食品功能因子综述

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1、活性肽的功能及提取方法新进展 摘要：生物活性肽是指具有生物活性的多肽，这些多肽小到只有 2 个 氨基酸的双肽，也可以大到复杂的长链或环状多肽，而且常经过糖苷 化、磷酸化或酰化衍生，在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的 作用。特别是短肽的发现已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂的 开发热点。以数个氨基酸结合生成的低肽比氨基酸有更好的消化吸收 性能，且营养和生理效果更为优越。不仅如此，其中许多肽还具有原 蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。这些生物活性肽都以非活性 状态存在于蛋白质的长链之中，当用适当的蛋白酶水解时，它们的活 性就被释放出来。关键词：活性肽 功能 提取 脱苦 研究进展1 引言随着

2、人们生活水平的提高, 伴随现代文明而来的各种疾富贵 病如高血压、 高血脂、肥胖病、糖尿病和癌症等越来越引起人们的关注, 人们的消费观念已从 单纯的吃饱吃好转向防病治病。在这种形势下, 功能性食品越来越受到青睐。功 能性食品( Functional Foods )是指对人体具有增强机体防御功能、调节生命节律、 预防疾病和促进康复等有关生理调节功能的加工食品。这类食品具有特殊的生理 功能, 其中生物活性肽是当前食品学界研究最热门的领域之一。肽类特别是一些 低聚肽不仅具有比蛋白 质更好的消化吸收性能 , 同时还具有调节人体生理机能 等作用。因而生物活性肽在功能性食品中具有重要的应用价值。生物活性肽

3、( Bioactive Peptides, BAP) 就是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的 肽类化合物, 是一类相对分子质量小于 6000Da, 具有多种生物学功能的多肽。其 分子结构复杂程度不一, 是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物, 小至由两个 氨基酸组成, 大至由数十个氨基酸通过肽键连接而成, 而且这些多肽可通过磷酸 化、糖基化或酰基化而被修饰。多数生物活性肽是以非活性状态存 在于蛋白质 的长链中, 当用适当的蛋白酶水解时, 其分子片段与活性被释放出来。早在 100 多年前, Matthews 就注意到肽的吸收及运转, Agar 等首先观察到肠 道能完整的转运双甘肽, New

4、ey 和 Smith 提出了肽可被完整转运的证据。但肽类 转运的生理意义, 并未得到普遍认识, 仍被传统的蛋白质消化吸收理论所束缚。 直到20世纪80 年代, 给畜禽饲喂 低水平蛋白质并补充合成氨基酸的饲料, 畜禽 不能获得最佳生长性能和饲料转化效率, 小肽的作用才被人们重视。现代生物代 谢研究发现:人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后 , 不像以前认为的那 样仅以氨基酸的形式吸收, 更多的是以低肽的形式直接吸收, 而且二肽和三肽的 吸收速度比相同组成的氨基酸还要快。这些小肽类物质能够直接参与消化、代谢 及内分泌的调节, 其吸收机制优于蛋白质和氨基酸。这是肽研究理论和实践的重 大突破。另一

5、种观点: 从生物多样性来看, 生物的各种功能大多来自于蛋白质的 多样性。这种由 20 种左右氨基酸残基形成的多肽链, 是一个具有天文数字般庞 大的家系。其序列的多样性足以产生生物体所有复杂的生理调节功能。也就是说, 理论上所有的生物功能肽都可能以短肽的形式找到。这些短肽就是生物活性肽 , 它们具有多种多样的生理功能, 如激素作用、免疫调节、抗血栓、抗高血压、降 胆固醇、抑菌、抗病毒、抗癌。2 正文2.1 活性肽的概念生物活性肽(Bioactive Peptides)是具有特殊生理功能的肽,它是蛋白质 中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环行结构 的不同肽类的总称,

