配基结合或免疫学检测方法学验证指导原则

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1、配基结合或免疫学检测方法学验证指导原则-LC配基结合或免疫学检测方法学验证指导原则姓名:李晨 日期:2011-10-21 摘要:方法学验证主要包括全面验证、部分验证 和交叉验证。本文主要介绍了欧洲共同体药物评审委员会(European Medicine Agency， EMEA)生物分析方法验证指导原则(Guideline on Bioanalyticalmethod Validation, 2011)中关于配基结合或免疫学检测大分子物质(如蛋白 质和肽)所使用的方法学全面验证的内容。全面验证的操作要求和标准，包括参考 标准物、特异性、选择性、残留效应、基质选择、最小稀释倍数、标准曲线、精密

2、度、准确度、稀释线性、平行性试验、稳定性检验、试剂要求、商业试剂盒注意事 项、样品检测、已测样品再分析和报告等。此外，将美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)生物分析方法验证指导原则(Guidance for Indus try Bioanaly tical Me thod Valida tion，2001)关于配基结合或免疫学检测 方法学验证方面的内容与上述EMEA的内容进行简要比较。关键词:配基结合或免 疫学检测，方法学验证，指导原则.、八、-前言方法学验证，又称方法学评价、方法学确认等，是整个药动学、生物利用度及 生物等效性研究的基础。这

3、是药动学研究有别于其他药理毒理研究的特殊之处。所 有药动学研究结果都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结 果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究并建立检测方法学， 以及得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品 进行测定，以确保检测方法的可靠性。目前常用的分析方法有色谱法、配基结合试验或免疫性法和微生物法，其中配 基结合试验或免疫检测主要用于大分子的检测，包括放射免疫分析法、酶免疫分析 法、荧光免疫分析法等。由于大分子的固有特性和复杂结构，造成分析物提取困 难，检测之前往往没有对分析物进行预先抽提。此外，这些检测并不直接测量大

4、分 子分析物本身，而是间接测定分析物与使用试剂的结合反应。配基结合或免疫学方 法学验证需要考虑到这些内容。本文首先介绍了欧洲共同体药物评审委员会 (European Medicine Agency, EMEA)的生物分析方法验证指导原则(Guideline on Bioanalytical Method Validation, 2011)中关于配基结合或免疫学检测大分子物 质(如蛋白质和肽)所使用的方法学全面验证的内容。然后将美国食品和药物管理局 (Food and DrugAdministration, FDA)的生物分析方法验证指导原则(Guidance forIndus try Bioa

5、naly tical Me thod Valida tion, 2001)关于配基结合或免疫学 检测方法学验证方面的内容与上述EMEA的内容进行简要比较。1、分类及其应用 范围方法学验证分为全面验证(Full validation)、部分验证(Partialvalidation) 和交叉验证(Cross validation)。1.1 全面验证对于一个本质上的新药的分析方法, 以及对首次建立的分析方法需要进行全面 的分析方法的验证, 对代谢物进行定量分析的时候也要考虑到进行全面的分析方法的验证。1.2 部分验证 已经经过验证的分析方法变更时可考虑做部分分析方法的验证, 部分验证的内容可以根据分

6、析方法变更的程度从只进行日内精密度和准确度的考察到接近全面的 分析方法的考察,实际操作中要结合实际情况,以达到客观、严谨的科研目的,确 定部分方法学验证的内容。部分方法学验证经常见于如检测方法的改变;血浆样品 采集中抗凝剂的改变;同一种属的生物基质变化（例如人的血浆改变为人的尿液） ; 同一基质的不同种属变化（ 例如大鼠血浆到犬血浆）;相关线性浓度范围的变化;分 析仪器或分析软件工作站的改变;样品采样量的限制而造成的分析方法过程中的变 动（ 例如儿科中的药动学研究）等情况的分析方法。1.3 交叉验证 数据从相同或不同研究中的不同方法中获得，或数据从不同实验室的相同研究 方法中获得，需要对这些数

