分析化学中分第六章联用技术

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1、第 六 章联 用 技 术 (Hyphenated Techniques)6.1 导 言6.2 新 质 谱 法6.3 色 谱 质 谱 联 用6.4 电 化 学 光 谱 联 用6.5 毛 细 管 电 泳 光 谱 联 用参 考 书 ： 生 物 质 谱 技 术 与 方 法 ， 杨 芃 原 ， 钱 小 红 ， 盛 龙 生 编 著 ， 科 学 出 版 社 ， 2003生 命 分 析 化 学 ， 汪 尔 康 ， 陈 义 ， 科 学 出 版 社 ， 2006 6.1 导 言随 着 生 命 科 学 、 材 料 科 学 和 环 境 科 学 等 的 发 展 和 需 求 ， 复 杂 样品 体 系 的 分 离 、 分

2、析 已 成 为 分 析 化 学 的 重 要 研 究 方 向 和 研 究 热点 之 一 。所 谓 复 杂 样 品 体 系 ， 不 仅 仅 是 指 样 品 中 的 组 分 多 样 性 ， 而 且 还 包含 完 全 不 同 体 系 的 物 质 共 存 于 一 个 样 品 中 。 例 如 ： 无 机 与 有 机 化合 物 共 存 一 体 ， 高 分 子 、 大 分 子 与 小 分 子 化 合 物 共 存 一 体 ， 生 命与 非 生 命 物 质 共 存 一 体 等 。 如 果 要 对 复 杂 样 品 体 系 提 供 全 面 、 准确 的 结 构 与 成 分 表 征 信 息 ， 那 么 其 分 析 过

3、程 可 能 包 括 从 常 量 到 微量 、 痕 量 分 析 ， 从 成 分 到 结 构 、 形 态 分 析 ， 从 总 体 到 微 区 、 表 面 、空 间 分 布 分 析 ， 从 宏 观 形 貌 到 微 观 结 构 分 析 ， 从 静 态 到 动 态 、 时间 分 辨 分 析 ， 从 破 坏 到 非 破 坏 分 析 等 等 。 因 此 ， 为 了 圆 满 完 成 复杂 样 品 体 系 的 全 分 析 ， 需 要 综 合 利 用 包 括 色 谱 法 和 质 谱 法 在 内 的多 种 现 代 分 离 、 分 析 方 法 。联 用 技 术 的 重 要 性 和 必 要 性 ！ 本 章 在 简 介

4、新 质 谱 方 法 的 同 时 ， 也 将 介 绍 色谱 -质 谱 联 用 技 术 及 接 口 技 术 的 发 展 ， 还 将 介绍 各 种 不 同 模 式 和 类 型 的 色 谱 -质 谱 联 用 技 术的 实 现 、 研 究 进 展 及 其 在 生 命 科 学 研 究 领 域中 的 应 用 ， 以 及 其 它 联 用 技 术 ， 如 电 化 学 光 谱 ， 毛 细 管 电 泳 光 谱 联 用 等 。 6.2 新 质 谱 法6.2.1 质 谱 学 简 介 及 其 特 点1906年 J.J.Thomson发 明 了 质 谱 仪 (Mass spectroscopy, MS)，但 直 至 192

5、0s左 右 质 谱 法 才 逐 渐 成 为 一 种 分 析 手 段 ， 被 化 学家 采 用 。 从 1940s以 后 MS广 泛 地 应 用 于 有 机 物 质 分 析 。1980s末 期 新 软 电 离 技 术 的 发 明 ， 能 够 用 于 分 析 高 极 性 、 难挥 发 和 热 不 稳 定 样 品 之 后 ， 生 物 质 谱 才 发 展 起 来 。常 规 质 谱 分 析 仪 的 质 量 范 围 是 几 十 到 2000 da。生 物 质 谱 (新 质 谱 法 )是 现 代 分 析 化 学 及 相 关 生 化 研 究 的 热 点之 一 和 蛋 白 质 组 学 的 主 要 手 段 。 质

6、 谱 法 的 特 点 ：(1) 高 灵 敏 度 ， 可 测 10-8mol以 下 物 质 的 量 ；(2) 快 速 ， 数 分 钟 内 即 可 完 成 测 试 ；(3) 能 同 时 提 供 样 品 的 精 确 分 子 质 量 和 结 构 信 息 ；(4) 既 可 用 于 定 性 分 析 ， 也 可 用 于 定 量 分 析 ；(5) 能 有 效 地 与 各 种 色 谱 技 术 联 用 ， 如 GC/MS， HPLC/MS， TLC/MS及 CZE/MS等 ， 用 于 复 杂 体 系 分 析 。MS的 特 点 可 概 括 为 4个 S: 灵 敏 (sensitivity)、 快 速(speed)、

7、 专 一 (specificity)、 化 学 计 量 (stoichiometry)。 在 过 去 的 几 十 年 中 ， 生 物 质 谱 的 主 要 进 展 在 于 解 决 如何 测 定 大 质 量 分 子 质 荷 比 m /z及 其 相 关 的 问 题 ， 主 要 的研 究 领 域 包 括 ：(1) 如 何 扩 大 质 谱 仪 器 的 质 量 范 围 ？(2) 如 何 使 生 物 大 分 子 电 离 和 使 其 带 多 电 荷 (即 降 低 m /z)？(3) 如 何 解 释 大 质 量 分 子 质 谱 ？(4) 如 何 发 展 生 物 大 分 子 质 谱 测 定 方 法 ？Fred M

8、. McLafferty et al, Science, 2006, 314, 109-112报 道 了 采 用 MS可 研 究 质 量 大 于 200 Kda的 蛋 白 质 ！ 与 质 谱 相 关 而 获 得 诺 贝 尔 奖 的 有 ：J.J.Thomson(物 理 1906， 发 明 质 谱 技 术 并 用 于 研 究气 体 的 电 导 )；F.W.Aston(化 学 1922， 用 质 谱 仪 发 现 了 非 放 射 性 元素 的 同 位 素 )；W.Paul(物 理 1980， 发 明 离 子 阱 质 谱 原 理 与 技 术 )；R.F.Curl、 R.E.Smalley和 H.W.K

