生物化学第9章酶促反应动力学

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1、第9章 酶促反应动力学一、一、化学动力学基础化学动力学基础二、底物浓度对酶反应速率的影响二、底物浓度对酶反应速率的影响三、酶的抑制作用三、酶的抑制作用四、温度对酶反应的影响四、温度对酶反应的影响五、五、pH对酶反应的影响对酶反应的影响六、激活剂对酶反应的影响六、激活剂对酶反应的影响(kinetics of enzyme-catalyzed reaction)研究酶促反应动力学的意义 酶酶促促反反应应动动力力学学是是研研究究酶酶促促反反应应的的速速率率以以及及影影响响此此速速率率的的各各种种因因素素的的科科学学。在在研研究究酶酶的的结结构构与与功功能能的的关关系系以以及及酶酶的的作作用用机机制制

2、时时，需需要要动动力力学学提提供供实实验验证证据据；为为发发挥挥酶酶催催化化反反应应的的高高效效率率，寻寻找找最最有有利利的的反反应应条条件件；为为了了解解酶酶在在代代谢谢中中的的作作用用和和某某些些药药物物的的作作用用机机制制等等，都需要掌握酶促反应速率的规律。都需要掌握酶促反应速率的规律。二、底物浓度对酶反应速率的影响酶反应速率对底物浓度作图中间复合物学说 为为了了解解释释这这个个现现象象，Henri和和Wurtz提提出出了了酶酶底底物物复复合合物物学学说说。该该学学说说认认为为，当当酶酶催催化化反反应应时时，酶酶首首先先与与底底物物结结合合，生生成成酶酶底底物物复复合合物物，然然后后生生

3、成成产产物物，并并释释放放出出酶酶。反反应应用用下下式表示：式表示：S+E ES P+E 酶底物中间复合物存在的证据电子显微镜和电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物的复光衍射直接观察到酶与底物的复合物。合物。酶与底物结合后光谱发生变化。酶与底物结合后光谱发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。溶解度或热稳定性在加入底物后发生变化。分离到了酶底物复合物。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降的现象。现象。平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同同(半透膜的一侧有酶，另一侧无酶

4、，有酶一侧底半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧物浓度高于无酶一侧)。（1）平衡学说（Henri，Michaelis和和Menten方程）方程）1902年年Henri和和Brown提提出出了了酶酶催催化化的的反反应应机理机理 1913年年Michaelis和和Menten完完善善了了这这个个理理论论，他他们们认认为为酶酶反反应应的的第第一一步步是是快快速速可可逆逆的的平平衡衡，第二步慢，为限速反应。第二步慢，为限速反应。平衡学说推导反应速度方程的假设前提 在推导动力学方程时，有几点假设：在推导动力学方程时，有几点假设：第第一一步步迅迅速速平平衡衡，第第二二步步慢慢，即即

5、k3 E，S ES。酶以酶以E和和ES两种状态存在。两种状态存在。根据平衡学说推导速度方程设设Vf 为为E与与S结合的速度，结合的速度，Vr 为为ES解离的速度，解离的速度，则则Vfk 1(E0ES)(SES)Vrk 2 ES 平衡时平衡时VfVr k 1(E0ES)(SES)k 2 ES又又 S ES SESS根据平衡学说推导速度方程 k1(E0ES)S k 2 ES 解出解出 ES 得得 令令 ，则则 根据平衡学说推导速度方程 由于由于V=k 3 ES，代入前式代入前式得得 因因为为当当所所有有的的E都都成成为为ES时时，可可达达最最大大反反应应速度，即速度，即Vm=k 3 E0，所以所以

6、 这就是米氏方程。这就是米氏方程。米氏方程 米氏方程是一个双曲线方程，若以米氏方程是一个双曲线方程，若以SS为自变为自变量，量，V V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。结果相符。（2）稳态理论 1925年年，Briggs和和Haldane提提出出了了稳稳态态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很重要的修正：理论，对米氏方程做了一项很重要的修正：在在 反反应应式式中中，k3值值不小，后一步骤不是限速步骤。不小，后一步骤不是限速步骤。所所谓谓稳稳态态是是指指反反应应进进行行一一段段时时间间后后，系系统统中中的的酶酶底底物物复复合合

