卫生化学--第5章-荧光分析法

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1、1 第 五 章荧 光 分 析 法Fluorometry 2 概 述某 些 化 合 物 在 受 到 光 辐 射 后 ， 除 了 吸 收 某 种波 长 的 光 之 外 ， 还 会 发 射 比 原 来 所 吸 收 的 波长 更 长 的 光 光 致 发 光 现 象光 致 发 光 荧 光磷 光 分 子 荧 光原 子 荧 光荧 光 分 析 法 ： 根 据 物 质 的 荧 光 谱 线 位 置 及 强度 进 行 物 质 鉴 定 和 含 量 分 析 的 方 法 。 3 4 FLU与 UV-Vis的 比 较FLU UV-Vis光 谱 性 质 发 射 光 谱 吸 收 光 谱被 测 物 的 性 质 很 强 的 紫 外

2、-可 见 光 吸 收 有 紫 外 -可见 光 吸 收灵 敏 度 高 ， 10-10 10-12g/ml 一 般选 择 性 高 低但 在 光 谱 分 析 中 ， 荧 光 分 析 法 不 及 紫 外 -可见 分 光 光 度 法 普 遍 ， 这 主 要 是 由 于 有 机 分子 的 结 构 所 决 定 的 能 发 荧 光 的 物 质 较 少 5 N N NN N N N OHOH NHOHO H3CO O OHCH3 双 嘧 达 莫萘 普 生几 个 常 见 的 发 荧 光 的 药 物 6 黄 曲 霉 毒 素 结 构 7 苯 并 (a)芘 世 界 公 认 的 三 大 强 致 癌 物 质 是 黄 曲 霉

3、 毒 素 、 苯 并 芘 和 亚 硝 胺 8 N N NH N CH3H3C O O OHOHOHOH 核 黄 素 N O COOHF HN N 环 丙 沙 星 9 第 一 节 荧 光 分 析 法 的 基 本 原 理 一 ） 、 荧 光 的 产 生 分 子 内 部 能 量 之 间 的 关 系 物 质 对 光 的 选 择 性 吸 收 与 分 子 内 量 子 化 的内 部 运 动 紧 密 相 关 ： E总 =E电 +E振 +E转E电 为 电 子 运 动 的 能 级 ； 位 于 紫 外 可 见 光 区 域E 振 为 分 子 振 动 的 能 级 ； 主 要 用 于 红 外 光 谱 分 析E转 为 分

4、子 转 动 能 级 ， 很 微 弱 ， 难 以 测 到 纯 粹 的 E转一 分 子 荧 光 的 产 生 10基 态 ： 电 子 自 旋 配 对 ，多 重 度 =2s+1=1， 为 单重 态 ， 以 S0表 示 。 激 发 单 重 态 ： 分 子 吸 收 能量 ， 电 子 自 旋 仍 然 配 对 ，为 单 重 态 ， 称 为 激 发 单重 态 ， 以 S1， S2表 示激 发 三 重 态 ： 分 子 吸 收 能量 ， 电 子 自 旋 不 再 配 对 ，为 三 重 态 ， 称 为 激 发 三重 态 ， 以 T 1， T2.表 示 。 三 重 态 能 级 低 于 单 重 态(Hund规 则 ) 11

5、 2 分 子 的 电 子 能 级 与 激 发 过 程 分 子 的 电 子 能 态 的 激 发 包 含 了 电 子 从 基 态 轨道 跃 迁 到 激 发 轨 道 ， 分 子 的 能 量 随 着 增 加 。 大 多 数 分 子 含 有 偶 数 个 电 子 ， 处 于 基 态 时 ，电 子 成 对 地 填 在 能 量 的 最 低 各 轨 道 上 。根 据 Pauling不 相 容 原 理 ： 一 个 给 定 轨 道 的 两 个电 子 ， 自 旋 方 向 一 定 相 反 ， 自 旋 量 子 数 为 1/2 与 -1/2， 总 自 旋 量 子 数 S=0。 分 子 的 多 重 性 M=2S+1=1. 此