9、roto(化 学 1996， 用质 谱 仪 观 察 到 激 光 轰 击 下 产 生 的 C60)；K.Tanaka(田 中 耕 一 )和 J.B.Fenn(化 学 2002， 发 明MALDI-MS和 ESI-MS技 术 )。 生 物 质 谱 的 最 基 本 用 途 是 能 够 测 量 多 肽 /蛋 白 质 /核 酸 等 生 物 大 分子 的 分 子 质 量 ， 并 间 接 推 测 它 的 结 构 及 相 互 作 用 。1994年 蛋 白 质 组 学 第 一 次 被 提 出 (Marc Wilkins)， 随 后 生 物 质 谱被 确 认 为 蛋 白 质 组 学 技 术 平 台 的 重 要 组

10、 成 部 分 ， 认 识 到 生 物 质 谱另 一 吸 引 人 之 处 是 可 以 取 代 Edman降 解 测 序 方 法 ， 了 解 蛋 白 生 成的 早 期 结 构 域 ， 以 及 可 以 鉴 定 翻 译 后 修 饰 的 能 力 。 另 外 ， 生 物 质谱 还 可 以 用 来 测 定 非 共 价 键 作 用 如 抗 体 -抗 原 结 合 作 用 。2001以 后 ， 随 着 基 因 组 测 序 计 划 的 完 成 ， 蛋 白 质 组 学 的 规 模 化已 成 定 局 ， 生 物 质 谱 正 在 发 挥 着 不 可 取 代 的 中 坚 作 用 。蛋 白 质 组 学 的 研 究 之 所 以

11、 能 够 蓬 勃 发 展 ， 主 要 依 赖 于 高 通 量 分 离和 分 析 技 术 的 突 破 性 进 展 。 首 先 是 质 谱 技 术 ， 尤 其 是 软 电 离 技 术的 发 展 和 双 向 (二 维 )凝 胶 电 泳 技 术 的 完 善 ， 使 得 蛋 白 质 的 大 范 围高 通 量 分 析 成 为 可 能 。蛋 白 质 组 学 (Proteomics) 生 物 质 谱 ！ Proteomics is the study of the proteome, the protein complement of the genome.The terms ”proteomics” and

12、 “proteome” were coined by Marc Wilkins and colleagues in the early 1990s and mirror the terms “genomics” and “genome”, which describe the entire collection of genes in an organism.Introduction to Proteomics, Daniel Liebler. 2002, Humana Press蛋 白 质 组 学 目 前 面 临 的 最 大 挑 战 是 什 么 ？ 6.2.2 各 种 质 谱 技 术质 谱

13、仪 的 一 般 结 构 框 图 如 图 6.1所 示 。 质 谱 分 析 是 一 个 制 备 样 品或 从 其 他 分 析 仪 器 引 入 样 品 样 品 气 化 并 离 子 化 引 入 样 品 离子 到 分 析 器 在 分 析 器 中 按 照 离 子 的 质 荷 比 不 同 分 离 离 子 分别 检 测 各 种 离 子 并 得 到 质 谱 图 的 过 程 。图 6.1 质 谱 仪 器 组 成 示 意 图 质 谱 仪 的 核 心 是 离 子 源 和 分 析 器 ， 其 他 的 部 分 一 般根 据 离 子 源 和 分 析 器 相 应 地 配 备 。离 子 源 多 种 多 样 ， 工 作 在 真

14、 空 状 态 下 的 有 ： 电 子 轰击 源 (electron bombardment, EB)、 化 学 离 子 源(chemical Ionization, CI)、 真 空 火 花 源 (spark source, SS)、 激 光 表 面 解 析 源 (laser desorption, LD)等 ； 工 作在 低 压 下 的 有 辉 光 放 电 离 子 源 (glow discharge, GD)；工 作 在 大 气 压 下 的 有 电 (离 子 )喷 雾 (electron/ion spray, E/IS)、 电 感 耦 合 等 离 子 体 源 (inductively cou

15、pled plasma, ICP)等 。 分 析 器 类 型 主 要 有 ： 磁 偏 转 、 四 极 杆 、 离 子 阱 、飞 行 时 间 、 离 子 回 旋 共 振 等 。不 同 的 分 析 器 与 离 子 源 之 间 有 多 种 组 合 ， 构 成 了质 谱 仪 器 庞 大 的 家 族 。二 维 质 谱 ： 两 种 不 （ 相 ） 同 类 型 的 质 谱 串 联 在 一起 可 形 成 二 维 质 谱 。 例 如 Q-TOF MS, QQ-TOF MS, TOF-TOF MS以 及 MSn等 。二 维 质 谱 在 提 高 分 析 灵 敏 度 、 通 量 等 方 面 具 有 特 殊的 优 点

16、， 是 蛋 白 质 组 大 规 模 筛 选 的 首 选 工 具 。 6.2.3 大 分 子 电 离 技 术由 于 生 物 样 品 的 非 挥 发 性 、 热 不 稳 定 性 及 相 对 分 子 质 量 大 等 特 性 ，使 传 统 的 电 子 轰 击 (EI)、 化 学 离 子 源 (CI)等 电 离 技 术 的 应 用 受 到极 大 限 制 。 随 着 FAB、 MALDI、 ESI、 ISI、 大 气 压 下 碰 撞 电 离(APCI)等 电 离 技 术 的 出 现 ， 大 大 提 高 了 质 谱 的 测 定 范 围 ， 改 善 了测 量 灵 敏 度 ， 并 在 一 定 程 度 上 解 决

17、 了 溶 剂 分 子 干 扰 等 问 题 ， 使 质谱 在 生 物 分 析 中 的 应 用 得 到 进 一 步 的 发 展 。表 6.1 生 物 质 谱 电 离 技 术 比 较 目 前 用 于 生 物 大 分 子 质 谱 分 析 的 软 电 离 质 谱 技 术 如 下 ：(1) 电 喷 雾 电 离 质 谱 (electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS);(2) 基 体 辅 助 激 光 解 吸 电 离 质 谱 (matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MA

18、LDI-MS)；(3) 快 原 子 轰 击 质 谱 (fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)；(4) 离 子 喷 雾 电 离 质 谱 (ion spray ionization mass spectrometry, ISI- ISI-MS)；(5) 大 气 压 电 离 质 谱 (atmospheric pressure ionization mass spectrometry, API-MS)；(6)解 吸 电 喷 雾 电 离 质 谱 (desorption electrospray ionization mass spectromet