7、物物浓浓度度由由零零逐逐渐渐增增加加到到一一定定数数值值，然然后后保保持持不不变变，即即处处于于稳稳态态水水平平，此此时时ES的的解解离离和和分分解解速速率之和等于率之和等于ES的形成速率的形成速率，根据稳态学说推导速度方程产生产生ES的速率的速率消耗消耗ES的速率的速率 稳态时稳态时所以所以根据稳态学说推导速度方程 移项得移项得令令 ，代入上式得，代入上式得 将上式中的将上式中的ES解出得解出得 此此ES即为稳态时的复合物浓度。即为稳态时的复合物浓度。根据稳态学说推导速度方程因为酶反应速率与因为酶反应速率与ES成正比，即成正比，即 所以所以 又因为当所有的酶都与底物结合形成复合物时，又因为当

8、所有的酶都与底物结合形成复合物时，反应速率达到最大，即反应速率达到最大，即 ，代入上式得，代入上式得 （稳态法）（稳态法）（快速平衡法）（快速平衡法）两个米氏方程的区别 这这两两个个方方程程的的区区别别就就在在于于快快速速平平衡衡法法推推导导的的方方程程中中米米氏氏常常数数是是Ks，而而稳稳态态法法推推导导的的米米氏氏方程中米氏常数是方程中米氏常数是Km。Ks是是 ES 的解离平衡常数的解离平衡常数米氏方程的几个特点从米氏方程中可以看出：从米氏方程中可以看出：当当S Km时时，反反应应速速率率达达到到最大，并与底物浓度无关，属零级反应；最大，并与底物浓度无关，属零级反应；当当S=Km时时，所所

9、以以，Km的的意意义义是是使使反反应应速速率率达达到到最最大大反反应应速速率率一一半半时时的的底底物浓度。物浓度。米氏方程曲线米氏常数的意义 Km是是酶酶的的特特征征性性常常数数，其其单单位位是是浓浓度度单单位位。在在一一定的反应条件下，对于一定的底物，定的反应条件下，对于一定的底物，Km是定值。是定值。Km可可以以判判断断酶酶的的天天然然底底物物。有有些些酶酶可可以以作作用用于于几几个底物，其中个底物，其中Km最小的底物是天然底物。最小的底物是天然底物。当当k3 Km时时，V=Vm=k3E0，此此时时对对底底物物来来说说是是零零级级反反应应，对对酶酶来来说说是是一一级级反反应应，k3是是一一

10、级级反反应应速速率率常常数数，k3表表示示当当酶酶被被底底物物饱饱和和时时每每秒秒钟钟每每个个酶酶分分子子转转换换底底物物的的分分子子数数（又又称称为为转转换换数数），这这时时的的k3又又可可以以写写成成 kcat，kcat 越越大大，说说明明酶酶的的催催化效率越高。化效率越高。kcat/Km的意义 Kcat/Km表表示示酶酶的的催催化化效效率率，Kcat/Km越越大大，催催化化效效率率越越高高。，其其最最大大值值极极限限是是k k1，而而k k1是是酶酶与与底底物物结结合合的的速速率率常常数数，此此常常数数受受到到底物在溶液中扩散速度的影响。底物在溶液中扩散速度的影响。作图法求Km和Vm值（

11、Lineweaver-Burk双倒数作图法）双倒数作图法）将米氏方程两边取倒数得将米氏方程两边取倒数得 在一系列在一系列S下测出相应的反应速率下测出相应的反应速率v，以以 对对 作图，可得出作图，可得出Km和和Vm值。值。米氏方程的双倒数图多底物的酶促反应动力学（酶促反应按底物分子数的分类酶促反应按底物分子数的分类）底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B+CA-B+H2O AOH+BH5%12%26%双底物双底物氧化还氧化还原酶原酶转移酶转移酶AH2 B A+BH2A2+B3+A3+B2+A+BX

12、AX+B27%24%三底物三底物连接酶连接酶A+B+ATP AB+ADP+Pi A+B+ATP AB+AMP+PPi6%多底物反应按动力学机制分类（序列反应序列反应）底物的结合和产物的释放有一定的顺序：底物的结合和产物的释放有一定的顺序：E+A+BEABEPQE+P+Q 产产物物不不能能在在两两种种底底物物都都结结合合之之前前释释放放。这这类反应又可以分为两种类型。类反应又可以分为两种类型。有序反应（ordered reaction）其中其中P是是B转变的产物，转变的产物，Q是是A转变的产物。转变的产物。如如脱脱氢氢酶酶的的辅辅酶酶NAD(P)+相相当当于于A，NAD(P)H相相当于当于Q。随

