分子发光分析法修改

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1、2021-5-15 第 八 章第 八 章第 八 章 分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法 一 、 分 子 荧 光 (MF)分 析 法 二 、 分 子 磷 光 (MP)分 析 法 三 、 化 学 发 光 分 析 法 2021-5-15 第 七 章第 七 章第 七 章 分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法 2021-5-15 第 七 章第 七 章第 七 章 分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法 2021-5-15 第 七 章第 七 章第 七 章 分 子 发 光 分 析 法分

2、 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法 一 、 分 子 荧 光 与 磷 光 产 生 过程二 、 激 发 光 谱 与 荧 光 光 谱三 、 荧 光 的 产 生 与 分 子 结 构关 系四 、 影 响 荧 光 强 度 的 因 素第 一 节第 一 节第 一 节 分 子 荧 光 与 磷 光分 子 荧 光 与 磷 光分 子 荧 光 与 磷 光 2021-5-15 基 态 分 子 吸 收 能 量 (电 能 、 热 能 、 化 学 能 或 光 能 等 ) ， 电子 由 基 态 跃 迁 到 激 发 态 ， 当 电 子 由 激 发 态 返 回 基 态 时 发 射 电磁 辐 射 (即 光 )的 形 式

3、 释 放 能 量 ， 就 称 为 “ 发 光 ” 。 M + 能 量 M* M + 热 量 M + h 分 子 吸 收 了 光 能 而 被 激 发 ， 跃 迁 至 振 动 能 级 的 三 重 态 或单 重 态 ， 回 到 基 态 所 发 射 的 电 磁 辐 射 ， 称 为 荧 光 和 磷 光 。 M + h M* M + h 荧 光 和 磷 光 属 于 光 致 发 光 。一 、 荧 光 与 磷 光 的 产 生 过 程一 、 荧 光 与 磷 光 的 产 生 过 程一 、 荧 光 与 磷 光 的 产 生 过 程 2021-5-15 一 、 荧 光 与 磷 光 的 产 生 过 程一 、 荧 光 与

4、磷 光 的 产 生 过 程一 、 荧 光 与 磷 光 的 产 生 过 程 依 据 分 子 结 构 理 论 讨 论 荧 光 及 磷 光 的 产 生 机 理 。1. 分 子 能 级 与 跃 迁 分 子 发 光 属 于 分 子 发 射 光 谱 的 范 畴 ， 光 发 射 过 程 涉 及 分 子内 部 电 子 能 级 的 跃 迁 。 基 态 (S0)激 发 态 (S1、 S2 .)： 吸 收 特 定 频 率 的 辐 射 ； 量子 化 ； 跃 迁 一 次 到 位 ； 激 发 态 基 态 ： 多 种 途 径 和 方 式 , 速 度 最 快 、 激 发 态 寿 命最 短 的 途 径 占 优 势 。 第 一

5、、 第 二 、 电 子 激 发 单 重 态 S 1 、 S2 ； 第 一 、 第 二 、 电 子 激 发 三 重 态 T1 、 T2 。 2021-5-15 2.电 子 激 发 态 的 多 重 度电 子 激 发 态 的 多 重 度电 子 激 发 态 的 多 重 度 电 子 激 发 态 的 多 重 度 ： M=2S+1 S为 电 子 自 旋 量 子 数 的 代 数 和 (0或 1)。 平 行 自 旋 比 成 对 自 旋 稳 定 （ 洪 特 规 则 ） ， 因 此 ， 在 同 一 激发 态 中 ， 三 重 态 能 级 比 相 应 单 重 态 能 级 低 。 大 多 数 有 机 分 子 的 基 态

6、处 于 单 重 态 。 S 0T1 禁 阻 跃 迁 ；通 过 其 他 途 径 (系 间 跨越 )； 进 入 的 几 率 小 。 2021-5-15 S2 S1S 0 T1吸收 发射荧光 发射磷光 系 间 跨 越内 转 换 振 动 弛 豫能量 l 2l 1 l 3 外 转 换l 2 T2 内 转 换 振 动 弛 豫 外 转 换 使 荧 光 或 磷 光 减 弱 或 “ 猝 灭 ” 。 2021-5-15 3.激 发 态激 发 态激 发 态 基 态 的 能 量 传 递 途 径基 态 的 能 量 传 递 途 径基 态 的 能 量 传 递 途 径 电 子 处 于 激 发 态 是 不 稳 定 状 态 ，

7、返 回 基 态 时 ， 通 过 辐 射跃 迁 (发 光 )和 无 辐 射 跃 迁 (热 )等 方 式 失 去 能 量 。传 递 途 径辐 射 跃 迁荧 光 磷 光 内 转 移 外 转 移系 间 跨 越 振 动 弛 豫无 辐 射 跃 迁 激 发 态 停 留 时 间 短 、 返 回 速 度 快 的 途 径 ， 发 生 的 几 率 大 ，发 光 强 度 相 对 大 ；荧 光 ： 10 -7 10 -9 s, 第 一 激 发 单 重 态 的 最 低 振 动 能 级 基 态 ；磷 光 ： 10-4 10s, 第 一 激 发 三 重 态 的 最 低 振 动 能 级 基 态 。延 迟 荧 光 2021-5-