6、 种 情 形 称 为 单 重 基 态 (S 0)， 这 些 分 子 放 在磁 场 中 ， 没 有 发 生 能 级 分 裂 。 即 基 态 没 有 净 自 旋 。 电 子 轨 道 12 当 基 态 的 一 个 电 子 吸 收 光 辐 射 后 被 激 发 到 较 高的 电 子 能 态 时 ， 通 常 电 子 不 发 生 自 旋 方 向 的 改变 ， 此 时 两 个 电 子 的 自 旋 方 向 仍 然 相 反 ， 净 自旋 s=0， 这 时 分 子 处 于 激 发 单 重 态 (S*)。某 些 情 况 下 ， 电 子 在 跃 迁 过 程 中 还 伴 随 着 自 旋方 向 的 改 变 ， 这 时 分

7、子 的 两 个 电 子 的 自 旋 方 向相 同 ， 自 旋 量 子 数 都 是 1/2， 总 自 旋 量 子 数 s=1， 这 时 分 子 的 多 重 性 M=2S+1=3，称 为 激 发 三 重 态 (T*)。 13 根 据 洪 特 规 则 (Hund principle)， 处 于 分 立 轨上 的 非 成 对 电 子 ， 平 行 自 旋 要 比 自 旋 成 对 更 稳定 ， 因 此 ， 三 重 态 总 是 比 相 应 的 激 发 单 重 态 具有 更 低 的 能 量 。3. 分 子 吸 收 辐 射 的 特 点 分 子 吸 收 辐 射 是 一 种 激 发 过 程 ， 根 据 波 尔 兹曼

8、 (Boltzmann)分 布 ， 当 分 子 吸 收 了 紫 外 -可 见光 后 ， 基 态 分 子 中 的 电 子 只 能 跃 迁 到 激 发 单 重态 的 各 个 不 同 振 动 -转 动 能 级 ， 不 能 直 接 跃 迁 到激 发 三 重 态 的 各 个 能 级 上 。 14单 重 态 和 三 重 态 的 电 子 分 布 模 式 图A 单 重 基 态 B 激 发 单 重 态 C 激 发 三 重 态 E A B C 不 是直 接的 跃迁 ！ 15 激 发 单 重 态 激 发 三 重 态磁 性 抗 磁 顺 磁平 均 寿 命 10-8s 10-4s-1s跃 迁 情 况 允 许 跃 迁 禁

9、阻 跃 迁 能 量 高 一 些 低 一 些 激 发 单 重 态 与 激 发 三 重 态 的 比 较 16 4. 分 子 对 所 吸 收 到 的 辐 射 的 处 理根 据 能 量 最 低 原 理 ： 由 于 激 发 单 重 态 的 分 子 能量 较 高 ， 因 而 激 发 态 的 分 子 是 不 稳 定 的 ， 所 以会 通 过 辐 射 跃 迁 和 无 辐 射 跃 迁 等 方 式 释 放 出 多余 的 能 量 而 返 回 到 基 态 去 激 发 过 程 ， 在 去 激发 过 程 中 以 速 度 最 快 、 激 发 态 的 寿 命 最 短 的 途径 占 优 势 。去极化过程 无 辐 射 跃 迁辐

10、射 跃 迁 振 动 弛 豫 (vibrational relaxation)内 部 转 换 (internal conversion)外 部 转 换 (external conversion)系 间 穿 越 (intersystem crossing)荧 光 (fluorescence)磷 光 (phosphorescence) 17分 子 中 能 级 变 换 模 式 图 (Jablonski) S2 S1S 0 T1吸收 发射荧光 发射磷光 系 间 窜 越内 转 换 振 动 弛 豫能量 l 2l 1 l 3 外 转 换l 2 T2内 转 换 振 动 弛 豫 18 5. 相 关 名 词 术 语

