生化分析常见交叉污染探讨与对策.ppt

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1、生 化 分 析 常 见 交 叉 污 染 探 讨 与 对 策徐 国 超 一 如 何 理 解 交 叉 污 染 在 A项 目 测 定 中 所 使 用 的 试剂 、 样 本 、 反 应 产 物 、 清 洗剂 等 对 B项 目 的 测 定 产 生 了不 良 影 响 的 现 象 。A项 目 与 B项 目 不 一 定 是 相邻 项 目 。 测 试 项 目 A试 剂 、 样 本 等 残 留 测 试 项 目 B 引发交叉污染的原因 生化仪的发展变化多项目,多样本处理处理能力的提高(高速化) 设计共用机械部分样本针,试剂针比色杯搅拌棒 生 化 仪 状 态 不 良 ,使 用 不 当 清 洗 力 的 低 下 (日 常

2、 维 护欠 缺 ,仪 器 老 化 ) 生 化 仪 内 污 垢 的 积 聚 测 试 顺 序 安 排 不 当 常 规 清 洗 不 能 有 效 消 除污 染 二 交 叉 污 染 的 分 类 v 样 本 针 携 带 污 染v 试 剂 针 携 带 污 染v 搅 拌 棒 携 带 污 染v 清 洗 系 统 携 带 污 染v 比 色 杯 污 染v 试 剂 交 叉 污 染 三 不 同 类 型 交 叉 污 染 的 鉴 别 方 法 及 原 因 1. 样 本 针 携 带 污 染 ： 目 前 大 多 数 全 自 动 生 化 分 析 仪 采 用 循 环 冲 洗式 样 本 针 吸 取 样 本 ， 当 样 本 针 在 清 洗

3、 不 完 全 ， 或 黏 附 力 增 加 时 ， 样 本残 留 可 能 会 对 下 一 相 邻 样 本 的 检 测 结 果 造 成 影 响 。原 因 ： 样 品 针 尖 弯 曲 ， 特 富 龙 涂 层 剥 落 ， 针 堵 塞 ， 冲 洗 水 冲 洗 不 充 分携 带 污 染 率 主 要 是 体 现 样 品 之 间 的 污 染 程 度 样本针携带污染率试验（一） 同一检测项目浓度相差较大的a标本（高浓度），b标本（低浓度）。 检测顺序：a 1 , a 2 , b 1 ,b 2 , b3 计算： 评价： 以q小于10%为判断标准。局限性：结果与选择的标本浓度有关系 例1：选择高浓度的ALT样本浓度

4、值为2020 U/L，低浓度ALT 样本第一次检测结果40 U/L，第三次检测结果20 U/L。 通过计算携带污染率q = （40 20）/ 2000 * 100% = 1%。 例2：选择高浓度的Cl 样本浓度值为140 mmol/L，低浓度Cl 样本第一次检测结果为86 mmol/L，第三次检测结果为80 mmol/L。 通过计算携带污染率q = （86 80）/ 60 * 100% = 10%。 上例中，例1的携带污染率尽管只有1%，由于结果正好在医学决定水平附近因此对临床判断有较大影响。例2的携带污 染率尽管达到了10%，但是对于临床判断不会产生大的影响。因此，使用该方法评价样本针携带污

5、染需考虑样本的实际浓度。 测试顺序：3L 2H 1L 2H 4L 2H 1L 2H 1L 2H 1L （注上述顺序前的数字代表测试数量，如3L代表连续测试3个低值样本） 定义：L L 值为紧跟在低值标本后低值标本的结果。 H L 值为紧跟在高值标本后低值样本的结果 携带污染指标= H L结果的平均值 L L结果的平均值 判断标准： 当携带污染指标小于 3SD SD是 ( L L ) 结果的SD值。样本针携带污染率试验（二） 试剂针携带污染 全自动生化分析仪一般采用双试剂针，即所有项目的一试剂都共用试剂针R1，所有项目的二试剂都共用试剂针R2。试剂针R1或R2在每吸取一次试剂后都会进行一次清洗，