8、15 辐 射 能 量 传 递 过 程辐 射 能 量 传 递 过 程辐 射 能 量 传 递 过 程荧 光 发 射 ： 电 子 由 第 一 激 发 单 重 态 的 最 低 振 动 能 级 基 态 各振 动 能 级 (为 S1 S0跃 迁 )， 发 射 波 长 为 l 2的 荧 光 ； 发 射 时间 约 为 10-7 10 -9 s 。 发 射 荧 光 的 能 量 比 分 子 吸 收 的 能 量 小 ,波 长 长 。 磷 光 发 射 ： 电 子 由 第 一 激 发 三 重 态 的 最 低 振 动 能 级 基 态 各振 动 能 级 (T1 S0跃 迁 ) 。 发 光 速 度 很 慢 ： 10 -4 1

9、00 s 。 光 照 停 止 后 ， 可 持 续 一 段 时 间 。 电 子 由 S0进 入 T1的 可 能 过 程 ： （ S0 T1禁 阻 跃 迁 ） S0 激 发 态 振 动 弛 豫 内 转 换 系 间 跨 越 振 动 弛 豫 T1 2021-5-15 二 、 荧 光二 、 荧 光二 、 荧 光 (磷 光磷 光磷 光 )激 发 光 谱 与 发 射 光 谱激 发 光 谱 与 发 射 光 谱激 发 光 谱 与 发 射 光 谱1.激 发 光 谱 固 定 发 射 波 长 (选 最 大 发 射 波 长 ),扫 描 激 发 波 长 ， 可 获 得化 合 物 发 射 的 荧 光 (磷 光 )强 度 与

10、 激 发 波 长 的 关 系 曲 线 。 荧 光 和 磷 光 均 属 于 光 致 发 光 ， 都 涉 及 到 两 种 辐 射 ， 即 光的 吸 收 和 发 射 ， 因 而 也 都 具 有 两 种 特 征 光 谱 ， 即 激 发 光 谱 和发 射 光 谱 。 通 过 激 发 光 谱 ， 选 择 最 佳 激 发 波 长 发 射 荧 光 (磷 光 )强 度 最 大 的 激 发 光 波 长 ， 常 用 ex表 示 。 2021-5-15 2.发 射 光 谱发 射 光 谱发 射 光 谱 固 定 激 发 波长 (选 最 大 激 发 波长 ),扫 描 发 射 波长 ， 可 获 得 化 合物 发 射 的 荧

11、光 (或磷 光 )强 度 与 发 射波 长 关 系 曲 线 。 通 过 发 射 光 谱 选 择 最 佳 的 发 射 波 长 发 射 荧 光 (磷 光 )强 度 最 大 的 发 射 波 长 ， 常 用 em表 示 。 200 260 320 380 440 500 560 620 荧 光 激 发 光 谱 荧 光 发 射 光 谱 磷 光 光 谱 室 温 下 菲 的 乙 醇 溶 液 荧 （ 磷 ） 光 光 谱 2021-5-15 3.荧 光 光 谱 的 基 本 特 征荧 光 光 谱 的 基 本 特 征荧 光 光 谱 的 基 本 特 征a.Stokes位 移 激 发 光 谱 与 发 射 光 谱 之 间

12、 的 波 长 差 值 。 发 射 光 谱 的 波 长 比激 发 光 谱 的 长 。产 生 原 因 ： 激 发 态 分 子 由 于 振 动 弛 豫 及 内 部 转 移 的 无 辐 射 跃 迁 ， 是 产生 位 移 主 要 原 因 ； 荧 光 发 射 时 ， 分 子 基 态 不 同 振 动 能 级 也 发 生 振 动 弛 豫 至 最低 振 动 能 级 ， 也 造 成 能 量 的 损 失 ； 外 转 换 。 2021-5-15 3.荧 光 光 谱 的 基 本 特 征荧 光 光 谱 的 基 本 特 征荧 光 光 谱 的 基 本 特 征b.发 射 光 谱 的 形 状 与 激 发 波 长 无 关 电 子

13、跃 迁 到 不 同 激 发 态 能 级 ， 吸 收 不 同 波 长 的 能 量 (如 能级 图 l2 , l1)， 产 生 不 同 吸 收 带 ， 但 均 回 到 第 一 激 发 单 重 态 的最 低 振 动 能 级 再 跃 迁 回 到 基 态 各 振 动 能 级 ， 产 生 波 长 一 定 的荧 光 (如 l2 )。 c.荧 光 发 射 光 谱 与 吸 收 光 谱 成 镜 像 关 系 通 常 荧 光 发 射 光 谱 与 它 的 吸 收 光 谱 （ 与 激 发 光 谱 形 状 一样 ） 成 镜 像 对 称 关 系 。 可 由 荧 光 发 射 光 谱 和 吸 收 光 谱 的 成 因 来 解 释