7、据进行比较，并进行交叉验证。交叉验证中，相同的QC和样品需要用不同方法进行检测。从不同方法获得的QC样品准确度相差？15%内，经过校正可能更大。至少67%的研究样品（study sample）的准确度相差?20%以内。交叉试验的结果决定了所得到的数据是否可靠， 且是否具有可比性和可用性。2、全面验证内容2.1 参考标准物（Reference St andards）大分子是异构的，其效力和免疫反应可能会有所不同。参考物质必须特征清楚 和记录明确（例如分析和来源的考证）。应选择当时最纯的参考标准物。用于校准标 准和QC样品准备的参考标准与非临床和临床研究使用的参考标准物为同一批。在 批次变化的情况

8、下，首先要进行特征分析和生物分析评价，以确保该批次变化对试 验的操作没有影响。2.2 特异性（Specificity） 结合试剂的特异性即试剂专一结合分析物的能力。理想上的结合试剂是特异性的，与结构相关化合物（S true turally Rela tedCompounds)(内源性化合物、异构体、分析物的变体形式、或物理化学性质类 似化合物)或者同时服用的其他药物没有交叉反应。而在方法开发和验证过程中， 却经常不提供这些“相关的分子”(Rela ted Molecules)。初始验证结束后，即表征分析物特点的的数据全部可用后，才进行结合试剂的 特异性评估。评估方式:空白样品基质(从动物或者从

9、没有接触过分析物的人中获得 的基质)和分析物配制质控QC,并向QC中加入浓度逐渐上升的“相关分子”或者 其他同时服用的药物，检测LLOQ和ULOQ中分析物浓度，准确度偏差应在?25%以 内。2.3 选择性(Selectivity)在基质中存在不相关化合物(Unrelated Compounds)的情况下，配基结合试验 检测分析物的能力。由于大分子固有的特异性，样品一般是没有经过分离提取的。基质中这些不相关的分子可能会影响分析物的配基 结合检测。选择性检测方式:检测至少10个来源的样品基质配制的LLOQ或接近LLOQ浓度 的样品。样品基质必须包括脂血和haemolysed样品，建议还包括相关病人

10、来源的 基质。选择性可在最容易出现问题的低端进行评估。用高浓度分析物评估选择性系 谨慎之举，但当干扰物有浓度依赖性时，更关键的是确定干扰物质干扰的最低浓 度，并相应地校正LLOQ的浓度。准确度偏差LLOQ在?25%以内，其他应在?20%以 内，至少80%被检测基质满足上述要求。2.4 残留效应(Carry-over Effect)在方法评价中，如果使用了仪器自动进样操作系统，在线性的最高浓度ULOQ 被测试之后, 必须测试试剂空白样品来评价残留效应( Carry-over Evaluation)。 其可允许接受的范围为空白样品的信号不大于LLOQ的20%，且不大于内标的5%。2.5 基质的选择

11、(Matrix Selection)由于复杂基质中高浓度的内源性结构相关化合物的过强干扰，导致有些未经过 分离提纯的复杂基质中的大分子分析物无法准确检测。尽管不建议使用提取基质 （如用木炭或免疫吸附）或者其他替代基质（蛋白缓冲液或透析血清），但是在没有更 好的方法定量分析物时，可以采取这些基质。标准曲线需要用这些基质进行配制， QC样品应该用实际的样品基质进行配制，检测准确度以证明不存在基质效应。2.6 最小稀释倍数（Minimum Required Dilution）因为基质可能会出现一个高背景信号，因此有必要确定所需的最低稀释。所需 的最小稀释是指利用缓冲液稀释样品优化准确度和精密度所需要

12、的最低稀释倍数， 即能消除基质效应的样品最小稀释倍数。检测时使用的基质与确定最小稀释倍数时 使用的基质相同。2.7标准曲线（Calibration Curve）标准曲线的响应是间接测定的，一般为非线性，呈现S型。至少有6个非零浓 度点构建标准曲线，每个样品至少2个重复。浓度间隔大约均匀分布在对数刻度的 预期范围之内。除了校准标准之外，还需要有在定量范围之外的锚点，有助于曲线 的拟合。方法验证过程中，只要有6次独立批次的标准曲线，并用表格形式总结， 确定标准曲线回归模型的整体稳固性。由于制备过程中的技术性错误（如移液错 误），某个标准点可能从曲线上被排除。标准曲线上各浓度点的反算浓度的准确度偏差