6、之后会 立即吸取下一个项目的试剂。 当自身清洗能力下降，试剂针在吸取试剂时会将部分残留的前项目试剂成分带入到后项 目反应杯中，对后项目的检测结果造成影响。 从各个项目设置的参数可知，试剂体积量远大于样本体积量。因此试剂针携带污染影响程度会高于样本针携带污染。 携带污染实验方案 目前大部分实验室开展的生化检测项目至少都有20项以上，评价全项目之间的携带污染会非常耗时，试剂成本消耗量大。且不同仪器的动作原理不完全相同，设计一个较为简单，合理的实验方法是需要重点考虑的 内容。 试剂针携带污染实验方案原理：通过设置特定的标本检测顺序，每个样本只做一个项目的检测，可以控制不同项目的先后吸取顺序，实现任何

7、一个 项目都能与其他项目相遇。为了有效评价项目之间携带污染影响程度，污染实验所用病人样本的混合血清应尽量包含医学决定水平浓度 试剂针携带污染实验方法 携带污染初实验 假设本次实验以A, B, C, D, E五个项目来考察各个项目之间的试剂针携带污染, 先在生化仪中输入样本测试号码和选择项目，每个样本号码只选择一个项目，目的是使试剂针吸取项目的顺序 完全按照样本测试号码的先后顺序进行，五个项目的测试 顺序见表1。测试完成后，将数据输入到处理表格2和表格3中，按照一定的判断标准，寻找可能存在的污染项目组合。 表 3中 显 示 了 试 剂 之 间 携 带 污 染 初 实 验后 的 结 果 :a 将

8、表 格 内 测 试 顺 序 号 代 表 的 位 置 处 输入 该 项 目 对 应 的 测 试 结 果 ，b 对 每 个 测 试 顺 序 号 下 面 对 应 的 测 试 结果 和 该 项 目 单 独 5次 重 复 结 果 的 均 值 相比比 值 以 百 分 比 形 式 表 示 ， 通 过 考 察 百分 比 的 大 小 来 初 步 判 断 携 带 污 染 的 可能 性 。目 前 的 判 断 标 准 以 正 负 百 分 之 五 作 为判 断 标 准 ， 超 过 范 围 时 怀 疑 有 携 带 污染 。 试剂针携带污染确认实验由携带污染初实验筛选出怀疑有污染的项目组合， 假设 (AB) 同(DE)即A

9、项目对B项目（A项目做好后紧接着做B项目），D项目对E项目（D项目做好后紧接着做E项目）怀疑有污染。由于初实验的项目交叉结果只是一次测试的结果， 可能有偶然因素，还必须进行确认实验。以(AB)为例，(DE)的情况相同先单独做A项目，紧接着连续测试3次B项目，第一个B项目的结果受A项目影响最大，第三个B项目的结果因为有2次自身冲洗，结果应比较准确。比较第一个B项目检测结果同第三个B项目检测结果，如果影响百分比同初试结果影响趋势和程度相近，可以判断 A项目对B项 目有携带污染。确认实验检测顺序以(AB ）, (DE)为例确认实验步骤（表4）A B1 B2 B3 D E1 E2 E3 搅 拌 棒 污

10、 染 ： 试 剂 与 样 本 、 第 一 试 剂 与 第 二 试 剂 的 混 匀 需 要 搅 拌 棒 ， 而 搅 拌 棒 如 果 清 洗 不 完 全 ， 或 黏 附 力 增加 时 ， 残 留 试 剂 可 能 会 对 下 一 检 测 结 果 造 成 影 响 。 鉴 别 对 同 一 份 血 清 标 本 重 复 测 定 G G T 或 ALT或 AST20次 以 上 ， 结 果 重 复 性 较 差 且 有 走 高 趋 势 。原 因 搅 拌 棒 特 富 龙 涂 层 剥 落 ， 搅 拌 棒 表 面 有 顽 固 性 污 渍 ， 冲 洗 水 冲 洗 不 充 分 , 可 用 无 水 乙 醇 擦 洗 搅 拌 棒