14、。 2021-5-15 镜 像 规 则 产 生 原 因 ：镜 像 规 则 产 生 原 因 ：镜 像 规 则 产 生 原 因 ： (b) 基 态 上 的各 振 动 能 级 分 布 与第 一 激 发 态 上 的 各振 动 能 级 分 布 是 相似 的 。 (a) 激 发 光 谱 (吸 收 谱 ) 的 形状 表 明 了 分 子 第 一 激 发 单 重 态的 振 动 能 级 结 构 ， 荧 光 光 谱 (发射 光 谱 )表 明 了 分 子 基 态 的 振 动能 级 结 构 。 2021-5-15 镜 像 规 则 产 生 原 因 ：镜 像 规 则 产 生 原 因 ：镜 像 规 则 产 生 原 因 ：(c

15、) 根 据 Frank-Condon原 理 ， 电 子 跃 迁 过 程 中 核 的 相 对 位 置不 变 （ 近 似 的 ） ， 若 吸 收 光 谱 中 某 一 振 动 带 的 跃 迁 几 率 最大 ， 则 在 荧 光 发 射 光 谱 中 ， 其 相 反 跃 迁 的 几 率 也 应 最 大 (说明 高 峰 对 高 峰 ， 低 峰 对 低 峰 ） 非 镜 像 对 称 的 峰 出 现 ， 则 表 示 有 散 射 光 或 杂 质 存 在 。基 于 上 述 原 因 ， 荧 光 发 射 光 谱 与 吸 收 光 谱 之 间 显 现 镜 像 对 称关 系 。 2021-5-15200 250 300 350

16、 400 450 500 荧 光 激 发 光 谱 荧 光 发 射 光 谱nm蒽 的 激 发 光 谱 和 荧 光 光 谱 2021-5-15 三 、 荧 光 的 产 生 与 分 子 结 构 的 关 系三 、 荧 光 的 产 生 与 分 子 结 构 的 关 系三 、 荧 光 的 产 生 与 分 子 结 构 的 关 系 1.分 子 产 生 荧 光 必 须 具 备 的 条 件 发 射 的 光 量 子 数吸 收 的 光 量 子 数（ 1） 具 有 合 适 的 结 构 ： 通 常 是 含 有 苯 环 和 稠 环 的 刚 性 结 构 的 有 机 分 子 ；（ 2） 具 有 一 定 的 荧 光 量 子 产 率

17、 。荧 光 量 子 产 率 （ ） ： 衡 量 荧 光 物 质 发 光 能 力 。 它 表 示 激 发 分 子 发 射 出 荧 光 (或磷 光 ) 的 比 例 f 发 射 荧 光 的 分 子 数激 发 的 总 分 子 数或 2021-5-15 荧 光 量 子 产 率 与 激 发 态 能 量 释 放 各 过 程 的 速 率 常 数 有 关， 可 用 各 过 程 的 速 率 常 数 来 表 示 荧 光 量 子 产 率 ：ff iiKK K 荧 光 发 射 过 程 的 速 率 常数 ， 取 决 于 分 子 结 构 。 各 种 无 辐 射 跃 迁 过 程 的 速率 常 数 之 和 。 取 决 于 分

18、子所 处 的 化 学 环 境 ， 同 时 也与 化 学 结 构 有 关 。 i IC ISC Qi K K K K 磷 光 的 量 子 产 率 p与 荧 光 量 子 产 率 p相 似 。 2021-5-15 2.化 合 物 的 结 构 与 荧 光化 合 物 的 结 构 与 荧 光化 合 物 的 结 构 与 荧 光（ 1） 跃 迁 类 型 ： 大 多 数 能 发 荧 光 的 化 合 物 都 是 由 *或 n*跃 迁 激 发， 然 后 经 过 振 动 弛 豫 等 无 辐 射 跃 迁 ， 再 发 生 跃 迁 而 产 生 荧 光。 其 中 * 跃 迁 的 类 型 是 产 生 荧 光 的 最 主 要 跃

19、 迁 类 型 。（ 2） 共 轭 效 应 ： 发 生 荧 光 (或 磷 光 )的 物 质 ， 其 分 子 都 含 有 共 轭 双 键 (键 )的 结 构 体 系 。 共 轭 体 系 越 大 ， 电 子 的 离 域 性 越 大 ， 越容 易 被 激 发 ， 荧 光 也 就 越 容 易 发 生 ， 且 荧 光 光 谱 向 长 波 移动 。 大 部 分 荧 光 物 质 都 具 有 芳 环 或 杂 环 ， 芳 环 越 大 ， 其 荧光 (或 磷 光 )峰 越 向 长 波 移 动 ， 且 荧 光 强 度 往 往 也 较 强 。 2021-5-15 几 种 线 状 多 环 芳 烃 的 荧 光化 合 物 量

20、 子 产 率 F ex（ nm） em（ nm） 苯萘蒽丁 省戊 省 0.110.290.460.600.52 205286365390580 278321400480640 2021-5-15 （ 3） 刚 性 平 面 结 构 ： 刚 性 平 面 结 构 可 降 低 分 子 振 动 ， 减 少 与 溶 剂 的 相 互 作用 ， 减 少 能 量 的 外 部 损 失 ， 故 具 有 很 强 的 荧 光 。 如 荧 光 素和 酚 酞 有 相 似 结 构 ， 荧 光 素 有 很 强 的 荧 光 ， 酚 酞 却 没 有 。 2021-5-15 （ 4） 取 代 基 效 应 （ 实 验 总 结 和 推