19、ry, DESI-MS)。 6.2.4 基 体 辅 助 激 光 解 吸 电 离MALDI离 子 源 可 以 电 离 分 子 质 量 为 100-1000000Da的 生物 分 子 并 用 于 质 谱 分 析 ， 提 供 了 高 的 灵 敏 度 、 高 的 离 子透 过 率 和 强 的 可 操 作 性 。 MALDI之 所 以 得 到 发 展 ， 得益 于 早 期 试 验 用 激 光 解 吸 及 等 离 子 体 解 吸 生 物 有 机 分 子的 成 功 ， 也 得 益 于 FAB生 物 基 质 的 进 展 。 1990s在 日 本 和德 国 几 乎 同 时 报 道 了 60000Da分 子 质

20、量 的 蛋 白 质 的 电 离 ，引 起 全 球 的 关 注 和 兴 趣 ， 并 刺 激 了 许 多 公 司 致 力 于 开 发相 关 质 谱 仪 ， 并 研 究 如 何 用 MALDI技 术 分 析 蛋 白 质 、多 肽 及 DNA。 MALDI是 1988年 由 Hillenkamp 和 Micheal Karas等 首先 提 出 的 ， 其 原 理 同 FAB类 似 。 它 利 用 激 光 束 照 射 分散 于 基 体 中 的 样 品 ， 由 于 这 些 基 体 （ 质 ） 能 够 强 烈 吸收 激 光 ， 从 而 保 护 了 样 品 分 子 。图 6.2 MALDI技 术 原 理 示

21、意 图 激 光 光 束 的 能 量 首 先 被 基 体 中 的 发 色 团 吸 收 ， 随 后 这 些基 体 迅 速 蒸 发 为 气 相 ， 被 包 含 的 样 品 分 子 被 带 入 气 相 ，而 离 子 化 的 产 生 是 由 于 受 激 的 基 体 分 子 将 质 子 转 移 给 样品 分 子 。 这 样 离 子 被 引 入 质 量 分 析 器 ， 测 量 m /z得 到 质谱 图 ， 并 提 供 其 离 子 同 位 素 的 分 布 信 息 。MALDI-MS的 实 验 参 数 包 括 ：基 体 和 基 体 /分 析 物 ， 激 光 功 率 ， 波 长 ， 脉 冲 宽 度 及 记 录模

22、式 (正 离 子 或 负 离 子 )。N2激 光 由 于 在 UV段 (337nm)有 较 好 的 性 能 ， 而 被 广 泛 应用 于 MALDI仪 器 中 。 MALDI中 的 基 体 起 着 如 下 几 种 重 要 作 用 ：（ 1） 基 体 相 当 于 样 品 分 子 的 溶 剂 ， 样 品 分 子 被 基 体彼 此 分 开 ， 从 而 消 弱 了 样 品 之 间 的 相 互 作 用 ；（ 2） 基 体 分 子 从 脉 冲 激 光 中 吸 收 足 够 的 能 量 ， 隔 离样 品 分 子 ， 提 供 光 激 发 的 酸 或 减 基 团 ， 以 及 在 离 子 -分 子 碰 撞 中 电

23、离 样 品 分 子 。 选 择 MALDI的 基 体 主 要 要 求 如 下 ：(1) 对 激 光 有 高 的 吸 收 系 数 ；(2) 与 样 品 能 够 溶 于 同 一 种 溶 剂 中 ；(3) 具 有 真 空 稳 定 性 ；(4) 对 普 遍 存 在 于 生 物 溶 液 中 的 无 机 盐 及 缓 冲 液 等 污 染 物 具 有 包 容 性 。常 用 的 基 体 有 ：芥 子 酸 (SA)， 2,5-二 羟 基 苯 甲 酸 ， 咖 啡 酸 ， 吡 臻 酸 ，安 息 香 酸 ， 尼 古 丁 酸 等 。 MALDI-MS在 基 体 选 定 后 ， 准 备 样 品 的 方 法 有 两 种 ：(

24、1)Tanaka法 ： 1987年 Tanaka等 把 待 测 的 生 物 样 品 溶 于 甘 油 中 ， 并 与 很 细 的 金 属 粉末 混 合 ， 然 后 把 悬 浮 液 滴 到 探 头 上 ， 让 激 光 照 射 ， 再 进 入 质 谱 分析 。 灵 敏 度 10-9 mol数 量 级 。(2) Hillenkamp法 ： 1988年 Hillenkamp等 认 为 激 光 解 吸 时 是 底 物 吸 收 激 光 ， 提 出 了 “基 体 辅 助 激 光 解 吸 ” 的 概 念 。 将 烟 酸 和 生 物 样 品 混 合 溶 液 滴 到探 头 上 ， 干 燥 后 ， 用 激 光 照 射

25、 ， 即 可 得 到 生 物 分 子 离 子 信 号 。灵 敏 度 10 -12 mol数 量 级 ， 且 信 号 强 ， 信 噪 比 高 ， 被 广 泛 采 用 。问 题 ： 为 什 么 Tanaka获 得 了 Nobel 化 学 奖 ， 而 非 Hillenkamp? MALDI的 优 缺 点 ：优 点 ： 对 样 品 要 求 低 ， 能 耐 高 浓 度 盐 、 缓 冲 剂和 其 他 非 挥 发 性 成 分 。 高 灵 敏 度 ， 样 品 量 只 需要 1pmol， 甚 至 更 少 。缺 点 ： 大 质 量 离 子 检 测 较 困 难 。 离 子 型 表 面 活性 剂 和 低 挥 发 性

26、溶 剂 干 扰 严 重 ， 和 其 他 进 样 技术 联 用 困 难 等 。 MALDI可 以 与 不 同 类 型 的 检 测 器 相 互 结 合 ， 特 别 是飞 行 时 间 质 谱 (TOF)， 即 MALDI-TOF质 谱 ！ 图 6.3 The Agilent Pulsed Dynamic Focusing MALDI (PDF-MALDI) 图 6.4 MALDI-TOF-MS的 实 际 图 MALDI-TOF MS中 样 品 离 子 化将 TOF谱 图 转 化 为 常 规谱 图 图 6.5 The MALDI-TOF Spectra for Poly(Propylene Glyco