11、 搅 拌 棒 携 带 污 染 4.清 洗 系 统 携 带 污 染 鉴 别 ： 在 样 本 测 定 过 程 中 加 做 室 内 质 控 ， 部 分 项 目测 定 异 常 或 者 失 控 在 样 本 测 定 过 程 中 以 蒸 馏 水 为 样 本 ， 多 次 测定 LDH 、 P、 M 、 TBA， 结 果 重 复 性 不 好 。 原 因 ： 干 燥 棒 携 带 污 染 为 多 5.比 色 杯 污 染 生 化 分 析 仪 的 比 色 杯 大 体 分 为 两 种 ， 一 种 是 循 环 使 用 的 （ 如 石 英 比 色 杯等 ） ， 另 一 种 是 需 要 定 期 更 换 的 （ 如 塑 料 比

12、色 杯 等 ） ， 每 个 比 色 杯 检 测 完 毕后 ， 进 行 清 洗 ， 然 后 继 续 下 一 个 检 测 项 目 的 检 测 。 当 由 于 各 种 原 因 导 致 某 个比 色 杯 清 洗 不 完 全 或 该 比 色 杯 老 化 时 ， 吸 附 在 比 色 杯 上 的 上 一 个 项 目 的 残 留试 剂 可 能 会 对 在 这 个 比 色 杯 中 进 行 的 下 一 个 项 目 的 检 测 结 果 造 成 影 响 。 根 据经 验 ， 比 色 杯 的 污 染 对 结 果 影 响 最 大 ， 因 为 比 色 杯 最 难 以 清 洗 干 净 ， 且 在 实际 工 作 中 难 以 判

13、 断 该 比 色 杯 上 一 测 试 的 项 目 。 鉴 别 ： 在 每 日 早 晨 刚 开 机 时 对 所 有 项 目 做 试 剂 空 白 测 定 ， 试 剂 空 白 吸 光 度 高 （ 终 点 法 ） 或 者 试 剂 空 白 吸 光 度 变 化 率 高 （ 速 率 法 ） TBA（ 循 环 酶 速 率 法 ） 经 常 出 现 负 值 蛋 白 项 目 、 血 脂 项 目 结 果 偏 高 胆 红 素 （ 钒 酸 盐 法 ） 易 出 现 异 常 值 原 因 ： 比 色 杯 划 痕 较 深 较 多 ， 清 洗 系 统 清 洗 不 彻 底 比色杯污染实验方法 以项目A对BCDE 4个项目比色杯污染

14、不 同 类 型 的 交 叉 污 染 的 发 生 几 率 由 高 到 低 排 列 ：试 剂 针 携 带 污 染搅 拌 棒 携 带 污 染比 色 杯 污 染样 本 针 携 带 污 染清 洗 系 统 携 带 污 染 用 排 除 法 鉴 别 不 同 类 型 的 交 叉 污 染 的 排 列 顺 序 （ 在 保 证 试剂 质 量 没 有 任 何 问 题 的 前 提 下 ） ：样 本 针 携 带 污 染 比 色 杯 污 染试 剂 针 携 带 污 染 搅 拌 棒 携 带 污 染 清 洗 系 统 携 带 污 染 试剂交叉污染-类型1. 试剂成分间的直接影响2.试剂成分间的间接影响3.反应进程相同4.影响反应条件

15、 试剂交叉污染 1. 试剂成分间的直接影响 前一个测定试剂中直接含有后一个测试试剂所要测定的项目。例如：通常在AMY的R1试剂中含有Ca离子（酶活化剂）,当某样品作AMY和Ca这两个检测项目时，检测的顺序是先检测AMY，接着检测Ca。因吸取过AMY的R1试剂针上可能沾有残留的R1试剂，所以当R1试剂针再吸取Ca试剂时，会引入AMY的R1试剂中含有的Ca离子，这样对Ca项目的检测结果就可能造成正误差 试剂交叉污染 常见试剂成分间的直接影响 葡萄糖（GLU）（氧化酶法）、总蛋白 （TP）与酸性磷酸酶（ACP）试剂中含有较高浓度的钾（K + ）； 胆碱酯酶（ChE）、总胆固醇（CHOL）、GLU（G

16、OD法）、尿酸（UA）（尿酸酶法）、乳酸脱氢酶（LD）（IFCC法）、羟丁酸脱氢酶 （HBDH）（DGKC法）等试剂中含有磷酸缓冲液； CHOL、TG试剂及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂中含有胆酸钠； 丙氨酸氨基转移酶 （ALT）（IFCC法）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）（IFCC法）试剂中含有高活性的LD； 以上试剂的交叉污染就分别会对、K+（紫外酶法）、磷（P）、总胆汁酸（TBA）及LD的测定结果造成干扰 试剂交叉污染2.试剂成分间的间接影响 试剂成分参与反 应：上一个试剂中含有的某种试剂成分与下一反应所要测定的底物有作用，因而干扰下一反应的测定结果。如：Mg 2+测定试剂的络合