21、测 ） ： 取 代 基 的 性 质 (尤 其 是 生 色 基 团 )对 荧 光 体 的 荧 光 特 性 和 强度 均 有 强 烈 的 影 响 。 给 电 子 取 代 基 使 荧 光 加 强供 电 子 基 团 的 有 -NH2， -NHR， -NR2， -OH， -OR， -CN等 。取 代 基 的 影 响 主 要 有 以 下 几 个 方 面 ： 吸 电 子 基 团 使 荧 光 减 弱 而 磷 光 增 强属 于 这 类 基 团 的 为 吸 电 子 基 团 ： 如 羰 基 (-COOH， -CHO)， 硝 基 (NO 2)及 重 氮 基 等 。 2021-5-15 取 代 基 位 置 的 影 响

22、取 代 基 位 置 对 芳 烃 荧 光 的 影 响 通 常 为 ： 邻 位 ， 对 位 取 代者 增 强 荧 光 ， 间 位 取 代 者 通 常 抑 制 荧 光 。 取 代 基 的 空 间 阻 碍对 荧 光 也 有 明 显 的 影 响 。 2021-5-15 重 原 子 效 应 ： 荧 光 体 取 代 上 重 原 子 后 ， 荧 光 减 弱 ， 而 磷 光 往 往 相 应增 强 。 芳 烃 这 种 效 应 称 为 “ 重 原 子 效 应 ” 。 所 谓 重 原 子 取代 ， 一 般 指 的 是 卤 素 (Cl、 Br和 I)原 子 取 代 。 由 于 重 原 子 中 ， 能 级 之 间 的 交

23、 叉 现 象 比 较 严 重 ， 使 得 荧光 体 中 的 电 子 自 旋 -轨 道 耦 合 作 用 加 强 ， 系 间 跨 跃 显 著 增 加， 结 果 导 致 荧 光 强 度 减 弱 ， 磷 光 强 度 增 强 。 2021-5-15 四 、 影 响 荧 光 强 度 的 因 素四 、 影 响 荧 光 强 度 的 因 素四 、 影 响 荧 光 强 度 的 因 素外 部 因 素1.溶 剂 的 影 响 除 一 般 溶 剂 效 应 外 ， 溶 剂 的 极 性 、 氢 键 、 配 位 键 的 形 成都 将 使 化 合 物 的 荧 光 发 生 变 化 ；2. 温 度 的 影 响 荧 光 强 度 对 温

24、 度 变 化 敏 感 ， 温度 增 加 ， 外 转 换 去 活 的 几 率 增 加。 低 温 荧 光 分 析 受 到 重 视 。 荧 光 发 射 的 主 要 电 子 跃 迁 类 型*跃 迁 ， 溶 剂 极 性 增 大 ， 荧 光光 谱 发 生 红 移 ， 而 且 荧 光 增 强 。 不 同 温 度 下 邻 菲 啰 啉 在邻 二 苯 中 的 荧 光 光 谱 2021-5-15 3. 溶 液 pH 对 酸 碱 化 合 物 ， 溶 液 pH的 影 响 较 大 ， 需 要 严 格 控 制 。 2021-5-15 4.内 滤 光 作 用 和 自 吸 现 象内 滤 光 作 用 和 自 吸 现 象内 滤 光

25、 作 用 和 自 吸 现 象自 吸 现 象 ： 化 合 物 的 荧 光 发 射 光 谱 的 短 波 长 端 与 其 吸 收 光 谱的 长 波 长 端 重 叠 ， 产 生 自 吸 收 ； 如 蒽 化 合 物 。内 滤 光 作 用 ： 溶 液 中 含 有 能 吸 收 荧 光 物 质 发 射 的 荧 光 的 组 分， 如 色 胺 酸 中 的 重 铬 酸 钾 ； 2021-5-15 5. 荧 光 猝 灭荧 光 猝 灭荧 光 猝 灭 荧 光 分 子 与 溶 剂 分 子 或 者 其 他 分 子 之 间 存 在 相 互 作 用 ， 使得 荧 光 强 度 降 低 或 消 失 的 现 象 。（ 1） 碰 撞 猝

26、 灭碰 撞 猝 灭 是 荧 光 猝 灭 的 主 要 类 型 之 一 。 *1M Q M Q 热 量激 发 单 重 态的 荧 光 分 子 猝 灭 剂 分 子 2021-5-15 生 成 化 合 物 的 猝 灭 也 称 为 静 态 猝 灭 ， 是 指 基 态 的 荧 光 物质 与 猝 灭 剂 反 应 生 成 非 荧 光 的 化 合 物 ， 导 致 荧 光 的 猝 灭 。（ 2） 生 成 化 合 物 的 猝 灭M Q MQ 基 态 的 荧 光 物 质 猝 灭 剂 （ 3） 氧 的 猝 灭 O2可 以 说 是 荧 光 和 磷 光 的 最 普 遍 存 在 的 猝 灭 剂 。 氧 对溶 液 荧 光 产 生

