基因工程载体和工具酶

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1、 （ 6） 表 达 型 质 粒 载 体主 要 用 来 使 外 源 基 因 表 达 出 蛋 白 质 产 物 。如 果 在 大 肠 杆 菌 里 表 达 ， 必 须 把 所 克 隆的 真 核 生 物 的 基 因 置 于 大 肠 杆 菌 的 转录 翻 译 信 号 控 制 之 下 。注 意 启 动 子 的 性 质 ， 终 止 子 、 起 始密 码 、 终 止 密 码 的 阅 读 正 确 。 复 制 起 始 点 ORI、 选 择 标 记 、 多 克 隆 位 点 MCS2） 大 肠 杆 菌 操 纵 子 元 件阻 遏 基 因 I 操 纵 基 因 O 启 动 基 因 P 核 糖 体 结 合 位 点 序 列 （

2、SD） 转 录 终 止 信 号 区 。1） 普 通 载 体 元 件 表 达 载 体 的 结 构 大 肠 杆 菌 乳 糖 操 纵 子 的 调 控操 纵 子 与 操 纵 子 模 型 操 纵 子 学 说 /操 纵 子 模 型 ： F.Jacob J.Mond（ 1960） E.coli lac operon( 1965诺 贝 尔 医 学生 理 学 奖 ) 操 纵 子 ： 核 酸 分 子 上 调 控 基 因 转 录 活 性 的 基 本单 元 ， 由 结 构 基 因 、 操 作 子 （ O） 和 启 动 子 （ P）组 成 。 转 录 、 翻 译 、 合 成 蛋 白 结 合 调 节 蛋 白 结 合 RN

3、A聚 合 酶 promoter structural genes operator启 动 基 因 操 纵 基 因 结 构 基 因操 纵 子 (operon)模 型 调 控 （ 节 ） 蛋 白 操 纵 子 RNAR P O structural genes DNAProtein调 控 蛋 白 的 作 用 机 制注 ： R： Regulator P： Promoter O： Operator 正 调 控 系 统 中 的 正 调 控 蛋 白 又 被 称 为 无 辅 基 诱 导 蛋 白 （ apoinducer) 负 调 控 系 统 中 的 负 调 控 蛋 白 又 被 称 为 阻 遏 蛋 白 （ re

4、pressor) (四 )经 典 的 大 肠 杆 菌 质 粒 载 体1. pSC101第 一 个 成 功 地 用 于 克 隆 实 验 的 大 肠 杆 菌 质粒 载 体 。（ 1） 类 型 天 然 质 粒 ， 属 低 拷 贝 型 。（ 2） 长 度 9.09 kb。（ 3） 选 择 标 记 四 环 素 抗 性 Tet r 6个 克 隆 位 点 ： EcoR I、 Xho I、 Pvu I、 Hind III、BamH I、 Sal I 主 要 使 用 EcoR I。（ 其 中 Hind III、 BamH I、 Sal I 3个 位于 选 择 标 记 Tetr的 内 部 ）（ 4） 克 隆 位

5、点 2. ColE1（ 1） 类 型 天 然 质 粒 ， 属 高 拷 贝 型 。（ 2） 长 度 6.3 kb。（ 3） 选 择 标 记大 肠 杆 菌 素 （ colicin） E1对 E1免 疫 的 基 因 （ immE1）特 点 是 在 培 养 基 中 加 入 氯 霉 素 抑 制 细 菌蛋 白 质 合 成 后 ， 质 粒 仍 然 能 复 制 达 到 每个 细 胞 1000-3000拷 贝 之 多 ！ colicin E1基 因 的 结 构cea imm kil结 构 基 因 免 疫 基 因 溶 菌 基 因 杀 死 不 含 有 ColE1细 菌 的 原 因cea + kil基 因 产 物 不