6、是源于蛋白质的多功能最复杂的化合物。以前,人们认为氨 基酸是人体吸收蛋白质的主要途径。近年来, 科学家经研究发现,蛋白质经消化 道酶促水解后.主要以小肽的形式吸收,比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸 收利用。这是肽研究理论和实践的重大突破。2.2 活性肽的分类及生理功能2.2.1 生理活性肽随着人们生活水平的提高,伴随现代文明而来的各种富贵病如高血压、高血 脂和高血糖等越来越引起人们的关注。功能食品是指对人体具有增强机体防御功 能、调节生理节律、预防疾病和促进康复等有关生理调节功能的食品。因而具 有特定生理活性的生物肽将会在功能食品中具有重要作用。生理活性肽是指能够 调节生物体的生命活动或具有

7、某些生理活性作用的一类肽的总称。2.2.1.1 神经肽这些肽包括类鸦片活性肽如脑啡肽,以及其它神经活性肽如生长激素抑剂、 舒缓激肽和促甲状腺释放激素等。它们在神经系统中起着基础功能如镇痛作用2.2.1.2 抗高血压肽对血管紧张素转换酶抑制肽(简称ACEI肽)可从天然蛇毒中分离、细菌胶原 酶降解胶原蛋白、牛乳酪蛋白、大豆、玉米、沙丁鱼或磷虾蛋白等而制得, 是血 管紧张素转换酶抑制剂, 具有降血压的显著功效。其低肽易消化吸收, 具有促进 细胞增殖、提高毛细血管通透性等作用, 可用做降压功能食品基料。在日本一些 降血压肽已经商业化生产,而我国在这方面的研究开始的比较晚, 只从少数食物 原料中得到了

8、ACE抑制肽。2.2.1.3 抗血栓肽血栓即血液在血管内发生凝固,形成的基本因素是血液黏度增高。研究发现, 血液的凝固及乳液的凝集是两种重要的生理凝结过程,它们之间存在着许多相的 分子物质，如牛K-酪蛋白和人血纤维蛋白-链之间的结构具有同源性。而牛乳中 的K-酪蛋白和乳转铁蛋白经过酶解后可产生具有抗凝乳活性的生物活性肽。2.2.1.4 抗癌多肽蝎毒抗癌多肽是肿瘤医学上一个研究热点，它是从东亚钳蝎蝎毒中提取分离 的抗肿瘤有效肽，对多种肿瘤具有明显的抑瘤作用， 如对肝癌和肺癌有确切的疗 效。它已经在临床上应用于治疗癌症， 有望成为新型抗癌良药。而内皮素是另一 种抗癌多肽，它是一种由内皮细胞合成的生

9、物活性肽，也具有较强的抗癌特性，可 用于判断病情和疗效监测。还有，从海洋动物提取的化合物有10%具有抗癌活性， 海洋植物提取物有3. 5%具有抗癌活性。其中抗癌多肽具有活性高、稳定性好等 特点。2.2.1.5 抗菌多肽抗菌多肽又称抗微生物肽，广泛分布于自然界，在原核生物和真核生物中都 存在。如植物、微生物、昆虫和脊椎动物在微生物感染时迅速合成而得， 也可采 用基因克隆技术生产，如乳链菌肽（Nisin ）即具有很强杀菌作用。抗菌多肽主要 用于食品防腐保鲜。2.2.2 食品感官营养肽食品感官肽是指添加在食品中够调节食品的品质、 感观和口味的一类肽的 总称。在食品加工过程中常使用的活性肽有抗氧化肽、

10、表面活性肽、甜味肽、酸 味肽、 咸味肽和苦味肽等。2.2.2.1 抗氧化肽这些近年来，由于化学抗氧化添加剂的不安全性，高效低毒的天然食品抗氧 化剂成为目前一大研究热点，研究发现，抗氧化活性肽如肌肽和大豆蛋白酶解物 等由于具有低毒高效的特点，作为天然抗氧化物显示出在医药、食品和饲料行业 的应用优势。2.2.2.2 表面活性肽从酪蛋白、乳清、大豆和麸皮水解物中分离得到的某些肽, 具有表面活性剂 的作用。某些糖肽及其衍生物, 也对一些食品和饮料的稳定性起着重要作用。2.2.2.3 味肽味肽包括甜味肽、酸味肽、咸味肽和苦味肽等,这些肽类添加到食品中, 能 明显改变食品原有的口感。同时这些肽类, 如咸味