27、 猝 灭 作 用 的 原 因 比 较 复 杂 ， 还 没 有 一 个 完 整 的确 定 说 法 ， 可 能 包 含 着 多 种 机 理 。 2021-5-15 4. 荧 光 物 质 的 自 吸 猝 灭 当 荧 光 物 质 的 浓 度 较 大 时 ， 会 使 荧 光 强 度 降 低 ， 荧 光 强度 与 浓 度 不 成 线 性 关 系 ， 称 为 荧 光 物 质 的 自 猝 灭 。自 猝 灭 可 能 有 如 下 几 个 原 因 ：(1) 荧 光 物 质 分 子 之 间 的 碰 撞 能 量 损 失 ;(2) 荧 光 物 质 的 自 吸 收 ;(3) 荧 光 物 质 分 子 的 缔 合 。 2021

28、-5-15 第 五 章第 五 章第 五 章 分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法 一 、 仪 器 与 结 构 流 程二 、 荧 光 分 析 法 和 应 用三 、 磷 光 分 析 法 的 应 用第 二 节第 二 节第 二 节 分 子 荧 光 与 磷 光 分 析 法分 子 荧 光 与 磷 光 分 析 法分 子 荧 光 与 磷 光 分 析 法 2021-5-15Cary Eclipse 荧 光 分 光 光 度 计荧 光 、 磷 光 化 学 /生 物 发 光美 国 瓦 里 安 技 术 中 国 有 限 公 司 2021-5-15 光 源 样 品 池激 发单 色

29、器 检 测 器 数 据 处 理仪 器 控 制发 射单 色 器一 、 仪 器 结 构 流 程一 、 仪 器 结 构 流 程一 、 仪 器 结 构 流 程 测 量 荧 光 的 仪 器 主 要 由 四 个 部 分 组 成 ： 激 发 光 源 、 样 品池 、 双 单 色 器 系 统 、 检 测 器 。 特 殊 点 ： 有 两 个 单 色 器 ， 光 源 与 检 测 器 通 常 成 直 角 。 2021-5-15 1.荧 光 光 度 计 仪 器 光 路 图 2021-5-15 光 源 ： 氙 灯 和 高 压 汞 灯 ， 染 料 激 光 器 (可 见 -紫 外 区 )光 源 要 求 ：v发 射 强 度

30、足 够 且 稳 定 的 连 续 光 谱v光 辐 射 强 度 随 波 长 的 变 化 小v有 足 够 长 的 使 用 寿 命高 压 汞 灯 : 是 以 汞 蒸 气 放 电 发 光 的 光 源 ， 一 般 滤 光 片 式 的荧 光 计 多 采 用 它 为 激 发 光 源 。氙 灯 : 是 目 前 荧 光 分 光 分 度 计 中 应 用 最 广 泛 的 一 种 光 源 。 它是 一 种 短 弧 气 体 放 电 灯 ， 具 有 光 强 度 大 ， 在 200 800nm 范围 内 是 连 续 光 源 的 特 点 。染 料 激 光 器 : 是 一 种 新 型 的 荧 光 激 发 光 源 。 2021-5

31、-15 I0 ItIF,p检 测 器 ： 现 在 的 荧 光 计 多 采 用 光 电 倍 增 管 进 行 检 测 。样 品 池 ： 荧 光 分 光 光 度 计的 样 品 池 四 面 透 光 。 单 色 器 ： 荧 光 分 析 仪 中 应 用 最 多 的 单 色 器 为 光 栅 单 色 器 ， 光 栅有 两 块 ， 第 一 块 为 激 发 单 色 器 ， 用 于 选 择 激 发 光 的 波 长 ，第 二 块 为 发 射 单 色 器 ， 用 于 选 择 荧 光 发 射 波 长 。 在 比 较 低档 次 的 荧 光 计 中 ， 采 用 滤 光 片 作 为 单 色 器 。 2021-5-15 2.定

32、量 依 据 与 方 法定 量 依 据 与 方 法定 量 依 据 与 方 法(1)定 量 依 据 荧 光 强 度 If 正 比 于 吸 收 的 光 强 度 Ia 和 荧 光 量 子 效 率 ：f aI I 0 0 1 10 bCa tI I I I 2.3030 01 10 1bC bCfI I I e 由 朗 伯 -比 耳 定 律 得 ：荧 光 强 度 If ： 2021-5-15 对 于 稀 溶 液 ， 当 bC 0.05（ 磷 光 bC 0.01） 时 ： 02.303p pI I bC 02.303f fI I bC If -荧 光 强 度I0 -入 射 光 强 度f -荧 光 量 子

33、产 率b - 吸 收 光 程 - 摩 尔 吸 光 系 数C - 物 质 浓 度 Ip -磷 光 强 度I0 -入 射 光 强 度p -磷 光 量 子 产 率b - 吸 收 光 程 - 摩 尔 吸 光 系 数C 物 质 浓 度 fI KC pI KC 2021-5-15 （ 2） 定 量 方 法） 定 量 方 法） 定 量 方 法标 准 曲 线 法 ：F C sFx Cx FxF CsCx直 接 荧 光 标 准 曲 线 法 荧 光 熄 灭 工 作 曲 线 法比 较 法 ： 在 线 性 范 围 内 ， 测 定 标 样 和 试 样 的 荧 光 强 度 ， 比 较 。 2021-5-15 3.荧 光