13、机反应（random reaction）如如肌肌酸酸激激酶酶催催化化肌肌酸酸与与ATP反反应应生生成成磷磷酸肌酸和酸肌酸和ADP。乒乓反应乒乓反应（ping pong reaction）如转氨酶催化转氨反应：如转氨酶催化转氨反应：氨基酸氨基酸1 酮酸酮酸2 酮酸酮酸1 氨基酸氨基酸2 A B P Q三、酶的抑制作用 因因酶酶蛋蛋白白变变性性而而酶酶活活力力丧丧失失称称为为酶酶的的失失活活作作用用，而而因因为为某某种种物物质质与与酶酶结结合合使使酶酶活活力力丧丧失失称称为为酶酶的的抑抑制制作作用用，酶酶受受抑抑制制丧丧失失活活力力时时酶酶蛋蛋白白并并没没有有变变性性。能能抑抑制酶活力的物质称为酶

14、的抑制剂（制酶活力的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。）。研研究究酶酶的的抑抑制制作作用用是是研研究究酶酶的的结结构构和和功功能能、酶酶的的催催化化机机制制，以以及及阐阐明明代代谢谢途途径径的的基基本本手手段段，也也可可以以为为医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。医药设计新药物和为新农药的研制提供理论依据。抑制程度的表示方法（1 1）相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）（2 2）相对活力百分数（残余活力百分数）相对活力百分数（残余活力百分数）（3 3）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）抑制分数（被抑制而失去活力的分数）（4 4）抑制百分数）抑制百分数抑制作用

15、的类型1不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition）抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心的的基基团团以以共共价价键键结结合合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibition）抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心的的基基团团以以非非共共价价键键结结合合，可可以以用用透透析析、超超滤滤、凝凝胶胶过过滤滤等等物物理理方方法法去除而使酶恢复活力。去除而使酶恢复活力。可逆抑制作用的3种类型（1 1）竞争性抑制（）竞争性抑制（competitive inhibi

16、tion）I 和和 S 竞竞争争与与酶酶的的活活性性中中心心结结合合，二二者者只只能能结结合合一一个个。竞竞争争性性抑抑制制剂剂通通常常是是底底物物类类似似物物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反应。竞争性抑制剂举例可逆抑制作用的3种类型（2 2）非竞争性抑制（）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）I 与与 S 可可以以分分别别与与酶酶结结合合，谁谁先先结结合合都都可可以以，形形成成 ESI 三三元元复复合合物物，但但 ESI 中中的的 S 不不能能转转变变成成产产物物。这这类类抑抑制制剂剂是是与与酶酶活活性性中中心心之之

17、外外的的某某个个部部位结合。位结合。竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理可逆抑制作用的3种类型（3）反竞争性抑制剂（）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition）I 只只与与 ES 结结合合，只只有有 ES 能能分分解解出出产产物物，ESI 中中的的 S 不不能能转转变变成成产产物物。由由于于 I 的的存存在在促促进进了了 E 和和S 的的结合，所以称为反竞争性抑制。结合，所以称为反竞争性抑制。ES+I ESI P+E+I可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别 在在反反应应系系统统中中加加入入一一定定量量的的抑抑制制剂剂，以以及及不不同同量量的的酶酶，测测定定反反应应速速率

18、率与与酶酶量量的的关关系系。斜斜率率较较小小的的直直线线是是可可逆逆抑抑制制剂剂，不不通通过过原原点点但但斜斜率与对照相同的是不可逆抑制剂。率与对照相同的是不可逆抑制剂。1.control2.irreversible inhibitor3.reversible inhibitor可逆抑制作用和不可逆抑制作用的动力学鉴别 在在反反应应系系统统中中加加入入不不同同量量的的酶酶及及抑抑制制剂剂，作作不不同同抑抑制制剂剂浓浓度度下下反反应应速速率率对对酶酶量量的的直直线线。可可逆逆抑抑制制剂剂得得到到的的是是一一组组通通过过原原点点但但斜斜率率不不同同的的直直线线，不不可可逆逆抑抑制制剂剂得得到到的的