11、vibrational relaxation 振 动 弛 豫 ： 处 于 激 发 态 的各 振 动 能 级 的 分 子 通 过 与 溶 剂 分 子 的 碰 撞 而 将部 分 能 量 释 放 出 来 ， 其 电 子 则 返 回 到 同 一 电 子激 发 态 的 最 低 振 动 能 级 的 过 程 只 能 发 生 在 同一 电 子 能 级 内 的 不 同 振 动 能 级 之 间internal conversion 内 部 能 量 转 换 ： 当 两 个 电 子激 发 态 之 间 的 能 量 相 差 较 小 以 致 振 动 能 级 发 生重 叠 时 ， 受 激 发 分 子 常 由 高 电 子 能

12、级 以 无 辐 射方 式 转 移 至 低 电 子 能 级 的 过 程 容 易 发 生 19 external conversion 外 部 能 量 转 换 ： 激 发 态 的分 子 与 溶 剂 分 子 或 其 它 溶 质 分 子 发 生 碰 撞 而 将部 分 能 量 以 热 能 的 形 式 释 放 出 来 降 低 荧 光 强度intersystem crossing 体 系 间 跨 越 ： 处 于 激 发 态的 分 子 的 电 子 发 生 自 旋 反 转 而 使 分 子 的 多 重 性发 生 改 变 的 过 程 。 如 S1*的 最 低 振 动 能 级 同 T1*的 最 高 振 动 能 级 重

13、 叠 时 ，则 有 可 能 发 生 S1* T1*使 荧 光 强 度 降 低 甚 至 熄 灭容 易 发 生 在 含 有 重 原 子 分 子 或 溶 液 中 存 在 O 2等顺 磁 性 物 质 中 。 20 fluorescence emission：激 发 单 重 态 内 部 转 换 或 振 动 弛 豫 S1*的 最 低 振 动 能 级发 射 h S0的 任 一 振 动 能 级 荧 光特 点 ： 1. 不 是 单 一 的 过 程 ， 借 助 了 振 动 弛 豫 和 内 部 转 换 的 过 程 2. 持 续 过 程 为 10-9 10-7s 3. 发 射 出 来 的 波 长 大 于 吸 收 的

14、激 发 波 长 4. 呈 现 带 状 的 光 谱 21 phosphorescence emission：体 系 间 跨 越 S* T1*的 最 低振 动 能 级振 动 弛 豫 发 射 h S0的 任 一 振 动 能 级 磷 光特 点 ： 1. 不 是 单 一 的 过 程 ， 借 助 了 振 动 弛 豫 和 体 系 间 的 跨 越 2. 波 长 大 于 荧 光 的 波 长 3. 持 续 过 程 为 10 -4 10s 4. 低 温 条 件 下 才 可 见 区 别 荧 光 和 磷 光 ？ 22 二 、 荧 光 的 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱荧 光 物 质 分 子 具 有 两 个 特 征

15、光 谱 ：1.激 发 光 谱 (excitation spectrum) 表 示 不 同 激 发 波 长 的 辐 射 引 起 物 质 发 射 某 一波 长 荧 光 的 相 对 效 率 。 固 定 发 射 波 长 ， 用 不 同 波 长 的 激 发 光 来 激发 荧 光 物 质 ， 记 录 荧 光 强 度 。2. 发 射 光 谱 (emission spectrum) 荧 光 光 谱 (fluorescence spectrum) 表 示 所 发 射 的 荧 光 中 各 种 波 长 的 相 对 强 度 。 固 定 激 发 波 长 ， 扫 描 该 波 长 激 发 所 引 起 荧 光物 质 分 子

16、发 射 不 同 波 长 的 相 对 强 度 。 23 荧 光 光 谱 的 性 质1.斯 托 克 斯 位 移 (Stokes shift) 荧 光 发 射 波 长 总 是 大 于 激 发 波 长 。原 因 ： 无 辐 射 跃 迁 ， 使 能 量 发 生 了 损 失 。300 400 500 nmF a b硫 酸 奎 宁 的 激 发 光 谱 (a)和 发 射 光 谱 (b) 24 2. 荧 光 光 谱 的 形 状 与 激 发 波 长 无 关原 因 ： 荧 光 光 谱 只 有 一 个 发 射 带 从 S1*的 最 低 振 动 能 级 向 基 态 回 落 过 程 中 发 射 辐 射 。3. 荧 光 光