27、l) 摘 自 ： Anal.Chem.,2004,76,1532-1536.RichardB.vanBreemanetal图 6.6 6.2.5 大 气 压 电 离 质 谱 方 法API-MS指 在 大 气 压 下 使 样 品 有 效 地 电 离 并 引 入 与 质 谱 的接 口 ， 再 进 行 质 谱 分 析 。API-MS的 工 作 模 式 ： (1) 电 喷 雾 (ESI)； (2) 气 动 辅 助 电 喷雾 (又 称 离 子 喷 雾 , IS)； (3) 大 气 压 碰 撞 电 离 (APCI)； （ 4）解 吸 电 喷 雾 电 离 质 谱 (desorption electrospr

28、ay ionization Mass spectrometry, DESI-MS)。 API-MS 可 以 测 定 的 分 子质 量 范 围 是 100 100000Da， 精 度 很 容 易 达 到 飞 克 级 至 皮克 级 的 绝 对 灵 敏 度 ， 可 适 用 的 化 合 物 的 范 围 非 常 广 泛 。 可与 四 极 杆 、 离 子 阱 、 飞 行 时 间 质 谱 等 组 合 。 可 与 许 多 进 样技 术 兼 容 ， 如 FIA, HPLC, CE等 。 API-MS的 四 种 工 作 模 式 的 特 点 ：(1) 电 喷 雾 (ESI)： 离 子 化 过 程 应 用 电 场 来

29、 产 生 带 电 液 滴 ， 然 后 通 过 离 子 蒸 发 将 分 析 物 离 子 送 入 MS分 析 。(2) 气 动 辅 助 电 喷 雾 ： 具 有 上 述 电 喷 雾 的 特 点 ， 但 最 初 的 液 滴 形 成 是 由 辅 气 (如 N2)帮 助 雾 化 的 结 果 。 (3) 大 气 压 化 学 (碰 撞 )电 离 ： 利 用 一 种 气 态 化 学 反 应 ， 气 体 溶 剂 (如 CH4)作 为 化 学 离 子 源 来 电 离 样 品 。(4) 解 吸 电 喷 雾 电 离 DESI)： 是 在 2004年 所 發 展 出 來 的 新 电 离 法 。利 用 探 針 產 生 帶

30、電 液 滴 ， 接 著 利 用 高 速 氮 氣 流 的 攜 帶 來 撞 擊分 析 物 表 面 ， 而 從 分 析 物 表 面 所 形 成 的 離 子 再 進 入 質 譜 儀作 分 析 。 电 喷 雾 的 电 离 机 理图 6.7 电 喷 雾 原 理 示 意 图 电 喷 雾 的 电 离 机 理(1) 小 分 子 离 子 蒸 发 机 理 ： 在 喷 针 针 头 与 施 加 电 压 的 电 极 之 间 形 成 强 电 场 该 电 场 使 液 体 带 电 ， 带 电 的 液 体 在 电 场 的 作 用 下 向 带 相 反 电 荷 的 电 极 运 动 ， 并 形 成 带 电 的 液 滴 ， 由 于 小

31、雾 滴 易 分 散 ， 比 表 面 增 大 ， 在 电 场 中 迅 速 蒸 发 ， 结 果 使 带 电 雾 滴 表 面 单 位 面 积 的 场 强 度 高 达 10 x108 V/cm2， 从 而 产 生 液 滴 的 “ 爆 裂 ” 。 重复 该 过 程 ， 最 终 产 生 分 子 离 子 。(2) 大 分 子 带 电 残 基 机 理 ： 首 先 也 是 电 场 使 溶 液 带 电 而 离 子 化 ， 结 果 形 成 带 电 雾 滴 ， 带 电 的 雾 滴 在 电 场 作 用 下 运 动 并 迅 速 去 溶 ， 溶 液 中 分 子 所 带 电 荷 在 去 溶 时 被 保 留 在 分 子 上 ，

32、 结 果 形 成 离 子 化 的 分 子 。 ESI电 离 的 一 个 主 要 特 点 是 可 以 在 大 气 压 下 蒸 发 样品 ， 离 子 化 过 程 温 和 ， 产 生 碎 片 极 少 ， 是 一 种 软 电离 方 法 。 ESI通 常 可 以 得 到 多 电 荷 分 子 离 子 ， 这 对于 测 量 大 分 子 意 义 重 大 。 由 于 大 分 子 可 以 带 10 100以 上 电 荷 ， 因 此 ， 其 质 荷 比 大 大 降 低 ， 可 用 普 通 质量 测 定 范 围 的 质 谱 仪 进 行 生 物 大 分 子 分 析 。 图 6.8 电 喷 雾 离 子 化 过 程 示 意

33、 图 电 喷 雾 的 一 般 理 论ESI放 电 电 压 (V0)与 表 面 张 力 (Ts)、 毛 细 管 半 径 ( r)及针 尖 与 采 样 板 间 距 离 (h)的 关 系 可 用 下 式 表 示 ：0 4lns hV T r r (6.1)在 实 验 中 虽 然 并 不 用 它 来 进 行 计 算 ， 但 却 可 以 定 性 地帮 助 理 解 电 喷 雾 的 条 件 。 ESI产 生 多 电 荷 离 子 ， 在 电 离 过 程 中 ， 喷 雾 中 颗 粒 带电 荷 数 q为 ： (6.2)式 中 ： 表 示 溶 液 的 表 面 张 力 常 数 o表 示 介 电 常 数 rs表 示 液

34、 滴 的 半 径电 喷 雾 离 子 一 般 每 多 1000相 对 分 子 质 量 可 以 多 带 一个 电 荷 。 30 s8q r 影 响 ESI过 程 的 因 素由 于 电 喷 雾 过 程 非 常 复 杂 ， 影 响 因 素 有 ：(1)离 子 化 与 否 主 要 与 被 分 析 分 子 的 pKa值 和 溶 液 的 pH有 关 ；(2) 喷 雾 状 态 与 表 面 张 力 和 黏 度 有 关 ， 另 外 ， 与 是 否 有 气 动 辅 助 喷 雾 也 有 关 (喷 雾 量 较 大 时 )；(3) 去 溶 好 坏 与 干 燥 气 体 的 温 度 和 流 量 有 关 ， 并 与 溶 剂 的

