红霉素对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞TNF

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1、红霉素对烟草烟雾剌激下人巨噬细胞TNF-a释放的抑制作用及其机制邱居烽;李梅华;钟小宁;文明智;马南;唐晓娟;黄梅;梁权【摘要】目的探讨红霉素对烟草烟雾刺激下人巨噬细胞TNF-a释放的抑制作用 及其机制方法应用佛波酯(PMA)诱导人单核细胞系U937(以下称U937细胞)为巨 噬细胞，用0.1%、1%、2.5%的烟草烟雾提取物(CSE)和0.1、1、10 pg/mL的红 霉素分别作用于巨噬细胞24、48、72 h,筛选对巨噬细胞增殖活性影响最小的红霉 素、CSE作用浓度和作用时间经筛选，选用1 pg/mL红霉素溶液和1% CSE溶液、 作用时间24 h进行后续实验将U937细胞诱导分化为巨噬细

2、胞，随机将细胞分为 空白对照组、CSE组、CSE+红霉素组、TSA组空白对照组不予处理;CSE组加入 1%CSE溶液孵育24 h;红霉素+ CSE组先加入1 pg/mL红霉素溶液预孵育24 h, 再加入1%CSE溶液孵育24 h;TSA组加入100 ng/mL TSA孵育24 h.收集各组培 养液上清，采用ELISA法检测培养液上清TNF-a含量，采用Western blotting法检 测各组HDAC1、NF-kB蛋白表达.结果空白对照组培养液上清TNF-a含量为 (274.96182.39) pg/mL,CSE 组为(744.46638.38) pg/mL,红霉素+ CSE 组为 (646

3、.57603.53) pg/mL(P均0.05).与空白对照组比较,CSE组、红霉素+ CSE 组、TSA组HDAC1蛋白表达降低、NF-kB蛋白表达升高(P均0.05);与CSE组 比较,红霉素+ CSE组HDAC1蛋白表达升高,NF-kB蛋白表达降低(P均0.05);与 红霉素+ CSE组比较,TSA组HDAC1蛋白表达降低,NF-kB蛋白表达升高(P均 0.05).结论红霉素能抑制烟草烟雾刺激下巨噬细胞TNF-a释放;其作用机制可能 是通过恢复受烟草烟雾抑制的HDAC1蛋白表达抑制NF-kB蛋白表达，使NF-kB 依赖的TNF-a释放减少，继而减轻炎症反应.Objective To in

4、vestigate the inhibitory effect of erythromycin on the TNF-a release of human macrophages stimulated by cigarette smoke and its possible mechanism. Methods The human monocytic cell line U937 cells were differentiated into human macrophages by Phorbol esters (PMA). The cigarette smoke extract (CSE) (

5、0. 1, 1, 2. 5%) and erythromycin (EM) (0. 1, 1, 10 pg/mL) were used to deal with the macrophages at different time points (24, 48, and 72 h) , respectively, and we chose the time and concentrations with the least effect on proliferation activity of macrophages. The 1 pg/mL CSE, 1% EM and 24-hour tre

6、atment time were selected for the experiment. The differentiated U937 cells were randomly divided into four groups: the control group (with no intervention) , CSE group (1% CSE stimulation for 24 h) , CSE + EM group (pre-incubation with 1 pg/ml EM for 24 h before 1% CSE stimulation for 24 h) , and T

7、SA group(TSA stimulation for 24 h). The TNF-a level in the culture supernatants was measured by ELISA; Western blotting was used to measure the expression of the histone deacetylase- 1(HDAC1) and NF-kB protein. Results The level of TNF-a in the culture supernatants of the control group, CSE group, a

8、nd CSE + EM group were (274. 96 182. 39) , (744. 46 638. 38) , and (646. 57 603. 53) pg/mL, respectively (all PvO. 05). Compared with the control group, the expression of HDAC1 protein in the CSE group, EM + CSE group, and TSA group decreased, and the expression of NF-kB protein increased(all PvO. 0

9、5). Compared with the CSE group, the expression of HDAC1 protein increased, and the expression of NF-kB protein decreased in the EM + CSE group (both P 0. 05). Compared with the EM + CSE group, the expression of HDAC1 protein in the TSA group decreased, and the expression of NF-kB protein increased