34、分 析 法 的 应 用荧 光 分 析 法 的 应 用荧 光 分 析 法 的 应 用(1)无 机 化 合 物无 机 化 合 物 荧 光 分 析 有 直 接 荧 光 法 、 荧 光 猝 灭 法 、 间 接 荧 光法 及 催 化 荧 光 法 等 。 （ a） 直 接 荧 光 法 待 测 元 素 与 有 机 试 剂 所 组 成 的 能 发 荧 光 的 配 合 物 ， 通 过检 测 配 合 物 的 荧 光 强 度 以 测 定 该 元 素 的 含 量 。 （ b） 荧 光 猝 灭 法 某 些 元 素 虽 不 与 有 机 试 剂 组 成 会 发 荧 光 的 配 合 物 ， 但 可以 从 其 他 会 发 荧

35、光 的 配 合 物 中 取 代 金 属 离 子 或 有 机 试 剂 ， 组成 更 稳 定 的 不 发 荧 光 配 合 物 或 难 溶 化 合 物 ， 而 导 致 溶 液 荧 光强 度 的 降 低 ， 由 荧 光 强 度 降 低 的 强 度 来 测 定 该 元 素 的 含 量 。 2021-5-15 (2)有 机 化 合 物 和 生 物 具 有 荧 光 特 性 的 有 机 化 合 物 ， 生 物 、 药 物 化 合 物 可 直接 采 用 逆 光 荧 光 分 析 法 测 量 。目 前 研 究 热 点 ： 激 光 诱 导 荧 光 研 究 溶 液 中 单 分 子 行 为 ； 荧 光 分 子 作 为 探

36、 针 研 究 DNA。 （ c） 间 接 荧 光 法 间 接 荧 光 法 常 用 于 某 些 阴 离 子 如 F-、 CN-等 的 分 析 ， 它 们可 以 从 某 些 不 发 荧 光 的 金 属 有 机 配 合 物 中 夺 取 金 属 离 子 ， 而释 放 出 能 发 荧 光 的 配 位 体 ， 从 而 测 定 这 些 阴 离 子 的 含 量 。 2021-5-15 磷 光 分 光 光 度 计光 学 系 统 与 荧 光 分 光 光 度 计 的 区 别样 品 池 与 荧 光 分 光 光 度 计 的 区 别盛 液 氮 的 石 英 杜 瓦 瓶 。光 源 样 品 池激 发单 色 器 检 测 器 数

37、据 处 理仪 器 控 制发 射单 色 器斩 波 器 （ 磷 光 镜 ）利 用 荧 光 和 磷 光 发 射 寿 命 的 差 别 磷 光 发 射 ， 因 其 平 均 寿 命 较 长 ， 碰 撞 去 激 发 的 效 应 更 大， 所 以 常 采 用 低 温 磷 光 或 固 体 磷 光 方 法 。 2021-5-15 二 、 磷 光 分 析 法 的 应 用二 、 磷 光 分 析 法 的 应 用二 、 磷 光 分 析 法 的 应 用1.稠 环 芳 烃 分 析 采 取 固 体 表 面 室 温 磷 光 分 析 法 快 速 灵 敏 测 定 稠 环 芳 烃 和杂 环 化 合 物 （ 致 癌 物 质 ） ； 见

38、表2.农 药 、 生 物 碱 、 植 物 生 长 激 素 的 分 析 烟 碱 、 降 烟 碱 、 新 烟 碱 ， 2， 4-D等 分 析 检 测 限 0.01 g/cm-3 3.药 物 分 析 和 临 床 分 析 见 表 2021-5-15 2021-5-15 2021-5-15 第 五 章第 五 章第 五 章 分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法分 子 发 光 分 析 法 一 、 基 本 原 理二 、 化 学 发 光 分 析 的 特 点三 装 置 与 技 术第 三 节第 三 节第 三 节 化 学 发 光 分 析 法化 学 发 光 分 析 法化 学 发 光 分 析 法 2021

39、-5-15 一 、 化 学 反 应 发 光一 、 化 学 反 应 发 光一 、 化 学 反 应 发 光 基 本 原 理基 本 原 理基 本 原 理 某 些 物 质 在 进 行 化 学 反 应 时 ， 由 于 吸 收 了 反 应 热 ， 而 使反 应 产 物 分 子 激 发 到 激 发 态 ， 受 激 分 子 由 激 发 态 去 激 化 跃 迁回 基 态 时 以 辐 射 形 式 发 射 出 一 定 波 长 的 光 。 这 种 吸 收 化 学 能使 分 子 激 发 并 发 光 的 过 程 ， 称 为 化 学 发 光 。 利 用 化 学 发 光 建立 起 来 的 分 析 方 法 称 为 化 学 发

40、光 分 析 法 。 化 学 发 光 也 发 生 在某 些 生 物 体 系 内 ， 称 为 生 物 发 光 。 2021-5-15 一 、 化 学 反 应 发 光一 、 化 学 反 应 发 光一 、 化 学 反 应 发 光 基 本 原 理基 本 原 理基 本 原 理1. 化 学 发 光 反 应 的 类 型 (1)直 接 化 学 发 光 A + B C + D* D* D + h (2)间 接 化 学 发 光 A + B C + D* D* + F F* F* F + h 2021-5-15 化 学 发 光 反 应 包 含 有 化 学 激 发 和 发 光 两 个 关 键 过 程 ，它 必 须 满