17、 谱 与 激 发 光 谱 呈 镜 像 关 系F 280 360 440 520 600nm激 发光 谱 荧 光光 谱b 4b3b2 b1 b0c1 c2 c3 c4c0 25s0b4 b3 b2 b1 b0 c0 c1 c2 c3 c4 s1*V=4V=3V=2V=1V=0V=4V=3V=2V=1V=0 E4 E1E3E2E 3E4 E2E1蒽 的 能 级 跃 迁 26 二 荧 光 与 分 子 结 构1.荧 光 寿 命 与 荧 光 效 率 荧 光 寿 命 (fluorescence life time)当 除 去 激发 光 源 后 ， 分 子 的 荧 光 强 度 降 低 到 最 大 荧 光 强

18、度 的 1/e时 所 需 的 时 间 。利 用 分 子 荧 光 寿 命 的 差 别 ， 可 以 进 行 荧 光 物 质混 合 组 分 的 分 析 。 -Ktt eF F 0 -K0/e e fF F 0f设 t= 时 ， Ft为 F0的 1/e , 则0tln fF tF 1K f该 公 式 可 以 表 征 荧 光 寿 命 。 27 荧 光 效 率 (fluorescence efficiency)指 激 发态 分 子 发 射 荧 光 的 光 量 子 数 与 基 态 分 子 吸 收激 发 光 的 光 量 子 数 之 比 。 f = 发 射 荧 光 的 光 子 数吸 收 激 发 光 的 光 子

19、数如 果 荧 光 物 质 从 激 发 态 回 到 基 态 过 程 中 没 有 其他 去 极 化 过 程 与 发 射 荧 光 相 竞 争 ， 那 么 荧 光 分子 就 可 以 将 所 吸 收 的 辐 射 全 部 以 荧 光 的 形 式 发射 出 来 。 此 时 其 荧 光 效 率 为 1。 28 2. 有 机 化 合 物 分 子 结 构 与 荧 光 的 关 系 A. 强 的 紫 外 -可 见 光 吸 收 分 子 中 含 有 长 的 共 轭 键 (不 饱 和 度 高 )， 则容 易 发 生 跃 迁 ， 且 共 轭 性 越 强 ， 荧 光 强 度 越 大 。B. 较 高 的 荧 光 效 率 具 有

20、刚 性 平 面 ， 共 共 平 面 性 越 强 ， 则 容易 可 保 持 较 高 的 荧 光 效 率 。另 外 ， 一 个 有 机 物 能 否 发 荧 光 以 及 荧 光 的强 弱 还 受 取 代 基 团 的 影 响 。 29 苯ex=205nmem=278nmf 0.11 萘ex=286nmem=321nmf 0.29 f 0.36 蒽ex=356nmem=404nm 30 f 0.29联 苯 f 1.0芴芴 分 子 中 的 两 个 苯 环 不 能 自 由 旋 转 ， 为 刚 性 分 子 31 NOH Al3+8-羟 基 喹 啉 8-羟 基 喹 啉 铝荧 光 增 强 NO NON OAl 3

21、2 CC HH CC HH反 -1,2-二 苯 乙 烯 顺 -1,2-二 苯 乙 烯荧 光 荧 光 33 取代基 增 强 电 子 共 轭 程 度 使 荧 光 波 长 长 移NH2-, OH-, OCH3-等减 弱 电 子 共 轭 程 度 使 荧 光 减 弱 或 熄 灭COOH-, NO2-, -C=O, SH-及 卤 素 原 子 等不 影 响 键 对 荧 光 基 本 没 有 影 响如 R-, SO3H-等第 一 类 为 给 电 子 基 团第 二 类 为 吸 电 子 基 团 34 3. 荧 光 试 剂 在 荧 光 分 光 光 度 法 中 ， 常 使 用 某 些 荧 光 试 剂 ，使 之 与 被