11、肽, 由于可作为无钠调味剂, 能为糖尿病患者和高血压患者所用, 所以可作为保 健食品。苦味 肽可从发酵食 品如奶酪、可可、米酒和蛋白水解产物中分离得到, 添加到许多食物如啤酒、咖 啡、果汁和奶酪中,形成这些食品的特殊口感,而且还没有副作用,对人体是安全 的。2.2 活性肽的提取进展人们获得生物活性肽的途经主要有3种:存在于生物体中的天然活性肽（ 激 素类和酶抑制剂等）、消化过程中或体外水解蛋白质产生和通过化学方法、酶法 和重组DNA技术合成的。在实际应用中人们常通过酶法合成生物活性肽，其产品安 全性极高,生产条件温和,水解易控制,可定位生产特定的肽,成本低,已成为最主 要的生产方法。其主要的生

12、产流程为:原料蛋白f预处理f酶解f分离f精制f 成品。原料的选择是生产相应功能活性肽的基础。一方面可根据相应功能肽的氨 基酸组成或结构特点来选择相应的原料， 另一方面要尽量选择利用率不高的廉 价的农副产品， 甚至可利用工厂排放的废弃物。如陈季旺用碱法和酶法两步加工 碎米得到纯度较高的大米蛋白，这就是具有良好的消化性和较高营养价值的优良 的植物蛋白。而酶的选择，是生产功能活性肽的关键。目前，商业用酶主要是微生 物酶、植物蛋白酶及少量的动物蛋白酶。同时还要建立一种灵敏度高、简便易行 的目标肽的活性检侧体系， 以便在整个生产过程中判断活性肽的效量。与其它生 物技术一样，生物活性肽的分离提纯也是生产的

13、重要部分。由于目标活性肽在反 应体系中的含量甚微，往往采用吸附分离、色谱分离、超滤膜分离及反渗透等现 代分离技术和脱色、脱臭、脱苦等提纯精制技术。这是决定能否将产品推向市场 的关键因素。2.2.1 小麦胚芽蛋白小分子酶解产物清除自由基小分子小麦胚芽肽是小麦胚芽蛋白水解产物，系由一些分子量小、并呈很高 生物活性短肽分子所组成，具有多种生物功能，如降胆固醇、降血压、抗肿瘤等， 这些均与其抗氧化活性有关。用SephadexCr-15凝胶过滤层析和DEAE52纤维素离 子交换层析对小麦胚芽蛋白酶解产物进行纯化，获得平均分子量为850 Da小分子 活性肽，并采用Fen ton反应、邻苯三酚自氧化法和DP

14、PH法研究小分子活性肽清除自由基能力。50讪1U綁暇Ih膻爾就鋤酬禅膿fl Itx孙閒90皿E4 m-OHW8S肘懷擀湖枪嚇勰册加閒砂初別皿结果表明：此类小分子活性肽对超氧阴离子、羟自由基、DPPH具有较好清除 作用，均呈一定量效关系；且清除02能力与谷胱甘肽(GSH)相当。2.2.2 小麦胚活性肽体外抗氧化活性试验将市场上出售的小麦胚活性肽粉与市场上出售的其他活性肽粉在还原 能力、清除DPPH自由基能力、螯合亚铁能力和抑制亚油酸自氧化能力方面进 行了比较，对小麦胚活性肽粉的体外抗氧化活性作出客观评价。研究结果表明： 工业生产的小麦胚活性肽的还原能力和清除DPPH 自由基能力都高于其他几种 植