41、足 下 列 条 件 ： (1) 激 发 能 的 主 要 来 源 是 反 应 焓 ， 化 学 发 光 反 应 多 为 氧化 还 原 反 应 ， 激 发 能 与 反 应 焓 相 当 E=170 300 kJ/mol； 位于 可 见 光 区 ； (2) 化 学 反 应 历 程 使 反 应 产 生 的 化 学 能 用 于 不 断 地 产 生激 发 态 分 子 ； (3) 激 发 态 分 子 跃 迁 回 到 基 态 时 ， 以 光 辐 射 为 主 ， 具 有很 高 的 量 子 产 率 。 2021-5-15 2.化 学 发 光 效 率化 学 效 率 ： 发 光 效 率 ： 又 称 为 化 学 发 光 的

42、 总 量 子 产 率 。 它 决 定 于 生 成 激 发 态 产物 分 子 的 化 学 激 发 效 率 和 激 发 态 分 子 的 发 射 效 率 。定 义 为 : cl ce em 2021-5-15 3.化 学 发 光 强 度 与 化 学 发 光 分 析 的 依 据 化 学 反 应 的 发 光 效 率 、 光 辐 射 的 能 量 大 小 以 及 光 谱 范 围 ，完 全 由 参 加 反 应 物 质 的 化 学 反 应 所 决 定 。 每 一 个 化 学 发 光 反 应都 有 其 特 征 的 化 学 发 光 光 谱 及 不 同 的 化 学 发 光 效 率 。 化 学 发 光 强 度 ICl即

43、 单 位 时 间 内 发 射 的 光 子 数 ， 可 以 下 式表 示 : cl cl dcI t dt式 中 表 示 t 时 刻 的 化 学 发 光 强 度 ， 是 与 分 析 物 有 关的 化 学 发 光 效 率 ， dc/dt 是 分 析 物 参 加 反 应 的 速 率 。 化 学 发 光 强 度 clI t cl 2021-5-15 3.化 学 发 光 强 度 与 化 学 发 光 分 析 的 依 据 在 一 定 条 件 下 ， 峰 值 光 强 度 与 被 测 物 浓 度 成 线 性 ， 通 常采 用 峰 值 光 强 度 进 行 定 量 。在 一 定 条 件 下 ， 曲 线 下 面 积

44、为 发 光 总 强 度 (A)， 其 与 被 测 物 浓度 成 线 性 ： 2021-5-15 4.化 学 发 光 反 应 的 类 型（ 1） 气 相 化 学 发 光 反 应a. 一 氧 化 氮 与 O3的 发 光 反 应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发 射 的 光 谱 范 围 ： 600 875nm， 灵 敏 度 1ng/cm-3；b.氧 原 子 与 SO2、 NO、 CO的 发 光 反 应 O 3 O2 + O （ 1000 C石 英 管 中 进 行 ） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最 大 发 射 波 长 ： 200nm

45、； 灵 敏 度 1ng/cm-3； 2021-5-15 （ 2） 火 焰 中 的 化 学 发 光 反 应 在 富 氢 火 焰 中 ， 也 存 在 着 很 强 的 化 学 发 光 反 应 ；a. 一 氧 化 氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发 射 光 谱 范 围 ： 660 770nm； 最 大 发 射 波 长 ： 690nm； 在 富 氢 火 焰 中 ： NO 2 + 2H NO + H2O 该 反 应 十 分 迅 速 ； 2021-5-15 b.硫 化 物 挥 发 性 硫 化 物 SO2 、 H2S 、 CH3SH、 CH3SCH3等 在 富氢 火 焰 中 燃 烧 ，

46、 产 生 很 强 的 化 学 发 光 （ 蓝 色 ） ： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 发 射 光 谱 范 围 ： 350 460nm； 最 大 发 射 波 长 ： 394nm； 灵 敏 度 ： 0.2 ng/cm -3； 发 射 光 强 度 与 硫 化 物 浓 度 的 平 方 成 正 比 。 2021-5-15 （ 3） 液 相 中 的 化 学 发 光 反 应 机 理 研 究 较 多 ， 在 分 析 中 应 用 最 多 ； 可 测 痕 量 的 H2O2 、Cu、 Mn、 Co、 V、 Fe、 Cr、 Ce、 Hg、 Th等 。 应 用

47、最 多 的 发 光 试 剂 ： 鲁 米 诺 （ 3-氨 基 苯 二 甲 酰 肼 ） ； 化 学 发 光 反 应 效 率 ： 0.15 0. 05； 鲁 米 诺 在 碱 性 溶 液 中 与 双 氧 水 的 反 应 过 程 ： 该 发 光 反 应 速 度 慢 ， 某 些 金 属 离 子 可 催 化 反 应 ； 利 用 这一 现 象 可 测 定 这 些 金 属 离 子 。 2021-5-15 5. 化 学 与 生 物 发 光 分 析 的 应 用（ 1） 该 发 光 反 应 速 度 慢 ， 某 些 金 属 离 子 可 催 化 反 应 ； 利 用这 一 现 象 可 间 接 测 定 这 些 金 属 离 子