6、 被 其 他 细 菌 的 colicin E1所 杀 死 的 原 因imm基 因 EcoR I位 于 E1内 部 ， 插 入 外 源 DNA会 导致 E1失 活 ， 使 受 体 菌 不 能 合 成 E1（ ColE1-） ， 但 仍 然 表 现 出 对 E1免 疫 型（ ImmE1+） 。EcoR I（ 4） 克 隆 位 点Colicin E1 外 源 DNA无 Colicin 3. pBR322：F. Bolivar和 R.L. Rodriguez人 工 构 建 载 体 。 “ P”表 示 是 一 种 质 粒 (plasmid)； “ BR”表 示 两 位 主 要 构 建 者 姓 氏 的 头

7、 一个 字 母 “ F.Bilivar和 R.L.Rodriguez”; “322”表 示 实 验 编 号 。 pSP2124质 粒 的 Ampr基 因（ 1） 元 件 来 源 复 制 起 点 oripMB1系 列 （ 来 源 于 ColE1）的 高 拷 贝 型 复 制 起 点 Ampr基 因 Tetr基 因pSC101的 Tetr 基 因 。 （ 2） 长 度 4361bp（ 3） 选 择 标 记氨 苄 青 霉 素 和 四 环 素 抗 性 。（ 4） 克 隆 位 点其 中 9个 会 导 致 Tetr基 因 失 活 （ 如BamH I、 Hind 、 Sal I） ； 3个 会 导 致 Amp

8、r基 因 失 活 （ Sca I、PvuI、 Pst I） 。 24个 克 隆 位 点 。 （ 5） pBR322的 优 点 双 抗 菌 素 抗 性 选 择 标 记 插 入 失 活 ， 分 两 次 先 后 选 择 ：没 有 获 得 载 体 的 寄 主 细 胞 在 Amp或 Tet中 都 死 亡 。获 得 载 体 的 寄 主 细 胞 在 Amp或 Tet其 中 之 一 中 死 亡 。 外 源 基 因 BamH IAmp中 存 活但 在 Tet中 死 亡 外 源 基 因 Pst ITet中 存 活但 在 Amp中 死 亡 每 个 细 胞 可 达 10003000copy 安 全失 去 了 转 移

9、蛋 白 基 因 mob（ mobilization） 。不 能 通 过 接 合 转 移 。 高 拷 贝 数 分 子 小 ， 克 隆 能 力 大载 体 越 小 越 好 。 10kb的 DNA在 纯 化 过 程 中 容 易 断 裂 。 保 留 了 转 移 蛋 白 （ mob） 的 作 用 位 点 。（ 6） pBR322的 缺 点能 够 被 ColK质 粒 编 码 的 mob蛋 白 识 别 ，如 果 再 有 F质 粒 的 参 与 ， 就 有 可 能 转 移 ！ 删 除 mob识 别 位 点（ 如 质 粒 pBR327、 pAT153等 ） 。pAT153：从 pBR322上 切 去 HaeII片

10、断 ， 既 除 去了 mob识 别 位 点 ， 又 增 加 质 粒 的 拷 贝数 。（ 7） PBR322的 改 进 pBR325：在 pBR322位 点 上 接 入 一 段 来 自 噬 菌 体 PICm的 HaeII酶 切 片 断 （ 带有 氯 霉 素 抗 性 基 因 cmlr） 。 cmlr上 也 带 一 个 EcoRI位 点 。使 EcoRI 也 成 为 插 入 失 活 型 位 点 。 改 造 EcoR I 位 点 4. pUC系 列University of California的 J. Messing和 J. Vieria于 1978年 ， 在 pBR322的 基 础 上 改 造而

11、成 。 属 正 选 择 载 体 。pUC7、 pUC8、 pUC9、 pUC10、pUC11、 pUC18、 pUC19 复 制 起 点 pBR322的 ori但 其 上 失 去 了 克 隆 位 点 。 Ampr 基 因（ 1） 元 件 来 源 lacZ的 启 动 子 大 肠 杆 菌 lacZ基 因大 肠 杆 菌 lacZ的 -肽 链 序 列 ， 是 LacZ 的 氨 基 端 片 断 。pBR322的 Ampr基 因 （ 2） 长 度 约 2.7kb（ 3） 克 隆 位 点 10个 连 续 的 单 一 限 制 酶 切 位点 ， 位 于 lacZ基 因 的 5端 。 叫 5-溴 -4-氯 -3-吲 哚 -B-D-半 乳 糖 苷