 。 胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)被认为是最多能的干细胞群体 ，具有最大的发展潜能，对胚胎细胞或组织的利用还存在伦理学争议 。成体干细胞。在许多成人组织中已经发现有多种干细胞群体存在，如骨髓中的造血干细胞，以及其他骨髓衍生干细

2、胞(BMSC) 能分化为血细胞和多种组织细胞。为了避免潜在的伦理学问题，克服免疫不相容性，在未来的组织工程中自身成人干细胞可能成为理想的选择。 脐带血干细胞的特性和用途可能有效地替代骨髓和外周血。 体外实验技术以识别干细胞表面标记物作为基础，如CD34、AC133、STRO-1和神经营养素受体p75等已经用于干细胞的纯化实验，包括细胞淘选、荧光激活细胞分类、免疫磁性选择和免疫吸附柱分离等。目前有证据表明，如果利用某种单一的标记物分子进行干细胞分离，而对不表达该标记物的新干细胞群体尚未充分研究，则不能完全肯定分离结果。例如，干细胞活性与CD34分子在细胞膜上的表达不完全相关，小鼠体内存在一大群“

3、静默”干细胞，它们不表达CD34分子但仍具有完整的重建能力。在人体内也发现存在类似的CD34阴性休眠生血干细胞。因此，在未来实验中应设计新的方案，以成熟细胞系的标记物作为细胞转移基础会更有效。 为了克服干细胞数量少的不足，众多学者已经在探索干细胞的体外扩增方法。但是，如何在长期的扩增过程中使干细胞不分化而又保持其多系分化能力成为一大难题。在干细胞临床实际应用中，理论上认为需要一个无基质、无血清的体外系统，并用已知的细胞因子和生长因子维持。 白细胞介素-3(IL-3)、干细胞因子(SCF)和Flt-3配体(FL)具有非细胞系特异性的早期生血刺激作用，可用于脐血干细胞的增殖培养。血小板衍生生长因子

4、(PDGF)-BB和表皮生长因子(EGF)是最有效的人类骨髓衍生干细胞克隆生长支持因子 。从人类发育中的脑皮层中已成功分离出神经前细胞，并利用表皮生长因子和纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)使其扩增。 进一步的研究，如系统性分析生长因子受体的表达，将有助于设计新的干细胞体外扩增培养方案。 在干细胞研究中，热点之一是调控细胞向预定群体分化 。过去数年间，关于干细胞在体内以及体外分化成各种成熟细胞的报道大批涌现。干细胞最重要的细胞外调控信号之一是生长和分化因子。转化生长因子- (TGF- )家族成员对胚胎干细胞和神经脊干细胞有显著的促分化效应，Wnt家族分子在多种不同的细胞分化中也起着重要作用。

5、但是，由于还无法得到纯化的功能性Wnt蛋白，对于多种Wnt因子的确切效应的更深入研究受到了限制。除了各种分泌因子外，整合膜蛋白和整合素、细胞外基质在干细胞调控微环境中也发挥作用。 细胞产生的具有生物学活性的小分子蛋白质。 产生和作用的高效性、多样性、瞬时性。细胞因子的作用通过与细胞表面相应受体结合而起作用。一般培养细胞中细胞因子的使用量为5ng100ng/ml,有量效关系。细胞因子间有协同作用、相加作用、拮抗作用用于细胞增殖的细胞因子造血干细胞：Flt-3 ligand, SCF, TPO, IL-3, IL-7, IL-11树突状细胞：GM-CSF, G-CSF, IL-1beta, IL-

6、4, TNF alpha神经干细胞：EGF, FGF-basic间充质干细胞：EGF, PDGF-AA胚胎干细胞：FGF-basic用于细胞分化诱导的细胞因子Activins, BMPs, Cripto-1, Dkk-1, FGF-8, GDFs, Lif, Nodal, Noggin, Notch, Shh, TGF beta, Wnts 造 血 干 细 胞CD133、 CD34等 + 间 充 质 干 细 胞CD13、 29、 44、 105等 +SCF、 CSF 、 IL-3,6 等可 刺 激 细 胞 扩 增 采 用 密 度 梯 度 离 心 法和 贴 壁 法 分 离采 用 密 度 梯 度