15、物源活性肽，其中清除DPPH自由基能力的Ic50达到1.36 mg / mL；在质量 浓度为1mg/mL时，对亚铁离子的螯合率为40% ；抑制亚油酸自氧化能力和其他 几种活性肽相差不大。曾X.4?如翔诧底讦ft mg / bL卜* l号大豆證 ?号大豆It占*号玄豆fit(千4号小麦JI括性StP5号玄豆舷石耳丸豹馱子丁号玉殖出*护4小蛊蛍R展K3狀粉疊含亚林幽子的歳力时何/#-奁白-H1?豆融 占2号宅豆氏 平1号土耶曲 _*号小圭压活件眩 ，号尢豆駄-石号尢豆駄 占？号卫米肚号小宦噩直加圉4肽撈抑制亚油醴自嬴优施力比较总体来说，工业生产的小麦胚活性肽有很好的体外抗氧化活性。2.2.3 大豆

16、降血压活性肽和抗癌活性肽的制备研究以大豆分离蛋白为原料，用7种不同的蛋白酶对其进行水解，得到大豆肽， 在水解不同时间时测定大豆肽的血管紧张素转换酶(ACE )抑制率和胃癌细胞生 长抑制率。结果表明，碱性蛋白酶制备的大豆肽ACE抑制率最咼，其制备大豆 降血压活性肽的最优条件为：反应温度55C, pH 9.0,底物质量分数8%,酶 添加量8000U / g,酶解时间5h。木瓜蛋白酶制备的大豆肽胃癌细胞生长抑制 率最高，其制备大豆抗癌活性肽的最优条件为：酶解温度55C,酶添加量7000U /g,pH 7.5,底物质量分数6%,酶解时间4 h。2.2.4 角质细胞生长因子噬菌体活性肽的构建本实验构建展

17、示角质细胞生长因子(KGF)噬菌体活性肽，检测其促表皮细胞 增殖的作用。方法选择4个KGF序列，设计引物；用反转录一 PCR法获得3个KGF序 列(Pl、P2和P4),直接合成1个KGF序列(P3)；将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3 中；用噬菌体展示技术，将KG F基因片段展示于噬菌体表面；用四甲基偶氮唑盐 (MTr)法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用，测定其在570 am的吸光度 (A)值，用免疫荧光法检测其细胞亲和力。结果获得4种KGF基因，构建在噬菌粒 pComb3中；通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面。MTF检测的吸光度(A) 值结果显示阴性对照组(0.293土0

18、. 017)与KGF对照组(0.5200.043)及4种KGF 噬菌体活性肽组(PI4)(0.4690.057、0.4410.048、0.438 4-0.035、0.446 0.037)间差异均有统计学意义(均P0.01)，免疫荧光检测结果显示KGF和4种 KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力。结论构建展示的KGF噬菌体活性肽能够显著促进表皮细胞增殖。2.2.5 引起肌肉松弛的新型蛙皮肽的制备本实验构建展示角质细胞生长因子(KGF)噬菌体活性肽，检测其促表皮细胞 增殖的作用。方法选择4个KGF序列，设计引物；用反转录一 PCR法获得3个KGF序 列(Pl、P2和P4),直接合成1个KG

19、F序列(P3)；将KGF序列亚克隆至噬菌粒pComb3 中；用噬菌体展示技术，将KG F基因片段展示于噬菌体表面；用四甲基偶氮唑盐 (MTr)法检测KGF噬菌体活性肽促表皮细胞增殖的作用，测定其在570 am的吸光度 (A)值，用免疫荧光法检测其细胞亲和力。结果获得4种KGF基因，构建在噬菌粒 pComb3中；通过噬菌体展示技术将其表达于噬菌体的表面。MTF检测的吸光度(A) 值结果显示阴性对照组(0.293土0. 017)与KGF对照组(0.5200.043)及4种KGF 噬菌体活性肽组(PI4)(0.4690.057、0.4410.048、0.438 4-0.035、0.446 0.037

