实验四+PCR及电泳技术

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1、实 验 4 PCR及 电 泳 技 术 1. PCR的 基 本 原 理 PCR基 本 原 理 类 似 于 DNA的 体 内 复 制 。 在 模 板 DNA、 引 物 和 4种 脱 氧 核 苷 酸存 在 条 件 下 依 赖 于 DNA聚 合 酶 的 酶 促 合 成 反 应 。 PCR的 基 本 步 聚 1、 变 性 (Denaturation) ： 通 过 加 热 使 DNA双 螺 旋 的 氢 键 断 裂 ， 双 链 解 离 形 成单 链 DNA 。 2、 退 火 (Annealing) ： 当 温 度 突 然 降 低 时 ， 反 应 体 系 中 引 物 和 其 互 补 的 DNA模 板 在 局

2、部 形 成 杂 交 链 。 3、 延 伸 (Extension )： 在 DNA聚 合 酶 和 4种 脱 氧 核 苷 酸 (dATP、 dCTP、 dGTP、dTTP)及 Mg 2+存 在 条 件 下 ， 53的 聚 合 酶 催 化 以 引 物 为 起 始 点 的 DNA链 延 伸反 应 。 这 种 热 变 性 -复 性 -延 伸 的 过 程 就 是 一 个 PCR循 环 ， PCR就 是 在 合 适 条 件 下的 这 种 循 环 的 不 断 重 复 。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95 )Target Seq

3、uenceTarget SequencePCR原 理 示 意 图 模 板 DNA的 变 性 ： 模 板 DNA经 加 热 至 93 左 右 一 定 时 间 后 ， 使模 板 DNA双 链 或 经 PCR扩 增 形 成 的 双 链 DNA解 离 ， 使 之 成 为 单 链 ，以 便 它 与 引 物 结 合 ， 为 下 轮 反 应 作 准 备 ；5 33 5ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5 33 5ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加 热 94 引

4、 物 酶 模 板 DNA与 引 物 的 退 火 (复 性 )： 模 板 DNA经 加 热 变 性 成 单 链 后 ，温 度 降 至 55 左 右 ， 引 物 与 模 板 DNA单 链 的 互 补 序 列 配 对 结 合 ； PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget Sequence Target SequencePrimer 1Primer 2 535535 33 引 物 酶 353 5TAG CG CTATCG CATCG ACG CTG G ATC

5、G引 物ATCG CG ATAG CG TAG CTG CG ACCTAG C引 物3 55 3 PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget Sequence Target SequencePrimer 1Primer 2 535535 3 3Taq DNAPolymerase 引 物 的 延 伸 ： DNA模 板 -引 物 结 合 物 在 Taq DNA聚 合 酶 的 作 用 下 ，以 d

6、NTP为 反 应 原 料 ， 靶 序 列 为 模 板 ， 按 碱 基 配 对 与 半 保 留 复 制 原理 ， 合 成 一 条 新 的 与 模 板 DNA 链 。 353 5TAG CG CTATCG CATCG ACG CTG G ATCGATCG CG ATAG CG TAG CTG CG ACCTAG CATCG CG ATAG CG TAG CTG CG ACCTAG CDNA聚 合 酶TAG CG CTATCG CATCG ACG CTG G ATCGDNA聚 合 酶5 53 3引 物引 物 End of the 1st PCR Cycle Results in two copies

7、 of target sequenceTarget Sequence Target Sequence 每 完 成 一 个 循 环 需 2-4 min， 2-3 h就 能 将 待 扩 目 的 基 因 扩 增 放大 几 百 万 倍 。 353 5TAG CG CTATCG CATCG ACG CTG G ATCGATCG CG ATAG CG TAG CTG CG ACCTAG CATCG CG ATAG CG TAG CTG CG ACCTAG CTAG CG CTATCG CATCG ACG CTG G ATCG5 53 3 Target AmplificationNo. of No. Amp

8、licon Cycles Copies of Target1 22 43 84 16 5 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon PCR仪 PCR仪 PCR仪 或 RNA都 可 以 作 为 PCR的 样 品 。 若 起 始 材 料 是 RNA，须 先 通 过 逆 转 录 得 到

