基因克隆技术课件

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1、2008.11.28基因克隆的技术方法探讨基因克隆的技术方法探讨 基因工程所用到的酶系基因工程所用到的酶系（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）能识别双链能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。）。取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在

2、后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。EcoRI表示大肠杆菌属名第一个字母表示大肠杆菌属名第一个字母E：表示种名头两个字母表示种名头两个字母co：表示株名表示株名R：表示该菌中第一个被分离出来的酶。表示该菌中第一个被分离出来的酶。I：Hind III的识别序列：的识别序列：5-A A G C T T-33-T T C G A A-5 5-A A G C T T-33-T T C G A A-5切割后形成具有粘性末端切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的的DNA片段：片段：限制性酶一般不在识别序列的对称轴上切割，

3、而是交错切限制性酶一般不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成割结果形成5 或或3 单链突出的粘性末端的单链突出的粘性末端的DNA限制片段。限制片段。二个具有互相匹配的粘性末端的二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基片段可以通过碱基的互补及的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。连接酶的作用而重新连接起来。HpaI的识别序列：的识别序列：5-G T T A A C-33-C A A T T G-55-G T T A A C-33-C A A T T G-5切割后形成具有平末端切割后形成具有平末端（blunt end）的的DNA片段：片段：限制酶在识别序列的对称轴上切割，形

4、成的限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段片段没有突出的单链。没有突出的单链。具有平末端的具有平末端的DNA片段也可以在片段也可以在DNA连接酶的连接酶的作用连接起来作用连接起来（三）（三）DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）DNA连接酶可以将两个连接酶可以将两个DNA片段的片段的3-OH与与5-P连接起连接起来来（二）（二）DNA聚合酶聚合酶具有催化具有催化DNA链从链从53方向聚合反应的活性，还具方向聚合反应的活性，还具有从有从53(其小片段其小片段)和从和从35(大片段大片段)的外切核酸的外切核酸酶活性。酶活性。三、基因工程所用到的克隆载体三、基因工程所用到的克隆载体以

5、扩增外源以扩增外源DNA为目的载体为目的载体-克隆载体（克隆载体（cloning vector）（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制（3）载体必须具有可供选择的遗传标记）载体必须具有可供选择的遗传标记（2）载体应具有酶切位点，便于外源）载体应具有酶切位点，便于外源DNA的插入的插入a）低分子量；低分子量；还应具备的特点：还应具备的特点：b）具有较高拷贝数；具有较高拷贝数；c）易于导入细胞；易于导入细胞；d）具有安全性；具有安全性；穿梭载体穿梭载体表达载体表达载体基因工程的基本过程基因工程的基本过程1.基因分离或合成：基因分离或合成：2.体外重组体

6、外重组3.重组载体导入受体细胞重组载体导入受体细胞4.特定克隆子的筛选特定克隆子的筛选构建基因文库（目的构建基因文库（目的基因所在菌株）基因所在菌株）导入缺陷型菌株或突变菌株导入缺陷型菌株或突变菌株筛选能功能互补的克隆筛选能功能互补的克隆 获得目的基因获得目的基因鸟枪法克隆新的目的基因鸟枪法克隆新的目的基因有机磷水解酶基因的克隆有机磷水解酶基因的克隆文库构建文库构建Total DNA extractionSau3AI partial digest(gatc)Recovery of 2-4kb fragmentsligation载体脱磷载体脱磷puc19载体载体 BamH I 酶切酶切puc19

7、载体提取载体提取gatcctagSau3AI:g gatc cc ctag gBamH I:转化转化,挑选转化子挑选转化子筛选阳性克隆筛选阳性克隆在理论上，构建的基因文库采用在理论上，构建的基因文库采用 Clarke的统计公式计算：的统计公式计算：N=ln（1-p）/ln（1-x/y）P是从建成的文库中可能筛选出某个基因的概率，是从建成的文库中可能筛选出某个基因的概率，x指该文库中每个独立克隆所含有外源指该文库中每个独立克隆所含有外源DNA片段的平均长度，片段的平均长度，y是该生物基因组的大小，是该生物基因组的大小，N是该文库应含的克隆数目。是该文库应含的克隆数目。Positive clone

8、s and puc19阳性克隆在含有相应农药的平板上产生水解圈阳性克隆在含有相应农药的平板上产生水解圈如何做亚克隆如何做亚克隆?-以四氢嘧啶降解相关基因为例以四氢嘧啶降解相关基因为例设计一个功能验证的策略设计一个功能验证的策略设计一个片段分解的策略设计一个片段分解的策略选择合适的载体选择合适的载体选择内切酶种类和设计引物选择内切酶种类和设计引物载体双酶切载体双酶切片段片段PCR克隆克隆,双酶切双酶切酶连转化酶连转化大肠杆菌大肠杆菌DH5 三亲杂交到三亲杂交到KT功能验证功能验证双酶切双酶切双酶切双酶切酶连酶连内切酶的选择内切酶的选择只有只有Apa I和和EcoR I可供选择可供选择 5-CGCTGAATTCGTGAAGTTGCCATATCGCTTAG-35-TATAGGGCCCTTGGCTTGATCGCTAAA-3正向引物正向引物反向引物反向引物EcoR IApa I保护碱基保护碱基保护碱基保护碱基