19、是是一一组组不不通通过过原原点点但但斜斜率率与与对对照照相相同的平行线。同的平行线。一些重要的不可逆抑制剂（1 1）非专一性不可逆抑制剂）非专一性不可逆抑制剂 有机磷化合物有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物 重金属盐重金属盐 烷化试剂烷化试剂 氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和CO 青霉素青霉素（2 2）专一性不可逆抑制剂）专一性不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 有机磷化合物 很很多多农农药药是是有有机机磷磷化化合合物物，它它们们能能抑抑制制某某些些蛋蛋白白酶酶及及酯酯酶酶的的活活力力，与与酶酶分分子子活活性性部部位位的的丝

20、丝氨氨酸酸羟羟基基共共价价结结合合而而使使酶酶失失活活。这这类类化化合合物物强强烈烈地地抑抑制制胆胆碱碱酯酯酶酶活活力力，使使乙乙酰酰胆胆碱碱不不能能水水解解成成乙乙酸酸和和胆胆碱碱，导导致致乙乙酰酰胆胆碱碱积积累累，引引起起神神经经中中毒毒症症状状。所所以以这这类类化化合合物物又又称称为为神神经经毒毒剂剂。用用解解磷磷定定（碘碘化化醛醛肟肟甲甲基基吡吡啶啶）或或氯氯磷磷定定（氯氯化化醛醛肟肟甲甲基基吡吡啶啶）能能把把酶酶上上的的毒毒剂剂夺夺取取下下来来，使酶恢复活力，达到解毒的作用。使酶恢复活力，达到解毒的作用。有机磷化合物解磷定的解毒机理有机汞化合物 有有机机汞汞化化合合物物能能与与酶酶的

21、的巯巯基基结结合合而而使使酶酶失失活活。过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。能解毒。有机砷化合物 有有机机砷砷化化合合物物能能与与酶酶的的巯巯基基结结合合而而使使酶酶失失活活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。二巯基丙醇）能解毒。路易斯毒气路易斯毒气为了六十一个阶级兄弟重金属盐 Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在在高高浓浓度度时时能能使使酶酶蛋蛋白白变变性性，低低浓浓度度时时抑抑制制某某些些酶酶的的活活力力。可可用用金金属螯合剂属螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。半胱氨酸等螯合除去重金属离子。烷烷化化试试剂剂含含有有一一个个活活泼泼的的卤卤素

22、素离离子子，能能够够修修饰饰酶酶分分子子中中的的许许多多基基团团，如如巯巯基基、氨氨基基、羧羧基基、咪咪唑唑基及硫醚基等。基及硫醚基等。烷化试剂氰化物、硫化物和CO 氰氰化化物物能能与与细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶中中的的Fe2+结结合合，使使酶酶失失活活不不能能呼呼吸吸。CO与与血血红红蛋蛋白白结结合合阻阻止止氧氧运运输输。硫硫化化物物能能与与多多种种含含金金属属的的酶酶形形成成较较为为稳稳定定的的络络合合物物，使酶失活。使酶失活。糖糖肽肽转转肽肽酶酶在在细细菌菌细细胞胞壁壁合合成成中中使使肽肽聚聚糖糖链链交交联联。青青霉霉素素与与糖糖肽肽转转肽肽酶酶的的丝丝氨氨酸酸羟羟基基结结合合，使使细

23、细菌细胞壁不能合成。菌细胞壁不能合成。青霉素 青霉素的抗菌机理Ks型不可逆抑制剂 此此类类抑抑制制剂剂结结构构与与底底物物类类似似，并并带带有有高高反反应应性性基基团团，与与酶酶活活性性部部位位结结合合后后，修修饰饰活活性性部部位位的的基基团团使使酶酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的胰蛋白酶的Ks型抑制剂型抑制剂Kcat型不可逆抑制剂 此此类类抑抑制制剂剂不不但但结结构构与与底底物物类类似似，而而且且需需要要经经酶酶催催化化反反应应后后才才产产生生高高反反应应性性基基团团，比比Ks型型不不可可