10、(both P 0. 05). Conclusions EM inhibits the release of TNF-a of human macrophages induced by cigarette smoke. The mechanism is that EM may restore the expression of HDAC1 and inhibit the expression of NF-kB, which decreases the release of TNF-a and thus alleviates the inflammatory response.【期刊名称】山东医

11、药【年(卷),期】2018(058)008【总页数】4页(P22-25)【关键词】慢性阻塞性肺疾病;红霉素;烟草烟雾暴露;炎症反应;肿瘤坏死因子a;组蛋白去乙酰化酶1【作 者】 邱居烽;李梅华;钟小宁;文明智;马南;唐晓娟;黄梅;梁权【作者单位】 广西医科大学第一附属医院,南宁 530021;广西医科大学第一附属医 院,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院,南宁 530021;广西医科大学第一附属 医院,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院,南宁 530021;广西医科大学第一附 属医院,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院,南宁 530021;广西医科大学第一 附属医

12、院,南宁 530021【正文语种】 中 文【中图分类】 R563慢性阻塞性肺疾病(COPD )是一种具有气流受限特征的肺部疾病，其发病机制与免疫反应、氧化应激、蛋白酶与抗蛋白酶失衡等有关1。吸烟可通过多种途径参与 COPD的发生。研究证实，烟草烟雾吸入可诱发气道炎症反应，在此过程中巨噬 细胞可分泌多种细胞因子和炎症介质，如TNF-a、IL-8、IL-6等，导致炎症细胞 募集、浸润和激活，继而引起气道结构破坏2。近年研究发现，长期小剂量应用 大环内酯类抗生素（如红霉素）可通过抑制炎症介质的产生而抑制气道炎症反应3,4 2016年6月 2017年5月，本研究观察了红霉素对烟草烟雾提取物（CSE）刺

13、激下 人巨噬细胞TNF-a释放的影响，现分析结果并探讨红霉素抑制气道炎症反应的作 用机制。1 材料与方法1.1材料人类单核细胞株U937（以下称U937细胞），购自中国科学院细胞库。真 龙牌过滤型香烟（焦油量15 mg，烟碱量1.2 mg），广西卷烟总厂。红霉素、曲古 霉素A（TSA）、佛波酯，美国Sigma公司。ELx800全自动酶标仪，美国BioTek 公司；DYY-7C电泳仪，北京六一生物科技有限公司；5813R高速离心机，艾本 德中国有限公司； E-Gel Imager 凝胶成像系统，赛默飞世尔科技（中国）有限公司 MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；TNF

14、-a ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems公司；全蛋白提取试剂盒，美国Pierce 公司；兔抗组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）多克隆抗体、兔抗NF-kB多克隆抗体， 美国Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG,美国Pierce公司。1.2 CSE溶液制备CSE溶液制备参照Mercado等5啲方法：实验前1 h,将2支 点燃的去过滤嘴香烟连于一抽吸驱动装置，反复缓慢抽吸，使其烟雾通过10 mL RPMI 1640培养液中制成CSE悬液，调整悬液pH值至7.4，在超净台中经0.22 pm无菌微孔滤膜过滤，即为CSE原液。用RPMI 1640培养液将CSE原液浓度 稀释至10%备用。1

15、.3红霉素、CSE溶液抑制巨噬细胞增殖活性的最佳作用浓度和作用时间筛选将 U937细胞接种于含10% FBS的RPMI 1640完全培养基中，置于37 C、5%C02细胞培养箱中培养，23天传代。取传2代对数生长期细胞，接种于96孔 板，每孔(0.5 -1)x104个，然后加入200 ng/mL佛波酯溶液10 pL,诱导分化 24 h即可分化为巨噬细胞6。将分化的巨噬细胞分为两部分，一部分分别加入使 细胞干预终浓度为0.1、1、10 pg/mL红霉素溶液7,另一部分分别加入使细胞 干预终浓度为0.1%. 1%、2.5% CSE溶液，两部分均设置阴性对照孔，每个浓度 设3个复孔；分别于孵育24、