17、剂亦能与铁（Fe）结合，影响铁与铁络合剂的结合；直接胆红素（DBil）（重氮法）试剂含有EDTA，Mg 2+试剂中含有 EDTA，均能与Ca结合，从而影响Ca的测定；以甘油作为酶保护剂的试剂，会对TG的测定带来干扰；钙（MTB法）试剂对K+有 负干扰；CHOL试剂中含有胆固醇酯酶，可水解胆固醇酯形成游离胆固醇，而引起对游离胆固醇测定的干扰。 试剂交叉污染 （3）反应进程相同：上一个试剂所引导的反应对下 一个项目的反应进程带来间接的干扰，下一项目所测定的是前后两个项目反应的综合作用结果。 如：当上一反应产物为H2O2时，则对以Trinder反应产生 颜色的测定结果引起干扰，如UA对CHOL结果的

18、影响，CHOL对肌酐（CREA）（酶法）测定结果的影响，GLU（氧化酶法）对CREA测定结果的影 响；CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）试剂中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶（HK）反应过程，因此可能对GLU的测定 带来干扰，尤其对GLU的HK法测定可能带来严重干扰。 试剂交叉污染 （4）影响反应条件：如上一试剂缓冲液成分改变了下一反应的pH环境，从而改变反应速率，如 TP（双缩脲法）测定需在pH89时，蛋白肽键才都能与碱性铜溶液作用生成紫色反应，若pH8时，则会导致TP结果偏低，还直接影响球蛋白、白蛋白/ 球蛋白的结果； 酶活性测定有最适pH，大多数酶反应pH在6

19、.07.5之间，ALP、-GT、LDH则在碱性条件下最适宜； CREA（苦味酸速率法） 反应条件为碱性，果糖胺（动力学法）反应条件为酸性，受到污染后反应速率会减慢。CREA（酶法）试剂中含有抗坏血酸氧化酶，影响了氧化还原反应的进程， 会对TBA（酶循环法）测定结果有影响。DBil（钒酸盐氧化法）试剂中含有表面活性剂的酒石酸盐缓冲液会影响ALT活性，对测定结果有负干扰。 如何消除试剂间的化学污染 （1）为减少试剂间的化学污 染，应定期对仪器进行适当的保养，如更换管道，用去污剂、酸性洗液清洗比色杯，用去污剂擦清试剂针，用无水乙醇擦洗搅拌棒等。 （2）合理安排检测项目的顺 序：一般在安排项目顺序时要

20、求两个项目间至少要有一个非干扰项目，由于各厂商试剂盒原理不同，内含成分不同，故无固定的测定顺序格式，需要自己摸索。较好 的做法是将被干扰项目置于干扰项目之前，以消除干扰发生的可能。一般检测顺序有以下原则：不受上一试剂的干扰；不影响下一试剂测定；不影响测试速 度；充分运用剩余试剂位开展新项目；利用好仪器的功能。 （3）当合理设置测试顺序无法消除交叉污染时，可使用生化分析仪的试剂针、比色杯清洗程序，对 试剂针、比色杯进行2次或多次清洗。用碱性清洗液及酸性清洗液交叉冲洗试剂针可以有效地避免携带污染。 （4）选用具有抗交叉污染的试剂盒：如在游离胆固醇 试剂中添加胆固醇酯酶抑制剂，以减少胆固醇酯酶水解胆

21、固醇酯而引起对游离胆固醇测定的污染。 （5）部分大型全自动生化分析仪有多个模块或通道，可以将有化 学污染干扰的项目排在不同的模块或通道中检测。 第 一 类 ： 前 一 测 试 项 目 试 剂 中 含 有 紧 跟 其 后 测 试 项 目 所 要 测 定 的 底 物 。 此 时 残 留 的 污 染 物 被 带 入 下 一 测 试 中 ， 与 该 测 试 的 试 剂 反 应 ， 可 能 会 导 致 结 果 异 常 。 引 起 这 类 交 叉污 染 产 生 的 物 质 明 确 ， 并 且 可 以 定 量 分 析 。 主 要 项 目 有 ： 1. ALT(IFCC法 ),AST(IFCC法 )含 高 活