7、离 心 法和 免 疫 磁 珠 法 分 离 调 整 培 养 基 偏 酸 性 ，1%pen-strep不 同 诱 导 分 化 条 件 分化 为 不 同 细 胞 脐 血 造 血 干 细 胞 的 含 量 等 于 或 超 过 骨 髓 。 造 血 谱 系 标 记 ,如 CD3、 CD14、CD19、 CD34、 CD45 等 呈 阳 性 。 在 体 外 对 脐 血 祖 细 胞 进 行 培 养 ,发 现 使 用SCF 加 G-CSF、 GM-CSF、 IL-3、 IL-6等 作 为 刺 激 因 子 培 养 ,细 胞 集 落 形 成 增 加 ,脐 血 中 的 造 血 干 细 胞 有 更 大 的 潜 在 分 化

8、 和 增 殖 能 力 。 从 脐 血 中 分 离 出 单 核 细 胞 ,在 体 外 培 养 ,贴 壁 细 胞 形 态 表 现 为 破 骨 细 胞 样 细胞 和 间 充 质 样 细 胞 两 种 ,间 充 质 样 细 胞 表 达 多 种 间 叶 祖 细 胞 (MPCs) 的 相关 抗 原 ( SH-2 、 SH-3 、 SH-4 、 ASMA、 MABl470、 CDl3 、 CD29、CD44、 CD105) 。 用 含 2 %和 5 %较 低 血 清 浓 度 的 条 件 下 ,脐 血 单 个 核 细 胞可 分 化 成 较 为 均 一 的 间 充 质 样 细 胞 ,并 可 以 在 数 量 上 扩

9、 增 的 同 时 ,保 持 其 多向 分 化 的 潜 能 ， 在 一 定 条 件 下 可 以 诱 导 分 化 为 神 经 细 胞 、 骨 细 胞 、 软 骨细 胞 、 肌 细 胞 、 脂 肪 细 胞 、 心 肌 细 胞 、 肝 细 胞 等 。 采 用 MiniMACS分 选 系 统 分 离 脐 血 CD34 +细 胞 ,其 纯 度 可 达 到 (83. 13 10. 73) %,得 率 一 般 为 1%。 采 用 新 鲜 的 脐 血 分 离 CD34 + 单 个 核 细 胞 。 一 般 (2 5) 108脐 血 单 个 核 细胞 能 分 离 出 (3 5) 106 CD34 +细 胞 。 脐

10、血 、 成 人 外 周 血 和 骨 髓 CD34+含 量 （ x S） 标 本 标 本 数 （ n） CD34+含 量 （ %） 成 人 骨 髓 7 3.19 1.05* 脐 血 48 2.14 1.23* 成 人 外 周 血 48 0.19 0.14 *骨 髓 与 脐 血 比 较 P0.05； *脐 血 与 外 周 血 比 较 P0.001 骨 髓 与 外 周 血 比 较 P0.001 脐 血 中 CD34+含 量 与 新 生 儿 性 别 、 体 重 、 脐 血 血 象 和 产 妇 年 龄 的 关 系 （ 1） 脐 血 中 CD34+含 量 与 新 生 儿 性 别 关 系 ： 男 性 CD3

11、4+细 胞 百 分 率 为 1.87 0.79 女 性 CD34+细 胞 百 分 率 为 2.51 1.49 两 者 比 较 有 显 著 性 差 异 （ P0.05） （ 3） 脐 血 血 象 与 脐 血 CD34+细 胞 含 量 关 系 无 相 关 性 （ P0.05） 脐 血 和 成 人 外 周 血 淋 巴 细 胞 表 型 及 NK细 胞 活 性 （ x S） 脐 血 成 人 血 CD3 50.0 12.4 73.3 8.9 CD4 40.1 12.4 40.7 7.1 CD8 13.8 4.3 27.0 5.5 CD4/CD8 3.2 1.5 1.6 0.4 CD16 16.9 6.2

12、11.9 6.3 NK-A 17.8 12.4 40.8 21.6 脐 血 与 成 人 血 比 较 ， P0.01。 脐 血 清 与 成 人 外 周 血 清 中 IL-2、 TNF、 SIL-2R水 平 （ x S） 标 本 样 品 数 量 IL-2 （ pg/ml） TNF （ pg/ml） SIL-2R （ pg/ml）脐 血 40 42 40 181.4 113.3 5.51 0.92 214.0 96.1 成 人 血 37 35 37 305.2 125.4 7.45 1.58 112.1 72.5 P值 0.01 0.01 0.01不 同 血 清 培 养 体 系 中 脐 血 CFU-