16、48、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液，继续 培养4 h,弃去上清液，加入DMSO 150 pL,振荡混匀。酶标仪450 nm波长处 检测各孔的光密度(OD)值。以OD450值代表细胞增殖活性。结果见表1、2。结 果显示,2.5% CSE溶液作用24、48、72 h均能明显抑制巨噬细胞增殖活性(P均 0.05),而0.1、1、10 pg/mL红霉素溶液和0.1%、1% CSE溶液对巨噬细胞增 殖活性影响不大(P均0.05)。为使CSE和红霉素作用于U937细胞时尽可能发挥 各自作用，又不影响细胞增殖活性，故选用干预终浓度为1 pg/mL红霉素溶液和 1% CSE溶液、作用时间24

17、h进行后续实验。表1不同浓度红霉素溶液作用24、48、72 h巨噬细胞增殖活性比较红霉素溶液 浓度(pg/mL)细胞增殖活性24h48h72h00.920.201.030.201.140.210.10.910.180.930.200.990.20 10.900.180.990.191.020.17100.910.200.990.211.010.20 注：不同浓度红霉素溶液细胞增殖活性两两比较，P均0.05。1.4细胞分组处理取传2代对数生长期U937细胞，接种于含10% FBS RPMI 1640完全培养基的培养瓶中，每瓶(0.50.6)x107个，按1.3中的方法诱导分化 为巨噬细胞，并随机

18、分为空白对照组、CSE组、红霉素+CSE组、TSA组。空白对 照组不予处理；CSE组加入1% CSE溶液孵育24 h ;红霉素+CSE组先加入1 pg/mL红霉素溶液预孵育24 h，再加入1% CSE溶液孵育24 h ; TSA组加入 100 ng/mL TSA 孵育 24 h。表2不同浓度CSE溶液作用24、48、72 h巨噬细胞增殖活性比较CSE溶液浓度 细胞增殖活性 24h 48h 72h 00.920.20 1.030.20 1.140.21 0.1%0.910.180.970.201.000.191%0.760.110.880.171.060.172.5%0.5 1O.17*#aAv

19、O.46O.15*#2.4OO.14*#a注：与阴性对照同期比较，*P0.05 ;与0.1% CSE溶液同期比较，#Pv0.05 ;与 1% CSE溶液同期比较，0.05;与同浓度作用48 h比较，0.05;与同浓 度作用72 h比较，沖0.05。1.5 相关指标观察1.5.1培养液上清TNF-a含量各组细胞孵育结束，收集培养液，4 000xg离心20 min，留取培养液上清。按ELISA试剂盒说明配置标准品，样品孑L每孔加入100 pL待测样品，标准品孑L每孔加入100 pL倍比稀释好的标准品，37 C温育2 h ；每孔加入生物素标记抗体工作液100 pL,37 C温育1 h ；弃去孔内液体

20、，洗 板3次，每孔加入100 pL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液,37 C温育1 h ; 弃去孔内液体，洗板5次，每孔加入90 pL底物溶液,37 C避光显色30 min , 再加入50 pL终止液终止反应。酶标仪450 nm波长处检测各组OD值。根据标 准品OD值绘制标准曲线，计算各组培养液上清TNF-a含量。1.5.2细胞HDAC1、NF-kB蛋白表达采用Western blotting法。各组细胞孵育 结束，用预冷的PBS清洗3次，RIPA裂解液提取细胞总蛋白。取细胞总蛋白按 4:1比例加入蛋白上样缓冲液,100 C水浴5 min，使蛋白充分变性，-80 C保 存。取变性蛋白50 p

21、g行SDS-PAGE , 90 V恒压2 h , 200 mA恒流70 min ;电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，TBST洗膜5 minx5次，用含5% 脱脂牛奶的封闭液封闭1 h ; TBST洗膜5 minx5次，分别加入含HDAC1(1:1 000)或 NF-kB(1：1 000)或 p-actin(1：1 000)一抗，4 C摇床孵育过夜；次日 TBST洗膜5 minx5次，加入山羊抗兔IgG二抗(1:1 000)，常温孵育1 h ;TBST 清洗，暗室中显影、定影。采用凝胶图像分析系统分析各蛋白电泳条带的灰 度值。以p-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电

22、泳条带灰度值 的比值作为目的蛋白相对表达量。1.6统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因 素方差分析，两组间比较采用t检验。PvO.O5为差异有统计学意义。2 结果2.1各组培养液上清TNF-a含量比较空白对照组培养液上清TNF-a含量为 (274.96182.39)pg/mL, CSE 组为(744.46638.38)pg/mL,红霉素+CSE 组为 (646.57603.53)pg/mL。组间两两比较 P 均0.05。2.2各组HDAC1、NF-kB蛋白表达比较见表3。表3各组HDAC1、NF-kB蛋白相对表达量比较组别HDAC1NF-KB空白对照组1.