9、第 一 条 cDNA。模 板引 物Taq DNA聚 合 酶4种 dNTP混 合 物Mg2+10 缓 冲 液 引 物 是 PCR特 异 性 反 应 的 关 键 ； PCR产 物 的 特 异 性 取 决 于 引 物 与 模 板 脱 氧 核 糖 核 酸 互 补 的 程 度 ； 人 工 合 成 的 寡 聚 核 苷 酸 引 物 需 经 离 子 交 换 HPLC进 行 纯 化 。 酶 量 过 少 影 响 反 应 产 量 ； 浓 度 过 高 可 引 起 会 造 成 杂 带 、 特 异 产 物带 不 清 晰 等 不 好 的 结 果 ， 浓 度 过 低 则 得 不 到 所 需 的 产 物 。 最 可 靠的 做

10、法 是 先 做 浓 度 对 照 ,再 根 据 结 果 决 定 最 佳 条 件 。 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 4）PCR常 用 的 浓 度 为 50-200M， 不 能 低 于 10-15M。会 抑 制 Taq 酶 的 活 性 ， 5） 10 PCR缓 冲 液 ( )： 500 mM K Cl， 100 mM Tris-H Cl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明 胶 。 PCR反 应 体 系 ： 10 PCR buffer 2.5l dNTP mix 各 0.5l 引 物 1 0.5 l 引 物 2 0.5 l DNA模 板 2 l Taq

11、酶 0.5 l 加 双 蒸 水 至 总 体 积 为 25l PCR扩 增 程 序 : 94 , 300S 94 , 60S 55 , 60S 72 , 60S 72 , 7min 30 循 环 2. 电 泳 技 术电 泳 槽 制 胶 板梳 子电 源 电 泳 仪提供稳定的电压或电 流 电极缓冲液和凝胶的容器 形成点样孔 制备垂直或水平凝胶 电 泳 分 离 的 原 理 电 泳 (electrophoresis)溶 液 中 带 电 粒 子 (离 子 )在 电 场 中 移 动 的 现 象 。 1、 电 荷 效 应 利 用 带 电 粒 子 在 电 场 中 移 动 速 度 不 同 而 达 到 分 离 的

12、目 的 。 2、 分 子 筛 效 应 不 同 的 分 离 介 质 形 成 的 孔 径 不 同 ， 在 孔 径 大 的 介 质 中 泳 动 速 度 快 ， 相 反 则 慢 。 3、 待 分 离 生 物 大 分 子 的 性 质 一 般 来 说 ， 分 子 带 的 电 荷 量 越 大 、 直 径 越 小 、 形 状 越 接 近 球 形 ， 则 其 电 泳 迁移 速 度 越 快 。 4、 电 场 强 度 电 场 强 度 （ V/cm） 是 每 厘 米 的 电 位 降 ， 也 称 电 位 梯 度 。 电 场 强 度 越 大 ， 电 泳速 度 越 快 。 电 泳 技 术 的 种 类 按 支 持 介 质 的

13、 不 同 可 分 为 ： 纸 电 泳 (Paper electrophorisis) 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 (Cellulose Acetate electrophoresis) 琼 脂 凝 胶 电 泳 (Agar Gel electrophoresis) 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS PAGE)。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳对 于 双 链 DNA， 电 泳 迁 移 率 的 大 小 主 要 与 DNA分 子 大 小 有 关 。 1、 熔

14、化 琼 脂 糖 时 ， 宜 低 火 ， 防 暴 沸 ；2、 倒 胶 时 温 度 要 低 于 60 且 速 度 要 慢 ；3、 拔 梳 子 和 点 样 要 小 心 ， 以 免 破 坏 胶 孔 ；4、 电 泳 仪 打 开 前 应 检 查 电 压 、 电 流 旋 纽 是 否 处 于 零 位 置 ， 工 作电 压 一 般 为 60-80V， 400mA， 电 泳 完 毕 应 将 电 压 、 电 流 旋 钮恢 复 到 零 位 置 ；5、 防 止 EB污 染 和 紫 外 灯 伤 眼 。注 意 事 项 ： 琼 脂 糖 浓 度 （ ） DNA有 效 分 离 范 围 （ Kb）0.5 30 10.7 12 0.81.0 10 0.51.2 7 0.41.5 3 0.2不 同 浓 度 大 小 琼 脂 糖 的 有 效 分 离 范 围 M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CK