22、分 析 物 质 发 生 反 应 ， 生 成 荧 光 效 应强 的 物 质 提 高 分 析 的 灵 敏 度 和 选 择 性 OO O荧 光 胺 能 与 伯 氨 基 反 应 ，生 成 的 衍 生 物Ex=390nm, Em=480nm 35 CHOCHO N(CH3)2 SO2Cl邻 苯 二 甲 醛常 作 为 氨 基 酸 含 量 测定 的 荧 光 反 应 试 剂 丹 磺 酰 氯 N(CH3)2 SO2NH2NH2 丹 磺 酰 肼 能 与 伯 、 仲 胺 基 及 酚羟 基 的 生 物 碱 反 应 ，产 生 比 较 强 的 荧 光 36 三 影 响 荧 光 强 度 的 外 部 因 素1. 温 度 T

23、， 荧 光 效 率 和 荧 光 强 度 。原 因 ： 分 子 间 的 碰 撞 加 强 ， 消 耗 了 部 分 能 量 。2. 溶 剂 极 性 ， 荧 光 波 长 ， 且 荧 光 强 度 。 黏 度 ， 荧 光 强 度 原 因 : 极 性 溶 液 中 ， 荧 光 分 子 *的 E 分 子 间 的 热 碰 撞 几 率 降 低那 么 磷 光 呢 ？ 37 3. 酸 度 溶 剂 的 pH值 会 使 分 子 的 结 构 发 生 改 变 ， 如 双键 位 移 ， 从 而 使 光 谱 性 质 发 生 变 化 。想 想 酸 碱 滴 定 中 指 示 剂 为 什 么 会 随 着 pH值 的 改 变而 颜 色 发

24、生 变 化 呢 ？4. 荧 光 熄 灭 剂(1)发 生 分 子 碰 撞 损 失 了 荧 光 物 质 的 能 量 ；(2)O2分 子 的 顺 磁 性 ， 促 进 了 体 系 间 的 跨 越 ， 诱 发 S 1* T1* (3) 荧 光 物 质 溶 液 浓 度 过 大 时 (1g/L)， 产 生 自 熄 灭 38 5. 散 射 光(1)瑞 利 散 射 光 (Reileigh scattering light) 光 子 与 物 质 分 子 发 生 弹 性 碰 撞 ， 没 有 能 量的 交 换 。(2)拉 曼 光 (Raman scattering light) 光 子 与 物 质 分 子 发 生 非

25、 弹 性 碰 撞 ， 光 子 与物 质 分 子 间 有 能 量 的 交 换 干 扰 荧 光 测 定 尤 其 是 波 长 比 入 射 光 更 长 的 拉 曼 光 ， 因 其与 荧 光 接 近 ， 因 此 必 须 采 取 措 施 消 除 。选 择 适 当 的 激 发 波 长 可 消 除 拉 曼 光 的 干 扰 39 强度 320 448 Ex=320nm硫 酸 喹 宁 350 448强度 320 360 Ex=320nm0.1mol/LH2SO4 350 400 Ex=350nm硫 酸 喹 宁Ex=350nm0.1mol/LH2SO4无 干 扰 有 干 扰 Raman光 谱 有 何 特 点 ？ 4

26、0 第 二 节 荧 光 定 量 的 分 析 方 法溶 液 中 物 质 的 荧 光 强 度 与 该 物 质 吸 收 光 量 子 的程 度 以 及 荧 光 效 率 有 关 成 正 相 关 关 系I0 F I 一 般 在 垂 直 方 向 观察 或 测 量 荧 光 强 度溶 液 中 荧 光 的 测 定1. 荧 光 强 度 与 物 质 浓 度 的 关 系荧 光 分 光 光 度 计 的 设 计 原 理 41 有 关 计 算设 溶 液 中 荧 光 物 质 浓 度 为 C， 液 层 厚 度 为 L。荧 光 强 度 正 比 于 被 测 荧 光 物 质 吸 收 的 光 强 度 ， 即 ： F(I0-I), F=K

27、 (I0-I) K 为 常 数 ， 其 值 取 决 于 荧 光 效 率 。 根 据 Beer定 律 ： I=I0 10-ECl -ECl -2.3ECl0 0=kI (1-10 )=kI (1-e )F 2 30 2 30 (-2.3ECl) (-2.3ECl) (-2.3ECl)= I 1-(1+ + + + )1! 2! 3!(-2.3ECl) (-2.3ECl)I - )2! 3! = 2.3ECl F KK 即 42 若 浓 度 C很 小 ， ECl也 很 小 ， ， 当 ECl0.05时2 30 (-2.3ECl) (-2.3ECl)I - )2! 3!= 2.3ECl F K 上