23、0490.0020.1050.018CSE 组 0.9980.001*0.8400.131*红霉素+CSE 组 1.0130.010*#0.1850.020*#TSA 组 0.9140.001也0.8470.028也注：与空白对照组比较，*P0.05 ;与CSE组比较，#P0.05 ；与红霉素+CSE组 比较宀0.05。3 讨论研究发现，COPD患者痰中巨噬细胞数量增多，并且能够通过分泌细胞因子、趋 化因子、生长因子等参与炎症应答及免疫调节，与 COPD 的发病息息相关2 ， 8 烟草烟雾能够直接激活巨噬细胞释放细胞因子和炎症介质，如IL-8、TNF-a、CCL2 等，进一步导致炎症细胞募集和

24、激活，引起炎症状态持续和组织损伤9。既 往研究表明，烟草烟雾通过激活巨噬细胞的核因子转录系统(如NF-kB),促进炎症 介质释放10，从而诱导炎症。TNF-a作为重要的促炎因子参与炎症反应中炎症 细胞和炎症因子的聚集、释放等，与炎症的维持和发展密切相关。研究表明，烟草 烟雾能刺激人巨噬细胞TNF-a释放增加11。而TNF-a的释放是由转录因子调控 的，已有研究证实，TNF-a释放与NF-kB密切相关，通过钙蛋白酶抑制剂抑制 iKBa活性，可减少NF-kB表达，降低NF-kB依赖的炎症因子TNF-a释放12 14。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)包括4个组18个亚型，其中I型(HDAC1、2、3、

25、8) 已被证实在炎症反应中具有重要作用，其与组蛋白乙酰转移酶(HATs)作用相反 15。HATs相关乙酰化作用使得染色质解螺旋至转录因子和相应RNA聚合酶结 合到DNA 上促进转录激活，HDACs则通过调节染色质作用增加组蛋白去乙酰化 进而抑制转录，抑制炎症应答15 , 16。HDAC1是HDACs的重要亚型，可通过 乙酰化作用抑制 NF-KB 表达和激活，在调节炎症反应过程中至关重要17。 临床研究证实，红霉素可作为抗炎和免疫调节剂用于治疗慢性肺部疾病，如 COPD、弥漫性泛细支气管炎、支气管哮喘等。红霉素可通过增加H DACs表达及 活性，抑制炎症基因转录，减少促炎细胞因子生成和白细胞黏附

26、，加速中性粒细胞 死亡和清除，在减轻COPD气道炎症反应中具有重要作用7 , 18。本研究观察了红霉素对巨噬细胞TNF-a释放及其对HDAC1、NF-kB蛋白表达的 影响。结果显示，与空白对照组比较，CSE组和红霉素+CSE组培养液上清TNF- a含量明显增加；而红霉素+CSE组培养液上清TNF-a含量较CSE组明显降低。 提示烟草烟雾诱导的炎症反应可能是通过促使巨噬细胞释放炎症介质 TNF-a 增加 导致的，而红霉素能降低巨噬细胞 TNF-a 释放进而发挥抗炎作用。本研究结果显 示，与空白对照组比较，CSE组、红霉素+CSE组NF-kB蛋白表达升高，HDAC1 蛋白表达降低，提示烟草烟雾刺激

27、可能通过抑制HDAC1蛋白表达、激活NF-kB 信号通路，继而引起炎症应答。TSA是H DAC的特异性抑制剂，本研究以TSA作 为阳性对照，结果发现CSE组与TSA组HDAC1蛋白表达均降低，NF-kB蛋白表 达均升高，进一步验证了上述结论。本研究还发现，与CSE组比较，红霉素+CSE 组NF-kB蛋白表达降低，HDAC1蛋白表达上升，提示红霉素能够通过恢复HDAC1蛋白表达及降低NF-kB蛋白表达进而发挥抗炎作用。研究证实，烟草烟雾诱导的炎症反应过程是通过抑制巨噬细胞HDAC1蛋白表达，激活NF-kB信号 通路，进而引起TNF-a释放增加而实现的；红霉素干预可使巨噬细胞HDAC1蛋 白表达上