20、)间差异均有统计学意义(均P0.01)，免疫荧光检测结果显示KGF和4种 KGF噬菌体活性肽与表皮细胞具有较好的亲和力。结论构建展示的KGF噬菌体活性 肽能够显著促进表皮细胞增殖。一种新型的生物活性肽被确定从树蛙的皮肤分泌物提取。它是由21个氨基酸 残基组成，序列为QGGLLGKVSNLANDALGILPI。它的主要结构通过克隆和质谱分析 进一步被证实。发现活性肽的浓度对大鼠离体回肠的舒张作用有影响。它没有抗 菌和丝氨酸蛋白酶抑制活性。BLAST搜索发现，这种活性肽没有表现出相似的已 知的蛋白质或肽的性质。特别是，这种蛙皮肽不含有其他两栖生物肽的传统结构， 如缓激肽、胆囊收缩素(CCK)、和速

21、激肽，表明蛙皮肽属于一种新颖的两栖动物 生物活性肽。3 活性肽的分离纯化及分析检测技术 药物连接到金纳米分离纯化生物活性肽的目的是为了获取高纯度或高活性 的制品,并使其得率或产量达到最高值。由于生物活性肽在生产反应体系中含量 甚微,传统分离技术的分离效果往往不够理想,必须采用吸附分离、色谱分离、超 滤、 膜分离、反渗透等现代分离技术和脱色、脱臭、脱苦等提纯精制技术。高 效液相色谱(HPLC )用于分离蛋白质和多肽，有反相、离子交换、凝胶过滤、疏水 层析等多种分离形式，发展迅猛。HPLC具有在较高分子量范围内的高分离能力、 装置简单、可以控制易混入的杂质组分等优点。分离活性肽通常的方法是:将含

22、有活性肽的溶液先采用盐析、等电点沉淀、超滤和有机溶液分级分离等， 除去大 部分杂质或对溶液进行浓缩，然后使用离子交换、凝胶过滤、吸附层析等进行进 一步的分级纯化。苦味直接影响食品的风味和口感， 决定着生物活性肽的应用， 因此脱苦技 术的研究受到了人们重视。脱苦方法主要有：(1 )物理法：分离提取、掩盖 及改造蛋白等; ( 2 )化学法: 酸碱处理及类蛋白反应等; ( 3)酶法: 利用外切 型 蛋白酶水解产生苦味的疏水性多肽。几种方法中， 物理法分离提取会造成一 定量肽损失。改造蛋白反应表现出有效的脱苦作用， 但产量低， 且具有可逆性， 在进一步加工过程中， 苦味可能重新形成。酸碱处理会破坏一些

23、氨基酸， 尤其是 必需氨基酸, 使蛋白质营养价值降低。比较而言, 酶法具有消苦味效率高、条件 温和、不会使蛋白多肽营养成分丢失、水解过程易于控制、不会改变蛋白肽的重 要特性等优点, 现已成为研究热点, 应用广泛。苦味消减问题虽取得一些进展, 但至今未有根本解决, 因尚未找到既能保证蛋白质 有一定水解度, 又不产生具 有苦味肽的理想酶。4 结论我国生物活性肽的研究开发起步晚,研究单位也少,基础和应用研究都很薄 弱,目前尚处于起步阶段。我国在生物活性肽的研究开发上,从事活性肽的研究单 位也多从医药角度出发, 研究力量及投入较少,限制了活性肽药食两用功能的发 挥,市场上国产的活性肽药品和食品寥寥无几。但近几年研究逐步活跃起来, 报 道渐多,前景看好。当前生物活性肽研究开发的方向是:肽的定向酶解技术开发, 包括高效、专一性强的酶种选育、 复合酶系共同作用机理、机制, 脱苦微生物 的分离、纯化和机理研究, 酶解工艺改进技术等;功能性肽的分离、分析技术开 发,包括新型高效分离设备和分离工艺,灵敏度高、简单易行的目标肽活性分析检 测体系和分析技术及下游精制技术;肽的功能性生物学评价研究;生物活性肽功 能食品开发等。