35、 蒸 发 热 H vap有 关 ；(4) 离 子 的 解 吸 与 它 的 溶 解 热 (气 态 )有 关 ；(5) 气 相 反 应 与 质 子 亲 和 势 和 电 荷 交 换 速 度 有 关 。 ESI电 离 的 优 点 ：(1) 被 检 测 分 子 变 成 气 相 离 子 时 没 有 受 到 外 部 能 量 的 激 发 ， 因而 不 会 发 生 裂 解 ， 没 有 碎 片 峰 ， 因 此 谱 图 解 析 相 对 简 单 ；(2)对 于 多 级 质 谱 ， 通 过 碰 撞 诱 导 裂 解 （ CID） 可 以 产 生 碎 片 ，从 而 提 供 分 子 的 结 构 信 息 。 电 喷 雾 质 谱

36、 不 仅 能 够 产 生 多 电 荷 离子 、 对 某 些 极 性 物 质 电 离 效 率 高 （ 对 蛋 白 质 接 近 100 %） ， 而且 具 有 软 电 离 等 特 性 ， 因 而 成 为 极 性 化 合 物 （ 包 括 溶 液 中 的 离子 ） ， 热 稳 定 性 差 和 高 分 子 量 化 合 物 分 析 最 有 效 的 工 具 之 一 。(3)在 常 规 电 喷 雾 电 离 技 术 中 ， 喷 雾 过 程 容 易 形 成 较 大 液 滴 ， 液滴 中 的 样 品 分 子 不 能 完 全 离 子 化 ， 因 而 降 低 了 样 品 的 利 用 率 和质 谱 检 测 灵 敏 度 。

37、 近 几 年 发 展 起 来 的 纳 升 电 喷 雾 方 法 (Nanospray)， 采 用 内 径 为 10 m左 右 的 喷 针 ， 样 品 注 入 到 喷 针的 喷 口 ， 在 喷 口 前 端 产 生 喷 雾 ， 喷 雾 液 滴 比 常 规 电 喷 雾 产 生 的小 100倍 ， 这 样 可 以 使 样 品 被 充 分 利 用 ， 并 有 效 离 子 化 。 与 常 规电 喷 雾 电 离 技 术 相 比 ， Nanospray流 量 极 低 ， 样 品 消 耗 量 极 少 ， 灵 敏 度 可 以 达 到 fmol。 图 6.9 电 喷 雾 质 谱 仪 图 6.10 典 型 的 电 喷

38、雾 质 谱 图 6.3 液 相 色 谱 质 谱 联 用作 为 化 学 领 域 最 强 有 力 的 分 离 分 析 技 术 之 一 ， 自 上 世 纪 70年 代 以来 ， 液 相 色 谱 (LC)， 特 别 是 高 效 液 相 色 谱 （ HPLC） 得 到 了 迅 速的 发 展 ， 无 论 在 色 谱 基 础 理 论 ， 还 是 在 仪 器 性 能 方 面 都 得 到 了 很大 程 度 的 提 高 和 完 善 。 随 着 应 用 领 域 的 不 断 拓 展 ， LC在 环 境 分析 、 生 化 分 析 、 医 药 分 析 和 药 物 质 量 控 制 等 方 面 的 应 用 也 越 来 越广

39、泛 ， 尤 其 是 随 着 生 命 科 学 研 究 的 不 断 深 入 ， LC已 经 成 为 一 种极 为 重 要 和 必 不 可 少 的 分 离 分 析 手 段 。 LC虽 然 在 复 杂 样 品 分 析 中 显 示 出 很 高 的 分 离 效 率 ， 而 且 定 量 准确 ， 但 其 定 性 分 析 能 力 却 较 为 薄 弱 ， 通 常 仅 仅 是 根 据 各 组 分 的保 留 特 性 来 定 性 ， 这 在 复 杂 样 品 分 析 中 ， 尤 其 在 未 知 组 分 的 定 性分 析 中 具 有 一 定 的 难 度 （ 可 信 度 差 和 无 标 准 品 ） 。 6.3.1 概 述

40、然 而 ， 随 着 一 些 新 的 定 性 分 析 手 段 的 出 现 ， 尤 其 是 质 谱 仪 器 的发 展 ， 对 一 些 组 分 相 对 简 单 的 样 品 进 行 定 性 分 析 已 经 变 得 比 较容 易 。质 量 是 物 质 的 固 有 特 征 之 一 ， 质 谱 分 析 中 ， 表 现 为 不 同 荷 质 比的 化 合 物 对 应 不 同 的 离 子 谱 峰 ， 由 此 ， 根 据 质 谱 分 析 结 果 可 以获 得 被 分 析 物 的 分 子 量 ， 从 而 实 现 对 各 物 质 进 行 定 性 分 析 ， 另外 ， 离 子 谱 峰 的 强 度 与 其 所 代 表 的

41、化 合 物 含 量 有 一 定 关 系 ， 所以 ， 利 用 这 一 点 可 以 对 各 物 质 进 行 半 定 量 分 析 。质 谱 分 析 虽 然 具 有 灵 敏 度 高 、 鉴 别 能 力 强 等 优 点 ， 但 是 由 于 离子 抑 制 效 应 等 的 影 响 在 复 杂 样 品 定 性 分 析 中 却 具 有 一 定 困 难 。由 此 可 以 看 出 ， 如 果 把 LC分 离 和 质 谱 分 析 有 机 结 合 起 来 ， 充 分发 挥 它 们 各 自 的 优 点 ， 取 长 补 短 ， 就 可 以 有 效 的 对 复 杂 样 品 进行 定 性 和 定 量 分 析 ， 因 此 ，

42、LC-质 谱 联 用 技 术 逐 渐 被 广 大 科 研工 作 者 所 关 注 。 液 相 色 谱 -质 谱 联 用 技 术 的 研 究 始 于 20世 纪 70年 代 ，90年 代 以 后 ， 由 于 大 气 压 电 离 技 术 的 出 现 和 成 功应 用 以 及 质 谱 本 身 的 发 展 ， 液 相 色 谱 与 质 谱 的 联用 得 到 了 极 大 的 重 视 和 发 展 。 液 相 色 谱 -质 谱 联 用技 术 将 液 相 色 谱 的 高 分 离 效 能 和 质 谱 的 高 灵 敏 度及 较 强 的 结 构 解 析 能 力 有 机 的 结 合 在 一 起 ， 样 品经 过 液 相