13、在?20%以内，LLOQ和ULOQ准确 度偏差在?25%以内，至少75%浓度点满足该条件。锚定校准不需要符合上述验证标 准，因为超过了曲线的定量范围。2.8精密度和准确度（Precision and Accuracy）用于评估精密度和准确度的QC样品应新鲜配制，但需要经过冷冻处理，以保 持和分析的样品保持统一。至少有5个QC样品浓度点（LLOQ、3倍以内LLOQ、中浓 度、高浓度和ULOQ）,以评估准确度、精密度和总体误差。验证必须模仿样本分析 的操作，如果样品检测时测2次（用2个孔），那么验证时QC也应该测2次（用2个 孔）。在几天内进行至少6次独立测定，以确定批间精密度和准确度。 批内和批

14、间准确度在各浓度点，平均浓度的准确度偏差在标称值的?20%以内，LLOQ和ULOQ在?25%以内。批内和批间的各浓度点的精密度在20%以内，LLOQ和 ULOQ在25%以内。另外，每个浓度点的总体误差，即相对误差，(RE%)和变异系数 %(CV%)的绝对值的总和不超过30%(,RE,%+CV%)30%)，LLOQ和ULOQ不超过40%。2.9 稀释线性(Dilutional Linarity) 由于校准标准曲线的范围狭窄，当样品分析物的浓度超过了定量范围(超过ULOQ)，用空白基质对其进行稀释使其浓度在定量范围之内，以至于可以准确测定 样品中分析物的浓度。这种稀释需要利用QC进行验证。另外一个

15、原因是避免Hook 效应，即高浓度分析物造成的信号抑制。不同稀释度的反算浓度乘以稀释度以后， 偏差在标称值的?20%以内，所有稀释的最后反算浓度之间的精密度20%以内。2.10 平行性试验(Parallelism) 如果研究样本允许，校正标准曲线和供试样品的系列稀释可以做平行测试，以 评估可能存在的基质效应或代谢物的亲和差异性。高浓度样本(接近Cmax)用空白 基质至少稀释3个浓度梯度。稀释系列的样品间CV%不高于30%。2.11 稳定性检测(St ab ility of the Samples) 稳定性的评价应保证在样品的制备、分析以及保存过程中，对分析物的浓度没 有影响，主要包括基质、抗凝

16、血剂、容器材料、储存和分析条件等。基质稳定性:应采用低QC和高QC样品在制备好之后立即分析进行评价，根据 新制备的标准曲线计算，得到的平均浓度结果偏差不超过20%。冻融稳定性:QC样品在期望的冷冻温度下保存，然后再室温下或操作温度下融 解，完全融解后，再在相同条件下冷冻。每一个过程中，冷冻至少12个小时。冻 融次数应不低于实际测量是对样品的冻融次数。长期稳定性（基质中冷冻）：QC样品应在与研究中样品相同的冷冻条件下，放置更长的时间进行评价。对于大分子物质（肽或蛋白质等），需在每一个温度点进行分 析确定稳定性。储存液和工作液稳定性：不必测定每个浓度的稳定性，确定一个较高和较低的 样品的稳定性后，

17、即可认为之间浓度的样品稳定。准确度偏差应在?20%以内。2.12 试剂（Reagents）关键性试剂包括结合试剂（如结合蛋白，适体，抗体或标记的抗体）和那些含有 酶基团，对检测结果有直接影响，因此必须保证其质量。因此，在验证或样品分析 过程中试剂批次改变时，必须先核实，以确保该批次与原批次或前一批次得到的结 果一致。因为试验条件保证了非关键试剂（如缓冲区，稀释剂或酸化试剂）的稳定性和关 键试剂的稳定性，因此试验条件需要有记录，以确保操作方法不会随着时间而受影 响。2.13 商业试剂盒（Commercial Kits） 商业试剂盒已经不局限于药代动力学的研究了。因此，商业试剂盒需要重新验证，以确

18、保LLOQ和QC在实际浓度范围内用于样品分析的准确性和精确性。上面列 出的验证原则适用。3、样品检测（Analysis of St udy Samples） 3.1 分析运行（Analy tical Run）配基结合试验用的最多的是微孔板。每个分析批次可能包括几块板，但是每个 板中必须包括独立的标准曲线和质控样品，用来权衡板与板之间的差异性。在有些 板上可承载的样品数量是有限的。可以将同一套标准曲线分别放在第一块和最后一 块板上，QC样品每个板上都有。建议每个研究样品有重复，即一个样品用2个以上的复孔。3.2 分析的接受标准(Acceptance Criteria for Study Samp