28、式 中 括 号 中 第 二 项 以 后 的 各 项 可 以 忽 略 。 得 F=2.3KI0ECl=KC因 此 ， 在 低 浓 度 时 ， 溶 液 的 荧 光 强 度 与 荧 光 物质 的 浓 度 成 正 比 荧 光 定 量 分 析 的 依 据 。注 意 ： 当 荧 光 物 质 溶 液 的 浓 度 太 高 时 ， 则 荧 光 响 应 值 与 浓 度 之 间 就 偏 离 了 线 性 关 系 。 43 2. 定 量 方 法(1) 校 正 曲 线 法 以 荧 光 强 度 为 纵 坐 标 ， 浓 度 为 横 坐 标 ， 建 立线 性 方 程 。 在 绘 制 标 准 曲 线 时 ， 常 采 用 系 列

29、中 某 一 对 照品 浓 度 作 为 基 准 ， 将 空 白 溶 液 的 荧 光 强 度 读 数调 至 0， 将 该 对 照 品 溶 液 的 荧 光 强 度 调 至 100%或 50%， 然 后 测 定 对 照 品 系 列 中 其 他 溶 液 的 荧光 强 度 F。 A. 每 次 校 正 的 样 品 应 采 用 同 一 对 照 品 溶 液 。 B. 如 果 对 照 品 对 光 不 稳 定 ， 则 可 以 用 另 外 一个 与 被 测 物 荧 光 光 谱 相 近 的 物 质 作 基 准 来 校 正仪 器 。 44 (2) 比 例 法 如 果 标 准 曲 线 能 够 通 过 原 点 ， 则 可 以

30、 直 接 进行 对 比 测 定 。 F Cx xF Cs sF F Cx x F F Cs s 00如 果 空 白 溶 液 的 F不 能 调 至 0， 则 按(3) 联 立 方 程 式 法 用 于 多 组 分 混 合 物 的 荧 光 分 析 。 45 NCH2CH3 O COOHF FHN N CH3 HCl 盐 酸 洛 美 沙 星200 285 323 400 350 445 600 F F激 发 光 谱 荧 光 光 谱 46 测 定 法 ： 用 0.1mmol/L的 盐 酸 配 制 浓 度 为 1.5ug/mL的溶 液 ， 进 行 光 谱 扫 描 ， 得 知 其 最 大 吸 收 波 长 为

31、285nm， 发 射 波 长 为 485nm。 同 时 用 HCl溶 液 作空 白 对 照 。 测 得 该 浓 度 的 洛 美 沙 星 的 荧 光 值 为 Fs , 另按 该 法 配 制 供 试 品 溶 液 ， 同 法 测 定 荧 光 响 应 值Fx ， 按 照 比 例 法 公 式 ， 计 算 ， 即 得 供 试 品 溶 液的 药 物 浓 度 。 xx ssFC CF 其 中 Cs=1.5ug/mL 47 第 三 节 荧 光 分 光 光 度 计1. 荧 光 分 光 光 度 计 由 光 源 、 激 发 单 色 器 、 发 射 单 色 器 、 样 品池 和 检 测 系 统 组 成 。激 发 单 色

32、 器 样 品 池 吸收物发 射 单 色 器检 测 器放 大 器指 示 器记 录 器Xe灯 48 2. 仪 器 的 校 正 A. 灵 敏 度 ： 直 接 影 响 方 法 的 检 出 限 。 一 般 用1ug/mL的 硫 酸 奎 宁 进 行 检 查 。 B. 波 长 C. 光 谱 ： 影 响 测 定 的 灵 敏 度 和 准 确 度 。原 因 ： 光 源 强 度 不 稳 定 ； 检 测 器 对 波 长 的 感 应 不 呈 线 性 。采 用 双 光 束 光 路 ， 即 用 一 个 参 比 光 来 抵 消 测 量误 差 。 49 第 四 节 荧 光 分 析 新 技 术1.激 光 荧 光 分 析 (las