43、色 谱 分 离 后 ， 借 助 质 谱 分 析 结 果 进 行 鉴定 ， 开 辟 了 复 杂 样 品 分 离 和 检 测 的 新 天 地 。 串 联 质 谱 （ MS/MS， Tandem MS, MSn） 技 术 是质 谱 分 析 中 的 重 要 联 用 技 术 ， 不 仅 可 以 给 出 样 品分 子 量 的 相 关 信 息 ， 而 且 还 可 以 给 出 有 关 样 品 结构 的 丰 富 信 息 。 串 联 质 谱 （ MS/MS） 技 术 包 括 三个 过 程 ： 即 用 来 进 行 质 量 分 离 的 第 一 级 质 谱（ MS1） ， 碰 撞 活 化 离 解 和 用 来 进 行 质

44、 谱 检 测 的第 二 级 质 谱 （ MS2） 。 其 中 碰 撞 活 化 离 解 是 使 运动 中 的 离 子 和 中 性 惰 性 气 体 进 行 碰 撞 、 继 而 发 生碰 撞 活 化 离 解 的 过 程 。 另 外 ， 液 相 色 谱 与 单 级 质 谱 联 用 （ LC-MS）虽 然 已 经 具 有 足 够 高 的 灵 敏 度 ， 但 是 仅 能 提供 分 子 量 信 息 ， 而 液 相 色 谱 与 多 级 质 谱 联 用（ LC-MS/MS） 则 可 提 供 分 子 结 构 的 信 息 ，此 外 ， 通 过 MS/MS的 选 择 反 应 控 制 模 式(SRM) 或 多 反 应

45、检 测 模 式 (MRM)可 以 提 高信 噪 比 ， 在 复 杂 样 品 分 析 时 仍 可 达 到 很 高 的灵 敏 度 。 6.3.2 液 相 色 谱 -质 谱 联 用 接 口 技 术例 如 HPLC与 MS接 口 的 主 要 问 题 （ 1） HPLC流 出 物 如 果 全 部气 化 ， 可 产 生 500 1000 mL/min的 气 体 ， 而 MS采 样 仅 能 接 受10 50 mL/min的 气 体 ； （ 2） 通 用 的 气 相 电 离 方 法 一 般 不 适 用于 HPLC分 离 后 的 化 合 物 （ 具 有 热 不 稳 定 性 、 极 性 和 较 高 分 子量 ）

46、。为 实 现 液 相 色 谱 与 质 谱 的 联 用 ， 需 要 解 决 液 相 色 谱 流 动 相 对质 谱 工 作 条 件 的 影 响 的 问 题 ， 为 此 可 以 通 过 以 下 两 个 途 径 实现 ：一 是 发 展 不 同 接 口 以 协 调 LC和 MS的 不 同 要 求 ；二 是 改 进 液 相 色 谱 技 术 ， 如 发 展 微 柱 液 相 色 谱 ， 减 少 进 入 质谱 流 动 相 的 量 ， 改 进 质 谱 的 离 子 化 方 法 ， 使 它 们 两 者 之 间 逐渐 靠 近 。 液 相 色 谱 -质 谱 联 用 的 实 现 ， 接 口 技 术 一 度 成 为 其 发

47、展的 瓶 颈 。 在 接 口 研 制 方 面 ， 前 后 共 发 展 了 20多 种 技 术 ，其 中 主 要 有 直 接 导 入 接 口 （ DLI） 、 移 动 带 接 口（ MB） 、 热 喷 雾 接 口 （ ES） 、 粒 子 束 接 口 （ PB） 、和 快 原 子 轰 击 （ FAB） 等 ， 但 这 些 技 术 都 不 同 程 度 的存 在 一 些 方 面 的 限 制 和 缺 陷 。 近 几 年 来 ， 随 着 一 系 列质 谱 软 电 离 技 术 的 实 现 和 发 展 ， 尤 其 是 随 着 大 气 压 离子 化 接 口 (API)技 术 和 基 体 辅 助 激 光 解 吸

48、离 子 化 接 口（ MALDI） 技 术 的 不 断 成 熟 和 完 善 ， 液 相 色 谱 -质 谱联 用 技 术 不 仅 得 到 了 突 破 性 的 进 展 ， 而 且 在 生 命 科 学中 的 应 用 也 得 到 了 前 所 未 有 的 拓 展 。 理 想 的 LC-MS接 口 应 具 有 如 下 的 特 点 ：（ 1） 高 效 率 的 样 品 转 移 ， 可 接 受 的 样 品 转 移 精 度 ；（ 2） 可 适 应 不 同 的 LC方 法 ；（ 3） 可 适 应 不 同 的 质 谱 操 作 条 件 ；（ 4） 样 品 在 转 移 过 程 中 不 被 分 解 损 失 ；（ 5） 高

49、速 、 方 便 可 靠 ， 对 操 作 人 员 的 技 术 要 求 不 高 。 6.3.2.1 大 气 压 离 子 化 接 口 技 术 大 气 压 离 子 化 接 口 是 指 离 子 化 在 常 压 下 进 行 的接 口 ， 是 目 前 液 相 色 谱 -质 谱 联 用 技 术 中 应 用范 围 最 广 的 一 种 接 口 。 API主 要 包 括 电 喷 雾 电离 （ ESI） 和 大 气 压 化 学 电 离 （ APCI） 两 种操 作 模 式 。 。 该 电 离 技 术 利 用 位 于 一 根 毛 细 管 和 质 谱 仪 进 口 间 的 电势 差 生 成 离 子 ， 在 电 场 的 作

50、用 下 产 生 以 喷 雾 形 式 存 在的 带 电 液 滴 ， 当 使 用 干 燥 气 体 或 者 加 热 时 ， 溶 剂 蒸 发 ，带 电 液 滴 体 积 缩 小 ， 电 场 增 强 ， 离 子 向 液 滴 表 面 移 动并 从 表 面 挥 发 ， 最 终 生 成 单 电 荷 或 多 电 荷 去 溶 剂 化 离子 。 通 常 情 况 下 ， 小 分 子 生 成 M+H+或 M-H-单 电 荷离 子 ， 生 物 大 分 子 产 生 多 电 荷 离 子 。 图 6.11 电 喷 雾 电 离接 口 示 意 图 图 6.12 大 气 压 化 学 电 离 接 口 示 意 图是 将 化 学 电 离 原