22、 性 的 LDH,会 影 响 其 后 的 LDH结 果 。 2. CK-NAC、 CK-MB-NAC酶 偶 联 测 定 试 剂 含 高 浓 度 Glucose,会 干 扰 其 后 的 血 糖 测 定 ， 尤 其 对 HK法 干 扰严 重 。 3. Glu(GOD法 )、 UA(尿 酸 酶 法 )、 a-HBDH、 TG、 Ca(偶 氮 胂 III法 )、 TC(CHOD- PAP)等 均 采 用 磷 酸 盐 缓冲 液 ,会 干 扰 位 于 其 后 无 机 盐 (P)的 结 果 。 4. ALP(IFCC-AMP法 )， CK-NAC,CK-MB-NAC,TG(GPO法 )试 剂 均 含 高 浓

23、 度 Mg2+会 影 响 紧 随 其 后 的 Mg2+的结 果 。 5. TC、 HDL-C、 HDL-C、 LDL-C采 用 胆 固 醇 氧 化 酶 法 的 试 剂 含 胆 酸 钠 ， 会 干 扰 紧 跟 其 后 的 TBA结 果 ， 致假 性 偏 高 。 6. 以 对 一 硝 基 苯 麦 芽 七 糖 苷 法 (4NP-G4)为 底 物 的 AMY试 剂 含 Ca2+浓 度 高 会 影 响 其 后 测 Ca2+的 准 确 性 。 7. TG， TC试 剂 中 有 LIP， 会 导 致 LIP的 测 试 结 果 不 真 实 。 该 种 类 型 的 交 叉 污 染 单 试 剂 终 点 法 的 受

24、 污 染 项 目 测 试 结 果 的 抬 高 或 降 低 反 映 的 是 搅 拌 杆 的 携 带 污 染 。因 为 试 剂 针 携 带 进 来 的 上 一 个 测 试 的 干 扰 物 会 和 下 一 个 试 剂 发 生 反 应 ， 由 于 携 带 量 小 ， 一 般 在 试 剂空 白 段 （ 2min） 即 反 应 平 衡 。 而 双 试 剂 项 目 的 测 试 结 果 反 映 的 是 试 剂 针 和 搅 拌 杆 的 综 合 污 染 。 第 二 类 ： 前 一 测 试 项 目 试 剂 中 的 某 种 （ 些 ） 成 份 干 扰 紧 随 其 后 测 试 项 目 所 要 测 定 的 底 物 。 引

25、 起 这 类 交 叉 污 染 产 生 的 物 质 明 确 ， 但 和 第 一 类 不 同 的 是 ， 前 一 测 试 残 留 并 带 入 下 一 测 试 的 污 染 物并 非 待 测 物 本 身 ， 而 是 能 与 待 测 物 进 行 其 他 的 反 应 或 显 色 物 质 波 段 重 叠 或 引 起 测 试 条 件 的 变 化 如 PH值 改 变 等 ， 从 而 带 来 对 测 试 过 程 的 干 扰 ， 这 种 干 扰 作 用 不 易 进 行 定 量 分 析 。 主 要 项 目 有 ： 1. TC、 HDL-C、 HDL-C、 LDL-C最 终 反 应 都 是 过 氧 化 氢 和 4-氨

26、基 安 替 比 林 在 过 氧 化 酶 的 作 用 下 产 生 醌亚 胺 显 色 （ 505nm） ， 因 此 这 些 项 目 间 会 相 互 干 扰 。 2. TP的 检 测 原 理 是 蛋 白 质 与 铜 离 子 生 成 紫 蓝 色 复 合 物 ， 该 显 色 物 质 在 546nm有 吸 收 峰 ， 在 波 段500nm600nm都 有 较 大 吸 收 ； 因 此 TP试 剂 可 能 影 响 500nm -600nm波 段 的 终 点 法 显 色 测 定 （ 如 TC， TG，UA等 ） 。 另 外 ， TBIL（ 重 氮 法 ） 和 DBIL（ 重 氮 法 ） 生 成 的 偶 氮 物