33、er fluorometry) 优 点 ： 单 色 性 好 、 强 度 大 、 稳 定 性 高2. 时 间 分 辨 荧 光 分 析 (time-resolved fluorometry) 原 理 ： 利 用 不 同 物 质 的 荧 光 寿 命 的 不 同 ， 在 激发 和 检 测 之 间 延 缓 的 时 间 不 同 ， 以 实 现 分 别 检测 的 目 的 。 抗 干 扰 性 强 ， 可 用 于 复 杂 的 多 组 分的 分 析 。 504. 同 步 荧 光 分 析 (synchronous fluorometry) 原 理 ： 在 荧 光 物 质 的 激 发 光 谱 和 荧 光 光 谱 中

34、选择 一 适 宜 的 波 长 差 值 （ 通 常 为 ex与 em之差 )， 同 时 扫 描 发 射 波 长 和 激 发 波 长 ， 得 到 同 步荧 光 光 谱 。 Fsp(ex ,em)=KCFexFem 灵 敏 度 很 高 。 3. 荧 光 免 疫 分 析 (fluoroimmunoassay) 原 理 ： 利 用 荧 光 标 记 的 抗 原 与 抗 体 之 间 的 反 应进 行 分 析 。 用 于 生 物 化 学 、 免 疫 学 、 遗 传 学 和分 子 生 物 学 中 蛋 白 及 多 肽 的 分 析 。 51 5. 胶 束 增 敏 荧 光 分 析 (micellar sensitiz

35、ed fluorometry ) 原 理 ： 利 用 表 面 活 性 剂 (SDS)， 形 成 胶 体 溶 液 ，来 减 弱 被 分 析 物 由 于 分 子 热 运 动 所 造 成 的 能 量 损失 甚 至 荧 光 熄 灭 现 象 。 特点 适 用 范 围 广灵 敏 度 高稳 定 52 学 习 要 求1、 熟 悉 分 子 内 部 能 级 跃 迁 的 模 式 及 相 关 的 概 念2、 理 解 荧 光 发 射 和 磷 光 发 射 的 过 程3、 理 解 激 发 光 谱 与 荧 光 光 谱 的 含 义 ， 掌 握 荧 光 光 谱 的 特 点4、 熟 悉 荧 光 寿 命 与 荧 光 效 率 的 含

36、义5、 掌 握 影 响 有 机 物 质 荧 光 强 度 的 因 素6、 掌 握 荧 光 定 量 分 析 的 方 法 依 据 53 练 习 题一 、 选 择 题1. 根 据 下 列 结 构 ， 那 种 物 质 的 荧 光 效 率 最 大 A 苯 B 联 苯 C 蒽 D 萘2. 下 列 物 质 中 ， 哪 个 的 荧 光 强 度 最 大 A. 苯 酚 B. 硝 基 苯 C. 苯 甲 酸 D. 苯 甲 醛 54 3. 影 响 荧 光 强 度 因 素 有 A 分 子 结 构 的 稳 定 性 B. 分 子 的 取 代 基 团 C 溶 液 的 温 度 D. 溶 剂 的 性 质 E. 分 子 量 的 大 小

37、4. 光 和 物 质 分 子 发 生 碰 撞 ， 不 发 生 能 量 的 交 换 ， 仅 是 光 子 运 动 的 方 向 发 生 改 变 ， 这 种 光 是 A. 荧 光 B. 磷 光 C. 拉 曼 光 D. 瑞 利 光5.分 子 荧 光 法 与 紫 外 -可 见 光 光 度 法 的 主 要 区 别 是 A. 分 析 方 法 完 全 不 同 B. 仪 器 结 构 不 同 C. 灵 敏 度 不 同 D. 光 源 不 同 E. 光 谱 性 质 不 同6.下 列 关 于 荧 光 光 谱 的 说 法 中 不 正 确 的 是 A. 可 分 为 分 子 荧 光 光 谱 和 原 子 荧 光 光 谱 B. 影