13、GM产 率 （ x S， n=5） 刺 激 因 子 脐 血 清 脐 血 清 +GM-CSF 胎 牛 血 清 胎 牛 血 清+GM-CSF 集 落 产 率 / 10.6 3.8 37.4 11.6* 0 12.8 4.0 1 10 5 细 胞 *脐 血 清 与 胎 牛 血 清 比 较 P0.01 脐 血 清 对 脐 血 细 胞 有 体 外 促 增 殖 作 用 ， 而 胎 牛 血 清 则 无 此 作 用 ， 说 明 脐 血清 含 有 促 CFU-GM生 长 的 造 血 活 性 物 质 。在 培 养 体 系 中 加 入 GM-CSF时 ， 集 落 数 都 增 加 ， 但 脐 血 清 组 增 加 显

14、著 ， 说明 脐 血 清 中 含 有 与 外 源 性 GM-CSF协 同 因 子 。 脐 血 清 与 成 人 外 周 血 清 中 集 落 刺 激 活 性 （ CSA） 、 白 细 胞 介素 3（ IL-3） 、 粒 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 （ GM-CSF） 水 平 脐 血 、 成 人 血 清 中 CSA、 IL-3、 GM-CSF活 性 比 较 （ x S） 血 清 脐 血 清 （ U/ml） 外 周 血 清 （ U/ml） CSA 248.30 155.97 4.38 1.89 GM-CSF 197.78 111.01 112.09 91.91* IL-3 638.3 20

15、5.9 66.8 39.3 脐 血 中 含 有 高 水 平 的 CSA， 之 中 以 IL-3含 量 为 主 ， 而 GM-CSF含 量 很 低 。 t值 12.9， P值 0.001 研 究 方 法 ： 1 粒 系 集 落 计 数 法 2 脐 血 粒 巨 噬 细 胞 集 落 形 成 单 位 （ CFU-GM） 微 量 培 养 法 3 MTT法 (1) 来 源 丰 富 ,易 于 获 得 ; (2) 取 血 时 对 于 母 体 和 婴 儿 均 无 痛 苦 ; (3) 脐 血 可 以 长 期 储 存 ; (4) 发 生 移 植 物 抗 宿 主 病 的 发 生 率 低 ; HLA-DR、 CD80、

16、 CD86 阴 性 表 达 ;其 中 ,HLA-DR位 点 是 异 基 因 移 植 时 免 疫 排 异 反 应 发 生 的 主 要 位 点 ;CD80 和CD86 是 移 植 物 抗 宿 主 病 (GVHD) 发 生 的 最 重 要 共 刺 激 通 路 B7/ CD28 的 信号 分 子 。 (5) 脐 血 中 含 各 种 原 始 细 胞 如 造 血 干 细 胞 、 间 充 质 干 细 胞 ,具 有 较 强 的 增 殖分 化 的 能 力 ; (6) 脐 血 中 各 种 病 毒 感 染 的 几 率 相 对 较 少 。 近 年 来 ,脐 血 由 于 其 独 特 的 生 物 学 特 点 ,储 存 数

17、 量 及 进 行 脐 血 治 疗 的 患 者 日益 增 多 。 SCF/CSF/IL-3等刺激细胞扩增 bFGF/EGF/NGF/IGF等促进细胞定向分化CD34+细 胞 向 神 经 元 样 细 胞 的 分 化 多 种 细 胞 因 子 的 组 合 会 更 好 。 但 细 胞 因 子 和 细 胞 因 子 之 间 存在 协 同 作 用 、 拮 抗 作 用 、 叠 加 作 用 等 IL-3能 促 进 G0期 造 血 干 细 胞 （ 静 默 干 细 胞 ） 进 入 细 胞 增 殖 周期 ， IL-6可 协 同 IL-3支 持 多 能 干 细 胞 分 化 增 殖 。 脐血单个核细胞106/cm2 接种于

18、MesencultTM培养液(Stem Cell 公司) 中,调整培养基偏酸性，1%pen-strep ，37 、5 %CO2培养。1 周后,更换培养基,弃掉未贴壁细胞。以后每3 d 换液1 次。细胞长到80 %融合时,用1 1 的2. 5 g/L 的胰蛋白酶和0. 2 g/L EDTA 混合液消化(在显微镜下控制消化时间) ,以8. 0 103/cm2 的密度接种于传代培养瓶中进行扩增培养。 定向诱导 MSCs 向神经元样细胞分化：取传至第 3 代的 MSCs 按 4105/L 密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，用含有 1mmol/L -巯基乙醇的DMEM（20FCS）预