28、调，抑制NF-kB蛋白表达，NF-kB依赖的TNF-a释放减少，继而减轻 炎症反应。我们推测这可能是红霉素减轻烟草烟雾刺激诱导炎症反应的分子机制之O综上所述，红霉素能抑制烟草烟雾刺激下巨噬细胞TNF-a释放增多，其作用机制 可能是通过恢复受烟草烟雾抑制的HDAC1蛋白表达，抑制NF-kB蛋白表达，使 NF-kB依赖的TNF-a释放减少，继而减轻炎症反应。本研究为红霉素用于治疗慢 性气道炎症性疾病提供了实验依据。【相关文献】1 Barnes PJ, Burney PG, Silverman EK, et al. Chronic obstructive pulmonary diseaseJ. Na

29、t Rev Dis Primers, 2015(1):15076.2 Higham A, Lea S, Ray D, et al. Corticosteroid effects on COPD alveolar macrophages: dependency on cell culture methodologyJ. J Immunol Methods, 2014(405):144-153.3 Yao GY, Ma YL, Zhang MQ, et al. Macrolide therapy decreases chronic obstructive pulmonary disease exa

30、cerbation: a meta-analysisJ. Respiration, 2013,86(3):254-260.4 Li M, Zhong X, He Z, et al. Effect of erythromycin on cigarette-induced histone deacetylase protein expression and nuclear factor- kB activity in human macrophages in vitroJ. Int Immunopharmacol, 2012,12(4):643-650.5 Mercado N, To Y, Ito

31、 K, et al. Nortriptyline reverses corticosteroid insensitivity byin hibiti on of phospho ino sitide-3-K in ase-oJ. J Pharmacol Exp Ther, 2011,337(2) :465-470.6 Taniguchi K, Hikiji H, Okinaga T, et al. Essential role of lysophosphatidylcholine acyltransferase 3 in the induction of macrophage polariza

32、tion in PMA-Treated U937 CellsJ. J Cell Biochem, 2015,116(2):2840-2848.7 Sun XJ, Li ZH, Zhang Y, et al. Combination of erythromycin and dexamethasone improves corticosteroid sen sitivity in duced by CSE through in hibit ing PI3K-o/Akt pathway and increasing GR expressionJ. Am J Physiol Lung Cell Mol

33、 Physiol, 2015,309(2):139-146.8 Moermans C, Bonnet C, Willems E, et al. Sputum cytokine levels in patients undergoing hematopoietic SCT and comparison with healthy subjects and COPD: a pilot studyJ. Bone Marrow Transplant, 2014,49(11):1382-1388.9 Caramori G, Adcock IM, Di Stefano A, et al. Cytokine

34、inhibition in the treatment of COPDJ. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis, 2014(9):397-412.10 李梅华，钟小宁，柳广南，等红霉素抑制肿瘤坏死因子a对人支气管上皮细胞核因子-kB的 激活J.中华内科杂志，2005，44(7) : 530-531.11 Bain WG, Tripathi A, Mandke P, et al. Low-dose oxygen enhances macrophage- derived bacterial clearance following cigarette smoke expo

35、sureJ. J Immunol Res, 2016,2016:1280347.12 Li X, Luo R, Chen R, et al. Cleavage of IkBa by calpain induces myocardial NF-kB activation, TNF-a expression, and cardiac dysfunction in septic miceJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2014,306(6):833-843.13 Yang BC, Yang ZH, Pan XJ, et al. Crotonaldehyde-e

36、xposed macrophages induce IL-8 release from airway epithelial cells through NF-kB and AP-1 pathwaysJ. Toxicol Lett, 2013,219(1):26-34.14 Gangwani MR, Kumar A. Multiple protein kinases via activation of transcriptionfactors NF-kB, AP-1 and C/EBP-o regulate the IL-6/IL-8 producti on by HIV-1 vpr in as

37、trocytesJ. PLoS One, 2015,10(8):135633.15 Barnes PJ. Role of HDAC2 in the pathophysiology of COPDJ. Annu Rev Physiol, 2009(71):451-464.16 Ito K, Ito M, Elliott WM, et al. Decreased histone deacetylase activity in chronic obstructive pulmonary diseaseJ. N Engl J Med, 2005,352(19):1967-1976.17 Schulig

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