27、在 546 nm 下 有 吸 收 峰 ， 因 此 TBIL（ 重 氮 法 ） 或 D-BIL（ 重 氮 法 ） 会 和 TP相 互 干 扰 。 3. ALB（ BCG） 检 测 原 理 是 形 成 的 蓝 绿 色 复 合 物 在 578nm有 强 吸 收 ， 且 在 整 个 500nm-700nm都 有 较 强吸 收 ， 因 此 ALB试 剂 会 干 扰 紧 随 其 后 的 500nm-700nm波 段 的 终 点 法 显 色 测 定 （ 如 UA等 ） 。 4. ALT的 R2（ 含 NADH） 及 CR的 R2试 剂 （ 苦 味 酸 ， 呈 深 黄 色 ） 在 340nm有 很 强 的 吸

28、 收 ， 会 干 扰 紧 随 其后 的 340nm免 疫 比 浊 终 点 法 的 测 定 （ 如 PA， CRP等 ） ， 且 免 疫 比 浊 法 的 终 点 吸 光 度 越 低 干 扰 越 严 重 。 该 种 类 型 的 交 叉 污 染 无 法 分 出 是 试 剂 针 还 是 搅 拌 杆 携 带 进 的 污 染 对 测 试 结 果 的 影 响 ， 是 两 者 的 综 合影 响 。 四 解 决 方 案1. 当 交 叉 污 染 程 度 较 轻 时 ， 设 置 防 交 叉 污 染 清 洗 程 序 ， 增加 对 样 本 针 、 试 剂 针 、 比 色 杯 的 清 洗 次 数 。2 合 理 设 置 实

29、 验 项 目 的 排 列 顺 序 ， 避 免 试 剂 交 叉 污 染 。ALT 、 AST、 TBIL、 DBIL 、 TBA、 ALP、 GGT 、 CHE 、 TP、 Alb、 Urea、 UA 、 Cr、 CK 、 CK-MB、 HBDH 、 LD、 Glu 、 TG 、 TC、 HDL-C、 LDL-C、 APOAI、 APOB、 Amy 、CO2 、 P 、 Fe、 Ca、 Mg。 (仅 供 参 考 )3 当 交 叉 污 染 程 序 较 重 时 ， 应 对 仪 器 做 大 保 养 和 维 修 ， 更换 相 应 部 件 。4. 每 个 实 验 项 目 所 需 的 样 本 量 、 试 剂

30、 量 不 要 随 意 同 比 例 降低 ， 以 保 证 反 应 液 保 持 较 大 的 缓 冲 能 力 。 设置特殊清洗程序 实验方法同确认实验，假设确认实验确认了A项目对B项目存在污染。在仪器中设置A项目 B项目进行特殊清洗。 选择特殊清洗液（仪器内部水，碱性清洗液，酸性清洗液）。 一般先设置仪器内部水，设置清洗液量，可根据项目参数中的试剂液量输入。 输入特殊清洗程序后，按A B1 B2 B3的测试顺序，进行清洗效果确认，考察B1 / B3的比值，确认是否达到清洗效果。 设置清洗程序,清洗效果确认 判定有污染 水清洗 污染 污染消除 碱性清洗液 污染 污染消除 酸性清洗液 污染 污染消除 调

31、整测试顺序等其他方法 五 注 意 事 项1 当 交 叉 污 染 较 严 重 时 ， 往 往 是 几 类 污 染 同 时 存 在 。2 项 目 编 排 顺 序 要 与 试 剂 瓶 安 放 顺 序 保 持 一 致 。 试 剂应 尽 量 选 用 大 容 量 瓶 盛 装 。3 试 剂 针 携 带 污 染 与 搅 拌 棒 携 带 污 染 的 现 象 有 很 多 共同 点 ， 鉴 别 较 复 杂 。 污染 是检验工作中的麻烦制造者 (偶发性 ,无可预测性 ) 清洗程序设定过多 样本处理速度降低 不运用清洗程序 浪费仪器功能 通过污染实验,了解实际污染现状 ,运用 ,设定清洗程序 最大程度消除污染,最大程度保证处理速度