19、诱导 24h，PBS 洗涤 3 遍后，换成含 10g/L 二甲基亚砜和 100mmol/L 丁化羟基苯甲醚的无血清 DMEM进行诱导，每隔 30 分钟在倒置相差显微镜观察细胞型态变化。 贴 壁 细 胞 以 间 充 质 细 胞 为 主 ，同 时 有 大 量 破 骨 样 细 胞 传 代 后 ， 破 骨 样 细 胞 减 少 ，逐 渐 形 成 MSCs 传 代 1-2周 后 ， MSCs融 合 ，增 殖 能 力 强 心血管、脑血管、外周血管等缺血性病变引起多种临床疾病，如冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脉管炎、股骨头坏死、糖尿病足等 . 10几年前人们已开始血管再生的试验研究和临床应用。如将VEGF 质粒直

20、接注入闭塞的外周动脉,4 周后血管造影显示侧支血管增加,多普勒超声检查示血流量增加80 % ,外周动脉闭塞的间歇性跛行和冠心病应用中有明显疗效。近年,内皮前体细胞( EPC) 与血管新生的关系及在治疗性血管新生中的作用受到特别的注意。 成年后EPC 主要分布于骨髓,外周血液中也有少量EPC ,约为24 EPC/ ml , 在急性心肌梗死时为10 40 EPC/ ml ,脐带血中可达10004000 EPC/ ml ,其特异的细胞表面标志为CD34 + 、Flk21 + 与AC133 + 。 VEGF 是EPC 的增殖与分化的必需诱导因子, GM-CSF 也促进EPC 的增生与分化, 而血管抑制

21、素(angiostatin) 起抑制作用。此外,他汀类药物可将EPC 从骨髓动员至外周血并增加其功能与活性。动物实验： 1）给后肢缺血的裸鼠注入人脐血EPC 能显著增加局部血流量与微血管密度。 2）给心肌梗死的裸鼠静脉注射EPC 可促进新血管的形成,并减少缺血心肌细胞的凋亡。 3）年幼(3 月) 小鼠骨髓EPC 能促进老年(18 月) 小鼠的心肌血管增生与心脏功能改善。 4）将VEGF 基因转染至EPC ,使后者具有更高的增殖活性与功能,动物实验已证实,转染有VEGF的EPC 增加细胞的增殖与参与血管形成,促进缺血心肌与肢体的血管新生,达到改善功能与保护肢体的目的。 Lygase Closed

22、 CircleCohesive EndsLinear Double Stranded O pened Circle 血管新生是当前医学与生物学研究的热点,治疗性血管新生在心脏血管与外周血管狭窄的动物实验中有很好的效果,并且已在数百例心与外周动脉缺血患者进行了临床一、二期试验治疗,取得了一定的成绩。但由于对人有效灌注所需的管腔面积要比实验动物大得多,因此取得理想治疗效果要困难得多。一些重要的问题尚待进一步解决: 确定合适的剂量以及更合理地联合运用多种诱导因子? 延长转染的基因在体内的表达时间? 是否有使机体其他部位不该增生的血管增生的危险? 治疗性血管新生为心与外周血管疾病的防治开辟了一个新的途

23、径,并可能特别适用于那些不能用药物、介入和/ 或手术治疗,或治疗效果不好的患者。此外,这种新的治疗方法也可促进创伤愈合与手术伤口愈合,将有广泛的应用前景。 血管内皮生长因子(VEGF) 是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子。内皮细胞表面的两个酪氨酸激酶受体Flt-1 与Flt-1/ KDR 与VEGF 结合后,传导相应的增殖与迁移信号,使内皮细胞增殖,形成新的毛细血管并重构与稳定。碱性成纤维细胞生长因子( bFGF) 及其受体FGR2 ,血管生长素1 (Ang-1) 及其受体Tie-1与Tie-2 ,胎盘生长因子( PlGF) ,肝细胞生长因子(HGF) ,血管生成素(angio

24、genin) 、血小板衍生生长因子(PDGF) 与环氧化酶-2 也是重要的促血管新生因子。这些因子相互协同,并且在细胞分化的不同阶段发挥不同的作用。VEGF 在血管新生的起始与维持阶段都有作用, bFGF 主要参与初期过程,而Ang-1 、PlGF 与PDGF 主要影响血管的成熟与稳定。 Ficoll密 度 梯 度 离 心 法 得 脐 血 单 个 核 细 胞 MACS法 脐 血 CD34 +单 个 核 细 胞 分 离 细 胞 培 养 : 将 分 离 所 得 CD34 +和 CD34 - 单 个 核 细 胞 分 别 接 种 于 60 mm培 养皿 中 ,加 入 M-199 培 养 基 , 20%