51、 理 延 伸 到 大 气 压 下 进 行 的 一 种 新 的 软 电 离 技术 。 样 品 溶 液 从 LC流 出 ， 进 入 具 有 雾 化 气 套 管 的 毛 细 管 后 ，被 氮 气 流 雾 化 ， 然 后 在 通 过 加 热 管 时 被 气 化 ， 气 化 后 的 溶 剂分 子 在 加 热 管 端 的 电 晕 放 电 探 针 处 形 成 反 应 气 等 离 子 体 ， 样品 分 子 通 过 与 反 应 气 等 离 子 体 进 行 质 子 交 换 被 电 离 ， 形 成 准分 子 离 子 M+H+或 M-H-， 最 后 ， 样 品 分 子 的 准 分 子 离 子 通过 筛 选 狭 缝 进

52、 入 质 谱 仪 ， 整 个 过 程 在 大 气 压 条 件 下 完 成 。 APCI（ 大 气 压 化 学 电 离 ） 也 是 一 种 软 电 离 接 口技 术 ， 电 离 过 程 中 只 产 生 单 电 荷 峰 ， 非 常 适 合弱 极 性 小 分 子 化 合 物 的 测 定 ， 另 外 ， APCI还 与高 流 量 的 梯 度 洗 脱 和 高 低 水 溶 液 变 换 的 流 动 相兼 容 ， 通 过 调 节 离 子 源 电 压 ， 可 以 得 到 不 同 断裂 程 度 的 质 谱 图 。 无套流CE-ESI 接口nLC-ESI 接口Z喷雾ESI源 图6.13 直接将CE与ESI-MS连接

53、的 接口设计 6.3.2.2 LC与 MALDI接 口 技 术LC与 MALDI的 联 用 目 前 正 在 发 展 中 ， 从 离 子 化的 原 理 看 ， 存 在 一 些 实 际 困 难 ！ 作 为 分 离 科 学 领 域 中 最 强 有 力 的 分 离 分 析 工 具 之 一 ， 液 相 色 谱 对组 分 相 对 简 单 样 品 的 分 离 采 用 一 维 分 离 模 式 完 成 ， 但 是 对 于 一 些组 分 复 杂 的 样 品 而 言 ， 如 果 仅 采 用 一 维 色 谱 分 离 模 式 ， 无 论 怎 样优 化 色 谱 分 离 条 件 ， 也 无 法 使 所 有 的 组 分 都

54、能 达 到 满 意 的 分 离 。Davis等 曾 经 指 出 : 只 用 一 维 分 离 方 法 对 含 有 100个 随 机 分 布 组 分的 样 品 进 行 分 离 ， 完 全 分 离 其 中 的 82个 组 分 大 约 需 要 四 百 万 理 论塔 板 数 。 显 然 ， 期 望 具 有 如 此 之 高 柱 效 的 色 谱 柱 在 目 前 看 来 是 不切 合 实 际 的 。 而 与 一 维 色 谱 相 比 ， 近 几 年 来 得 到 迅 速 发 展 和 广 泛应 用 的 多 维 液 相 色 谱 (Multidimensional high-performance liquid chr

55、omatography， MDLC)不 仅 能 够 提 供 更 大 的 峰 容 量 ， 而且 还 具 有 分 离 样 品 动 态 范 围 宽 、 分 辨 率 高 和 自 动 化 程 度 高 等 优 点 ，它 的 出 现 不 仅 很 好 的 解 决 了 复 杂 样 品 的 分 离 分 析 问 题 ， 而 且 大 大提 高 了 液 相 色 谱 的 分 离 能 力 和 选 择 性 。 因 此 ， 多 维 液 相 色 谱 与 质谱 联 用 也 越 来 越 被 重 视 并 得 到 迅 速 发 展 ， 所 以 ， 根 据 联 用 体 系 中液 相 色 谱 的 维 数 多 少 ， 液 相 色 谱 -质 谱

56、在 线 联 用 技 术 又 可 以 分 为 一维 液 相 色 谱 -质 谱 在 线 联 用 模 式 和 多 维 液 相 色 谱 -质 谱 在 线 联 用 模 式 。 图 6.14 多 维 液 相 色 谱 分 离 模 式(a) 2D-SEC-RPLC-MS; (b) 多 维蛋 白 质 识 别 技 术SEC 尺 寸 排 阻 色 谱RPLC 反 相 色 谱 column 2 column 1 sample loop 2 sample loop 1 waste computer UV detector MS detector pump 1 pump 2 图 6.15 全 二 维 液 相 色 谱 -质

57、谱 联 用 装 置 原 理 示 意 图 a b c图 6.16 川 芎 甲 醇 提 取 液 的 二 维 分 离 色 谱 图 6.4 电 化 学 光 谱 联 用电 化 学 技 术 主 要 涉 及 电 流 、 电 势 和 电 量 的 变 化 ， 在 工 农 业 和 日常 生 活 中 发 挥 重 要 作 用 (葡 萄 糖 传 感 器 和 各 种 电 池 )， 但 采 用 电 化学 技 术 很 难 得 到 物 质 结 构 方 面 的 信 息 。 因 此 ， 有 必 要 将 电 化 学 技术 和 其 他 方 法 进 行 联 用 。与 电 化 学 技 术 联 用 的 方 法 最 常 见 的 是 各 种 光

58、 谱 学 技 术 。 这 些 技 术分 为 现 场 (in situ)和 非 现 场 (ex situ)方 法 。 现 场 方 法 是 在 控 制 电 势或 电 流 时 考 察 电 解 池 溶 液 中 的 电 极 表 面 ； 在 采 用 非 现 场 技 术 时 ，电 极 是 从 电 化 学 池 中 拿 走 ， 然 后 进 行 测 量 ， 经 常 是 在 空 气 或 真 空中 进 行 。在 此 主 要 讨 论 现 场 方 法 。 6.4.1 与 紫 外 和 可 见 光 谱 联 用图 6.17 透 射 光 谱 电 化 学 实 验 装 置 示 意 图光 透 电 极 (optically transp