24、逆逆抑抑制制剂专一性更强。剂专一性更强。-卤代卤代-D-D-丙氨酸丙氨酸 磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶丙氨酸消旋酶可逆抑制剂（底物的类似物底物的类似物）合成叶酸的组分合成叶酸的组分磺磺胺胺药药物物竞竞争争抑抑制制二二氢氢叶酸合成酶的活性叶酸合成酶的活性 蝶呤蝶呤 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸 叶酸叶酸（磺胺药物）（磺胺药物）可逆抑制剂（过渡态底物类似物过渡态底物类似物）过过渡渡态态底底物物类类似似物物抑抑制制力力更更强强，因因为为酶酶对对过过渡渡态态底底物物的的亲亲和和力力比比对对底底物物的的亲亲和和力力强强得多。得多。多多种种酶酶催催化化反反应应时的过渡态底物时的过渡态底物过渡

25、态底物类似物过渡态底物类似物可逆抑制剂（过渡态底物类似物过渡态底物类似物）可逆抑制剂（过渡态底物类似物过渡态底物类似物）四、温度对酶反应的影响 在在较较低低温温度度范范围围内内，酶酶反反应应速速率率随随着着温温度度的的升升高高而而增增加加，当当温温度度高高到到一一定定程程度度时时，酶酶开开始始变变性性失失活活，反反应应速速率率反反而而下下降降。所所以以对对于于酶酶反反应应来来说说，有有一一个个最最适适反反应应温温度度。一一般般来来说说，动动物物细细胞胞内内酶酶的的最最适适反反应应温温度度在在3540，植植物物细细胞胞中中的的酶酶可可达达4050，也也有有一一些些生生长长在在堆堆肥肥、温温泉泉中

26、中的的微微生生物物酶酶的的最最适适温温度度更更高高，如如Taq DNA聚聚合合酶酶的最适温度可高达的最适温度可高达70。需需要要注注意意的的是是，最最适适温温度度值值不不是是酶酶的的特特征征性性常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。常数，此值随着反应时间的延长而有所下降。温度对酶反应速率的影响五、pH对酶反应的影响 酶酶的的活活力力受受环环境境pH的的影影响响，存存在在一一个个最最适适反反应应pH。酶酶的的最最适适反反应应pH也也不不是是一一个个特特征征性性常常数数，而而是是受受到到底底物物种种类类和和浓浓度度、缓缓冲冲液液种种类类和和浓度的不同而改变。浓度的不同而改变。4种酶的pH-酶活性

27、曲线胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胆碱酯酶胰蛋白酶胰蛋白酶pH影响酶活力的原因pH影响酶活力的原因有以下几方面：影响酶活力的原因有以下几方面：过酸或过碱使酶变性失活。过酸或过碱使酶变性失活。pH偏偏离离最最适适pH不不多多时时，酶酶分分子子中中及及底底物物分分子子中中各各可可解解离离基基团团的的解解离离状状态态发发生生了了变变化化，不不利利于于底底物物与酶的结合及催化反应。与酶的结合及催化反应。由由于于酶酶分分子子可可解解离离基基团团的的解解离离状状态态发发生生了了改改变变，导导致致酶酶分分子子构构象象发发生生改改变变，不不利利于于底底物物与与酶酶的的结结合合及催化反应。及催化反

28、应。最适反应pH示意图六、激活剂对酶反应的影响 有有些些物物质质与与酶酶结结合合后后可可以以提提高高酶酶活活力力，这这些些物物质质称称为为酶酶的的激激活活剂剂（activator）或或活活化化剂剂，它它们们大大部部分分是是无无机机离离子子或或小小分分子子化化合合物物，少少数数是是大大分分子子物物质质如如蛋蛋白白质质。作作为为激激活活剂剂的的金金属属离离子子有有K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+等等，它它们们与与酶酶蛋蛋白白结结合合后后，或或稳稳定定酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。酶蛋白的构象，或参与底物的结合，或催化反应。激活剂对酶反应的影响 不不同同的的激激活活剂剂激激活活不不同同的的酶酶，有有些些激激活活剂剂激激活活一一种种酶酶，却却又又抑抑制制另另一一种种酶酶。激激活活剂剂的的浓浓度度也也对对其其效效应应有有影影响响，一一定定浓浓度度时时起起激激活活作作用用，超超过过这这个个浓浓度又起抑制作用。度又起抑制作用。在在机机体体内内有有许许多多调调节节酶酶活活力力的的方方式式，其其中中抑抑制制剂和激活剂的调节属于最快速的方式。剂和激活剂的调节属于最快速的方式。