19、leAnalysis)一个目标的所有样品在一次分析中完成。标准曲线各浓度点准确度偏差在?20% 以内，LLOQ和ULOQ准确度偏差在?25%以内，至少75%浓度点满足上述要求。一次 测定中至少包括3个质控样品浓度点(低、中、高)双样本，准确度偏差在?20%以 内，至少67%的质控样品满足该条件，同一浓度点至少50%满足条件。质控QC检测 孔数目模仿研究样品的数目。3.3 样品复测(Reanalysisi of Study Sample)可能需要复测样品的原因可能有:某批次检测的标准曲线或者质控QC样品的准 确度不能满足可接受的标准;检测得到的样品浓度高于ULOQ或低于LLOQ;仪器故障 等。对

20、于生物等效性研究，通常是由于药代动力学的原因重复分析样 本是不能接受的，因为这可能会影响研究结果和使结果发生偏见。在这种情况 下，复测可能会被当作实验室调查的一部分，用于调查异常结果发生的原因，并防 止今后类似问题再次发生。复测样品、原始数据、复测的原因、复测的数据、最后 采用的数据和采用的原因都必须详细注明。4、已测样品抽测(Incurred Sample Reanalysis)在方法验证过程中使用的校准标准物和QC样品可能无法模仿实际的研究样 品。蛋白结合物质的差异、已知和未知代谢物的反算、样品的不均匀性或同时使用 的药物都可能会影响处理和储存过程这些样品中分析物的准确性和精确度。因此，

21、建议在不同天独立再分析已测样品的准确度，以说明检测的可重复性。若样品数少于1000，则10%样品需再测定，若样品数多于1000，则5%样品再 测定。建议重复测定的样品中需要有C附近和消除期max的样品。原测值和新测值与两者平均值的偏差在?30%以内，至少67%符合上述要求。如果已测样品再分析发 生巨大偏离，应该进行调查。出现以下情况之一，需要进行已测定后再分析:每个物种只进行一次毒代动力 学;所有重要的生物等效性试验，第一次在受试者上进行的临床试验;第一次在患者 上的试验;第一次在肝脏或肾脏受损患者身上的试验。动物研究中，已测样本再分析只需在早期研究工作中做，如果这些试验在剂量 和浓度等关键试

22、验中具有代表性。样品不能来源太集中，否则可能会检不出异常情况。5、FDA(2001)方法学验证及其与EMEA(2011)的比较FDA是食品和药物管理局(Food and Drug Administration)的简称，在中国， 因为其标准比较高，因此多以美国FDA为最高准则。另外，EMEA研究制定一系列 药事法规通过欧盟国家的实施，形成欧洲很重要的法律章程，而欧盟各国又根据 EMEA的法规制定本国相应的药事法。以下对EMEA和FDA在配基结合或免疫学检测方法学验证的内容、方法和接受 标准进行了比较，见表1。表1 EMEA与FDA在方法学验证上的比较EMEA FDA选择性 在基质中存在不相关化合

23、物分析物非相关物质的基质效应:(unrelated compounds)的情况下，(1)分别用生物源溶液和缓冲液 配基结合试验检测分析物的能力。 配制标准曲线检测基质效应。 检测至少10个来源的样品基质配制(2)平行稀释样品和标准品检测 的LLOQ或接近LLOQ浓度的样品。基质效应。准确度偏差LLOQ在?25%以内，其(3)确定非特异性结合。他应在?20%以内，至少80%被检测生化性质相似物质的干扰:基质满足上述要求。 (1)代谢产物、同时服用的药物，特异性 结构相关化合 物或者同时服用的其或内源性化合物的交叉反应的需他药物没有交叉反应。 要结合分析物单独评价。用空白基质和分析物配制质控QC,

24、 (2)如果可能的话可以有评价标并向QC中加入浓度递增的“相关分准。子”或者其他同时服用的药物，检测(3)利用研究样品评价参考标准LLOQ和ULOQ中分析物浓度，准物的稀释线性。确度偏差?25%以内。-残留空白样品的信号不大于样品LLOQ效应 的20%，并不大于内标的5%最小稀能消除基质效应的样品最小稀释倍见选择性。未说明操作内容和具释倍 数 数 体标准。标准 至少6个非零浓度点。锚点。 至少6个非零浓度点。4阶或5曲线 6次 独立批次。准确度?20%, LLOQ阶模型。锚点。包括LLOQ在内和ULOQ?25%。至少75%浓度点满至少6-8个非零样品。LLOQ偏足要求。 差?20%，其他?15