25、 FCS、 牛 脑 提 取 物 作 为 内 皮 细 胞 生 长 补 充 ,抗 生 素 、 生 长 因 子 VEGF 30 ng和 bFGF 24 ng, 于 37 , 5% CO2饱 和 湿 度 的孵 箱 中 培 养 。 培 养 3、 7、 14 d,显 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态 和 细 胞 簇 形 成 的 情况 。 试 验 中 细 胞 的 诱 导 分 化 主 要 采 用 生 长 因 子 为 VEGF和 bFGF。 bFGF可 引 起 内 皮 细 胞 的 增 生 和 移 行 ,且 还 可 以 与 VEGF协 同 作 用 ,在 体 外 促使 内 皮 细 胞 分 裂 成 毛 细 血 管

26、样 结 构 ,在 体 内 产 生 血 管 新 生 。 VEGF是 血 管 内 皮 细 胞 的 有 丝 分 裂 原 ， 还 能 抑 制 CD34 +前 驱 细 胞 中 树 突状 细 胞 的 成 熟 。 VEGF和 bFGF的 组 合 在 体 外 明 显 促 进 内 皮 系 细 胞 的 生 长和 分 化 ,内 皮 系 细 胞 具 有 优 势 性 地 生 长 。 刚 分 离 的 CD34 +和 CD34 - 单 个 核细 胞 呈 圆 形 ,细 胞形 态 小 ,不 均 匀 地悬 浮 分 布 于 培 养 皿底 部 CD34 +细 胞培 养 48 h后 可见 细 胞 贴 壁 , 3 d后 有 明 显 集落

27、 形 成 7 d后 大 量 梭 形细 胞 从 细 胞 簇 周围 开 始 生 长 。 梭形 的 细 胞 出 现 典型 的 线 样 排 列 结构 ,相 邻 的 细 胞簇 之 间 相 互 连 接形 成 血 管 网 样 结构 CD34 - 单 个 核 细胞 单 独 培 养 ,可 见部 分 贴 壁 细 胞 ,大部 分 细 胞 呈 悬 浮状 ,且 贴 壁 细 胞 主要 为 圆 形 ,随 着 培养 时 间 的 增 加 细胞 形 态 逐 渐 变 大 ,呈 现 出 不 规 则 形态 内 皮 特 异 性 成 分 蛋 白 水 平 的 鉴 定 CD34 + 细 胞 培 养 14 d后 在 细 胞 膜 和 细 胞 浆

28、中 都 有弥 漫 性 棕 色 出 现 ,呈 现 出 阳 性 反 应 。 证 实 了 有 内 皮 细 胞 特 异 性 成 分 ecNOS和 flk21 (KDR)蛋 白 水 平 的 表 达 脐 血 分 离 的 CD34 + 细 胞 培 养 前 后 祖 细 胞 标 志 物 CD34 +随 着 细 胞 的 成 熟 表达 水 平 下 降 ,而 内 皮 细 胞 的 标 志 物 CD31明 显 升 高 ( P 0. 05 ) 。说 明 祖 细 胞 诱 导 培 养 后 的 贴 壁 细 胞 具 有 内 皮 型 标 志 物 。 PE-CD34 抗 体 (鼠 抗 人 )和 同 型 对 照 鼠 IgG1抗 体 (D

29、iaclone) ; F ITC-CD31抗 体 (鼠 抗 人 )和 同 型 对 照 鼠 IgG1 抗 体 脐 血 纤 连 蛋 白 用 PBS 溶 解 稀 释 为 1 ng/ l 后 包 被 24 孔 板 ,37 2 h ,临 用 前 吸 出多 余 的 液 体 ,PBS 洗 两 次 。 分 离 的 CD133 +细 胞 按 (1 2) 10 5/ cm2 接 种 于包 被 好 的 24 孔 板 中 。 每 孔 中 加 入 M199 培 养 液 1 ml , 添 加 10 %胎 牛 血 清 ,1 %青 链 霉 素 (1 万 单 位 / ml) , VEGF 50 ng/ ml , b-FGF 1ng/ ml 、 IGF - 12 ng/ ml ,5 %CO2 的 37 孵 箱 中 培 养 ,每 4 d 换 液 一 次 。诱 导 分 化MACS磁 珠 分 选 出 CD133+细 胞血 管 内 皮 细 胞 鉴 定分 离 出 单 个 核 细 胞为 进 一 步 确 定 梭 形 细 胞 是 否 为 内 皮 细 胞 , 培 养 14d 左 右 , 消 化 贴 壁 细 胞 , 用 内皮 细 胞 特 异 性 抗 体 CD144、 KDR、 vWF、 UEA - 1 标 记 ,流 式 细 胞 仪 分 析