48、 。 可 测 痕 量 的 Cu2+ 、 Mn2+、 Co2+、 V4+、 Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、 Ag+、 Au3+、 Hg2+等（ 2） 可 检 测 低 至 10-9 mol/L 的 H2O2；（ 3） 间 接 测 定 某 些 生 物 试 样 氨 基 酸 + O2 酮 酸 +NH3 + H2O2 氨 基 酸 氧 化 酶 葡 萄 糖 + O 2 + H2O 葡 萄 糖 酸 + H2O2 通 过 测 定 生 成 的 H2O2 ， 确 定 氨 基 酸 、 葡 萄 糖 含 量 。葡 萄 糖 氧 化 酶 2021-5-15 草 酸 二 酯 (能 量 提 供 体 )+高 浓 度 双 氧 水

49、+稠 环 芳 烃 (能 量 接受 体 )+金 属 离 子 +溶 剂 组 成 的 反 应 体 系 ， 可 发 出 很 强 的 可 见 光， 发 光 效 率 高 ， 使 用 不 同 的 稠 环 芳 烃 ， 发 射 出 不 同 颜 色 的 光 (冷 光 源 )。 2021-5-15 生 物 发 光 分 析 应 用 在 pH 7 8； 荧 光 素 酶 (E)和 Mg2+的 存 在 下 ， 荧 光 素(LH2)与 磷 酸 三 腺 甙 (ATP)的 反 应 ， 生 成 磷 酸 腺 甙 (AMP)荧 光素 和 荧 光 素 酸 的 复 合 物 和 镁 的 焦 磷 酸 盐 (ppi)：ATP + LH2 + E

50、 + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+pH7 - 8复 合 物 与 氧 反 应 ， 产 生 化 学 发 光 ： AMP LH 2 E + O2 氧 化 荧 光 素 * + AMP+CO2 + H2O氧 化 荧 光 素 * 氧 化 荧 光 素 + h最 大 发 射 波 长 562nm； 2021-5-15 二 、二 、二 、 特 点特 点特 点1. 灵 敏 度 极 高 荧 光 素 酶 和 磷 酸 三 腺 甙 (ATP)的 化 学 发 光 分 析 ， 可 测 定210-17mol/L的 ATP， 即 可 检 测 出 一 个 细 菌 中 的 ATP含 量 ;2. 仪 器 设

51、备 简 单 不 需 要 光 源 、 单 色 器 和 背 景 校 正 ；3. 发 射 光 强 度 测 量 无 干 扰 无 背 景 光 、 散 射 光 等 干 扰 ；4. 线 性 范 围 宽5. 分 析 速 度 快缺 点 ： 可 供 发 光 用 的 试 剂 少 ； 发 光 反 应 效 率 低 （ 大 大 低 于 生物 体 中 的 发 光 ） ； 机 理 研 究 少 。 2021-5-15 2021-5-15 三 、三 、三 、 装 置 与 技 术装 置 与 技 术装 置 与 技 术 装 置 流 程 ：发 光 反 应 室 光 检 测 器 信 号 放 大 器 显 示 与 记 录 发 光 反 应 可 采

52、 用 静 态 或 流 动 注 射 的 方 式 进 行 ： 静 态 方 式 ： 用 注 射 器 分 别 将 试 剂 加 入 到 反 应 器 中 混 合 ， 测 最 大 光 强 度 或 总 发 光 量 ； 试 样 量 小 ， 重 复 性 差 ； 流 动 注 射 方 式 ： 用 蠕 动 泵 分 别 将 试 剂 连 续 送 入 混 合 器 ，定 时 通 过 测 量 室 ， 连 续 发 光 ， 测 定 光 强 度 ； 试 样 量 大 。 2021-5-15 四 、 化 学 发 光 分 析 的 应 用四 、 化 学 发 光 分 析 的 应 用四 、 化 学 发 光 分 析 的 应 用 化 学 发 光 分

53、析 最 大 的 特 点 是 灵 敏 度 高 ， 对 气 体 和 痕 量 金属 离 子 的 检 出 限 都 可 达 ngmL-1级 。 在 环 境 检 测 中 化 学 发 光法 比 吸 收 光 谱 法 和 微 库 仑 法 具 有 更 高 的 灵 敏 度 ， 又 能 进 行快 速 连 续 分 析 ， 因 此 气 相 化 学 发 光 反 应 已 广 泛 用 于 空 气 中有 害 物 质 如 O3、 氮 氧 化 物 、 CO、 SO2、 H2S等 的 监 测 。 其 测定 灵 敏 度 可 达 1 3ngmL-1。 液 相 化 学 发 光 反 应 ， 如 鲁 米 诺 、 光 泽 精 、 没 食 子 酸 等 发光 体 系 可 测 定 天 然 水 和 废 水 中 的 金 属 离 子 。 在 医 学 、 生 物学 、 生 物 化 学 和 免 疫 学 研 究 中 ， 化 学 发 光 分 析 也 是 一 种 重要 的 手 段 。