38、 响 因 素 多 C. 当 激 发 光 停 止 后 ， 持 续 的 时 间 比 磷 光 长 D.可 进 行 定 性 分 析 和 定 量 分 析 55 7. 下 列 说 法 正 确 的 是 A 荧 光 物 质 的 浓 度 加 大 ， 荧 光 强 度 增 大 B 在 稀 溶 液 中 ， 荧 光 物 质 浓 度 加 大 ， 荧 光 强 度 增 大 C 溶 液 温 度 升 高 ， 荧 光 效 率 增 加 D 溶 液 温 度 升 高 ， 则 溶 液 黏 度 降 低 ， 荧 光 增 强8. 下 列 去 极 化 过 程 属 于 无 辐 射 跃 迁 的 是 A. 外 部 能 量 转 换 B. 体 系 间 跨

39、越 C. 磷 光 D. 振 动 弛 豫 E. 荧 光9. 下 列 关 于 紫 外 光 谱 与 荧 光 光 谱 的 比 较 不 正 确 的 是 A. 都 属 于 分 子 光 谱 B. 都 有 较 高 的 灵 敏 度 C. 都 是 吸 收 光 量 子 后 发 生 能 级 的 跃 迁 D. 光 谱 均 位 于 紫 外 光 区 域 56 三 、 判 断 题1. 分 子 的 外 层 电 子 在 辐 射 能 的 作 用 下 ， 吸 收 能 量 跃 迁 至 激 发 态 ， 再 以 无 辐 射 弛 豫 转 入 最 低 的 激 发 三 重 态 ， 然 后 再 跃 迁 回 基 态 的 各 个 振 动 能 级 上

40、并 产 生 辐 射 ， 这 种 发 光 现 象 称 为 分 子 荧 光 （ ）2. 荧 光 物 质 吸 收 了 某 种 波 长 的 紫 外 线 ， 才 能 发 射 荧 光 ， 吸 收 愈 强 ， 发 射 荧 光 也 愈 强 ， 因 此 二 者 图 谱 完 全 重 叠 （ ）3. 由 于 荧 光 物 质 浓 度 过 高 而 引 起 的 荧 光 减 弱 或 消 失 的 现 象 称 为 自 熄 灭 现 象 （ ）4. 电 子 的 共 轭 程 度 越 大 ， 则 荧 光 强 度 越 大 ， 荧 光 波 长 向 短 波 方 向 移 动 （ ）5. 将 分 子 中 能 发 射 荧 光 的 基 团 称 为

41、荧 光 团 。 荧 光 团 一 定 是 发 色 团 ， 但 发 色 团 不 一 定 是 荧 光 团 （ ） 实 例 ： 荧 光 法 测 定 复 方 炔 诺 酮 片 中 炔 雌 醇 的 含 量 取 供 试 样 品 20片 （ 31.538.5g/片 ） ， 研 细 ， 用 无水 乙 醇 溶 解 ， 转 移 至 250ml容 量 瓶 ， 水 浴 加 热 30min， 取 出 ， 放 冷 至 室 温 ， 用 无 水 乙 醇 稀 释 至 刻 度 ， 过滤 ， 弃 去 初 滤 液 ， 取 续 滤 液 5.00ml， 稀 释 至 10ml，作 为 供 试 品 ， 另 取 对 照 品 适 量 ， 在 285nm,307nm测定 样 品 与 标 准 的 荧 光 强 度 。 将 炔 雌 醇 标 准 品 乙 醇 溶 液 的 浓 度 配 成 1.4g/ml， 在同 样 测 定 条 件 下 ， 测 得 荧 光 强 度 ， 计 算 可 得 含 量 ，从 而 可 以 鉴 定 产 品 是 否 合 格 问 题 ： 为 何 将 炔 雌 醇 标 准 品 乙 醇 溶 液 的 浓 度 配 成1.4g/ml这 样 低 的 浓 度 才 测 定 其 荧 光 强 度 ？ 测 定 时 是 否 应 控 制 温 度 保 持 一 致 ？ 为 什 么 ？