59、arent electrode, OTE)A 透 射 实 验 图 6.18 (a)用 于 半 无 限 扩 散 实 验 的 透 射 光 谱 电 化 学 池 。 光 束 从垂 直 方 向 通 过 ； (b)光 透 薄 层 体 系 ： 正 视 和 侧 视 图 。 图 6.19 采 用 在 SnO2 OTE电 极 上产 生 甲 基 紫 精 自 由 基 的 电 量 滴 定细 胞 色 素 c和 细 胞 色 素 c氧 化 酶 。在 溶 液 中 ， 一 个 甲 基 紫 精 自 由 基可 还 原 细 胞 色 素 c中 的 一 个 血 红 素或 细 胞 色 素 c氧 化 酶 中 的 两 个 血 红素 中 的 一

60、个 。 实 验 结 果 表 明 细 胞色 素 c氧 化 酶 中 的 一 个 血 红 素 基 团首 先 被 还 原 ， 然 后 甲 基 紫 精 自 由基 在 还 原 细 胞 色 素 c氧 化 酶 中 的 第二 个 血 红 素 之 前 ， 还 原 细 胞 色 素 c中 的 血 红 素 。 6.4.2 与 振 动 光 谱 的 联 用A 红 外 光 谱在 红 外 光 谱 电 化 学 (infrared spectroelectrochemistry, IR-SEC)中 ，被 探 测 物 质 在 电 极 表 面 和 距 电 极 表 面 很 薄 的 溶 液 层 中 。 常 用 的 外反 射 模 式 如 图

61、 6.20所 示 。 IR辐 射窗 口薄 溶 液 层图 6.20 红 外 光 谱 电 化 学 的 外 反 射 示 意 图 图 6.21 IR-SEC的 光 谱 电 化 学 池 由 于 大 多 数 溶 剂 对 红 外 辐 射 有 较 强 的 吸 收 ， 所 以 窗 口 和 电 极 之 间的 溶 液 薄 层 必 须 很 小 (1-100 nm)。 为 了 得 到 有 用 的 信 号 ， 通 常 采用 对 电 势 或 入 射 光 进 行 调 制 。 电 势 调 制 红 外 技 术 称 为 EMIRS， 即电 化 学 调 制 红 外 反 射 光 谱 法 (electrochemically modul

62、ated infrared spectroscopy)。 图 6.22 EMIRS实 验 的 仪 器 方 框 图 振 荡 器 改 变 电 极 电 势 ， 并 且 为 相 敏 检 测 器 (PDS)提 供 一 个 参 比 信 号 。 检 测 器 调 制 的IR信 号 也 反 馈 到 PDS。 大 多 数 现 代 IR光 谱 仪 具 备 Fourier变 换 的 多 种 优 点 。 相 应 的 IR-SEC技 术 是 SNIFTIRS， 即 差 减 归 一 化 界 面 Fourier变 换 红 外 光 谱 法 (Substractively normalized interfacial Fouri

63、er transform infraredspectroscopy)。 图 6.23 SNIFTIRS仪 器 的 方 框 图 光 源 、 干 涉 仪 、 检 测 器 和 数 据 存 取 通 常 与 一 个 商 品 化 的 FTIR仪 器 相 同 引 自 J.K.Foley, C.Korzeniewski, J.L. Daschbach and S. Pons, Electroanal.Chem., 14, 309(1986) 图 6.24 在 不 同 的 波 数 区 域 和 在 1mol/L HClO4溶 液 中 对 -二 氯 苯在 Pt电 极 上 的 SNIFTIRS光 谱 图 。每 条 曲

64、 线 是 在 0.2 V和 0.4 V(相 对 于 NHE)处 记 录 的 光 谱 的 差 值 。 负 峰 相 应 于 在 0.4 V处的 特 征 主 峰 ， 正 峰 相 应 于 在 0.2 V处 的 特 征 主 峰 。 B 拉 曼 光 谱拉 曼 光 谱 提 供 与 IR光 谱 互 补 的 分 子 振 动 信 息 。 由 于 激 发 和 测 量 均在 可 见 光 区 ， 电 化 学 池 可 采 用 玻 璃 窗 和 水 溶 液 (两 者 均 对 红 外 有 强吸 收 )。 拉 曼 散 射 的 概 率 取 决 于 一 些 确 定 的 选 择 规 律 ， 但 在 大 多 数情 况 下 是 很 低 的

65、 ， 因 此 实 验 必 须 采 用 强 光 源 和 较 高 的 样 品 浓 度 。图 6.25 具 有 激 光 激 发 和 电 荷 偶 合 装 置 (charge-coupled device, CCD)作 为 检 测 器 的 Raman光 谱 仪 的 方 框 图 。 当 分 子 吸 附 在 特 定 的 表 面 (例 如 银 或 金 )时 ， 拉 曼 效 应 可 以 得 到很 大 的 增 强 ， 据 此 所 发 展 的 方 法 称 为 表 面 增 强 拉 曼 光 谱 法 (surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)。 SERS的 Raman信 号 增

66、 强 105 106倍 。 图 6.26 在 波 长 514.5 nm激 光 激 发 下 ， 在 三 种 不 同 波 长 区 内 测得 的 吸 附 在 Ag电 极 上 的 Os(NH3)5py3+的 SERS光 谱 与 电 势 (尺 度 标在 右 侧 )关 系 图 最 近 的 一 个 有 意 义 的 发 现 是 ， 从 观 察 负 载 有 吸 附 分 子(例 如 罗 丹 明 6G)的 Ag颗 粒 ， 当 采 用 波 长 为 514.5 nm激发 光 时 ， 当 这 些 “ 热 ” 颗 粒 的 大 小 在 80 100 nm时 ， 相对 于 粗 糙 表 面 具 有 非 常 大 的 增 强 因 子 (约 1014)， 这 种巨 大 的 增 强 可 用 于 观 察 单 分 子 的 Raman图 谱 。S. Nie and S.R.Emory, Science, 275, 1102(1997) 6.4.3 与 表 面 等 离 子 体 共 振 的 联 用表 面 等 离 子 体 共 振 (surface plasmon resonance, SPR)所 采 用 的 电 极是 沉 积 在 一 个 玻