25、%，至少67%浓度点满足要求。精密度QC冷冻处理;至少5个QC浓度点;3个QC样品浓度 点，每浓度5准确度 每浓度5重复。几天内至少6次独重复。至少67%样品满足 准确度立批次;平均浓度的准确度?20%，偏差在?15%以内，同一浓度至少LLOQ和ULOQ?25%。批内和批间一个样品满足条件。在建立方法的精密度?20%, LLOQ和ULOQ试验中采用在数天至少进行6次在?25%。各浓度点的独立批次验证，每一批4个QC(RE%+CV%)30%, LLOQ 和浓度：LLOQ，低 QC、中 QC 和ULOQ不超过40%。高QC。 稀释不同稀释度的反算浓度乘以稀释度见“选择性”。未说明操作内容和线 性以

26、后，偏差在标称值的?20%以内，具体标准。所有稀释的最后反算浓度直接的精 密度?20%以内。平行 高浓度样本（接近Cmax）用空白基见“选择性”。未说明操作内容和试验 质至少稀释3个浓度梯度。稀释系具体标准。列的样品间CV%不高于30%。稳定性 低QC（3*LLOQ）和高QC（接近至少3个等体积（每个体积适合ULOQ）准确度偏差?20%。3次试验）的低浓度和高浓度。冻融稳定:冷冻至少12h。冻融循环冻融稳定:冷冻12-24h，冻融3 不低于研究样品冻融次数。个循环后分析;短期稳定:在室温或者操作温度下短期稳定:室温下4-24h后分析。 稳定性。长期冷冻稳定:冷冻超过样品储 长期冷冻稳定:每个温

27、度都必须验存时间。证稳定性。存储稳定:样品至少在室温中保 存储液稳定性和工作于稳定性。持6 h后分析。- 回收率考察低、中、高3个浓度的提取 回收率。虽然回收率不能达到100%，但是需要保持一致性、精 确性和可重复性。试剂 关键性试剂（包括结合试剂和含有关键试剂，如抗 体，示踪，参考酶基团），对检测结果有直接影响，标准物，和基质必须性征明确， 因此必须保证其质量。试剂批次改并在规定条件下储存。变时，必须先验证核实。非关键试剂（如缓冲区，稀释剂或酸化试剂）储存条件需要有记录， 以确保操作方法不会随着时间而受 影响。样品 标准曲线各浓度点准确度偏差标准曲线样品至少75%浓度点准检测？20%, LL

28、OQ和ULOQ在?25%，确度偏差？15%以内（包括至少75%浓度点满足要求。ULOQ）, LLOQ为?20%以内。一次测定中至少包括3个QC浓度一次测定中至少包括3个QC浓 点（低、中、高），或者不小于总样度点（低、中、高），或者不小于品数目的5%。准确度偏差?20%，总样品数目的5%。至少67%QC至少67%QC满足该条件，同一浓度满足偏差？15%，不符合点不能是 点至少50%满足条件。 同一浓度的。- 已测样原测值和新测值与两者平均值的偏品抽测 差在?30%以内，至少67%符合上述要求。6、报告（Reports）6.1方法学验证报告（Validation Report） 验证报告至少包括

29、以下内容:方法验证总结，分析方法来源（参考文献），方法操作细节（分析物、内标、样品预处理、提取和分析），标准样 品信息，标准曲线样品和质控样品（基质、抗凝剂、制备、制备日期和储存条件） 可接受范围，分析（测定时间、是否通过和失败原因，标准曲线数据，质控数据， 稳定性数据，选择性数据，LLOQ数据，残留数据，基质效应数据，稀释完整性数 据）。6.2 分析报告（Analytical Report）报告至少包括以下内容:标准样品信息，标准曲线和质控样品储存条件，可接 受范围，操作步骤，样品跟踪，样品分析（每次检测样品、日期和结果表格，每次 检测标曲结果表格，每次检测 QC 样品结果表格，失败的检测，与验证方法的差 别，重复测定）。提交 20%受试者样品测试的色谱图复印件，包括相应分析批的标 准曲线和QC样品的色谱图复印件。