临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法

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1、临 床 PCR检 验 标 本 的 处 理 、保 存 及 核 酸 提 取 方 法卫 生 部 临 床 检 验 中 心 李 金 明 临 床 标 本 的 正 确 采 集 、 运 送 、 保 存的 重 要 性l 临 床 检 验 的 质 量 保 证 关 键 性 环 节l 解 决 涉 及 实 验 室 检 验 的 医 患 纠 纷 的 方 法之 一 核 酸 提 取 的 重 要 性l 核 酸 提 取 是 临 床 PCR检 验 最 为 关 键 的 部 分 ， 亦是 手 式 操 作 的 主 要 部 分l 核 酸 提 取 的 成 败 关 系 到 临 床 PCR检 验 的 正 确 与否l 临 床 PCR检 验 操 作 中

2、 最 易 出 问 题 的 环 节 标 本 采 集l 标 本 采 集 时 间 对 扩 增 检 测 结 果 的 影 响 l 标 本 采 集 部 位 的 准 备 l 标 本 的 类 型 和 采 集 量 l 采 样 质 量 的 评 价 l 采 样 及 运 输 容 器 l 标 本 采 集 中 的 防 污 染 标 本 运 送 l 样 本 一 经 采 集 ， 则 应 尽 可 能 快 的 送 至 检 测 实 验室 。l 样 本 中 如 加 入 了 适 当 的 稳 定 剂 ,如 用 于 RNA测定 加 入 GITC的 血 清 (浆 )样 本 和 用 于 DNA测 定 的EDTA抗 凝 血 等 ,则 可 在 室

3、温 下 运 送 或 邮 寄 。l 实 验 室 应 根 据 待 测 靶 核 酸 的 特 性 ， 对 各 种 临 床样 本 的 运 送 条 件 作 出 相 应 的 规 定 。 临 床 标 本 的 处 理 和 保 存l 血 清 （ 浆 ）l 全 血l 外 周 血 单 个 核 细 胞l 痰l 棉 拭 子l 脓 液l 体 液l 乳 汁 l 组 织 血 清 （ 浆 ）l DNA测 定 ， 可 按 照 一 般 的 血 清 标 本 处 理 程 序 ，对 测 定 影 响 不 大 。l RNA测 定 ， 标 本 的 获 取 和 保 存 方 式 对 测 定 结 果 ，可 能 有 决 定 性 影 响 。 最 好 是

4、使 用 EDTA抗 凝 (严禁 使 用 肝 素 ， 因 其 对 PCR扩 增 有 抑 制 ， 且 很 难在 核 酸 提 取 过 程 中 完 全 去 除 )全 血 标 本 ， 抗 凝后 6小 时 内 分 离 血 浆 ， 如 使 用 血 清 标 本 ， 则 需尽 快 (2小 时 内 )分 离 血 清 ， 标 本 的 短 期 （ 1 2周 ）保 存 可 在 -20 下 ， 较 长 期 保 存 应 在 -70 下 。 全 血l 以 全 血 作 为 待 测 标 本 时 ,必 须 注 意 抗 凝 剂 的 选择 ,一 般 使 用 EDTA-Na2或 枸 椽 酸 钠 ,不 可 使 用 肝素 。l 全 血 样

5、本 如 用 于 DNA提 取 检 测 ,可 4 下 短 期 保存 ,如 用 于 RNA检 测 ， 则 应 在 取 血 后 ， 尽 快 提取 RNA 。 外 周 血 单 个 核 细 胞 l 外 周 血 单 个 核 细 胞 可 从 抗 凝 全 血 制 备 ， 主 要 有两 条 途 径 ， 一 是 使 用 淋 巴 细 胞 分 离 液 分 离 制 备 ；二 是 使 用 红 细 胞 裂 解 液 ,裂 解 全 血 中 的 红 细 胞 ,经 生 理 盐 水 数 次 洗 涤 ,即 可 得 到 单 个 核 细 胞 。l 外 周 血 单 个 核 细 胞 如 暂 不 提 取 核 酸 ,可 保 存 于 -70 下 .

6、 痰l 痰 属 于 分 泌 物 ,临 床 上 常 用 作 为 结 核 杆 菌 DNA测 定 标 本 。l 痰 标 本 中 含 有 大 量 粘 蛋 白 和 杂 质 ,故 在 核 酸 提 取 时 ,需对 样 本 进 行 初 步 处 理 ， 即 用 1 mol/L NaOH或 变 性 剂 液化 。l 如 用 于 非 结 核 杆 菌 如 肺 炎 支 原 体 的 PCR检 测 ， 痰 标 本只 能 室 温 悬 浮 于 生 理 盐 水 中 ， 充 分 振 荡 混 匀 ， 促 使 大块 粘 状 物 下 沉 ， 取 上 清 离 心 ， 所 得 到 的 沉 淀 物 即 可 用于 核 酸 提 取 。 l 液 化

7、标 本 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取 ,可 保 存 于 -70 下 。 痰 标 本 处 理 的 基 本 模 式l通 用 模 式l简 单 模 式 痰 标 本 处 理 通 用 模 式l 试 剂 ： （ 1） 通 用 标 本 处 理 （ Universal sample processing, USP） 溶 液 ： 由 4-6 mol/L盐 酸 胍（ GuHCl） ， 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 25 mmol/L EDTA, 0.5%Sarkosyl和 0.10.2 mol/L -巯 基 乙 醇 。 （ 2） 0.05%Tween 80。 （ 3）10%Chel

8、ex-100( 含 0.03% Triton X-100和 0.3% Tween 20) 痰 标 本 处 理 简 单 模 式 l 试 剂 ： （ 1） 裂 解 液 :含 终 浓 度 0.1 mol/L NaOH、50g蛋 白 酶 K和 0.05% Triton X-100 痰 标 本 处 理 中 要 注 意 的 问 题l 痰 标 本 在 没 有 加 入 内 标 以 控 制 假 阴 性 的 情 况下 ， 不 能 采 用 异 硫 氰 酸 胍 盐 （ GuSCN） 方 法提 取 。 采 用 这 种 方 法 提 取 ， 有 可 能 会 在 提 取过 程 中 ， 出 现 一 种 可 修 饰 DNA的 酶

9、 ， 在 最 后一 步 提 取 中 ， 与 核 酸 一 起 洗 提 出 来 ， 从 而 抑制 其 后 的 扩 增 。l 在 PCR主 反 应 混 合 液 中 ， 加 入 -酪 蛋 白（ alpha-casein） 、 白 蛋 白 等 ， 有 防 止 此 类 抑制 物 产 生 的 效 果 。 棉 拭 子l 在 使 用 PCR方 法 检 测 性 病 病 原 体 时 ,临 床标 本 一 般 为 棉 拭 子 ,可 将 棉 拭 子 置 于 适 量生 理 盐 水 中 ,充 分 震 荡 洗 涤 后 ,室 温 静 置5 10分 钟 ,待 大 块 状 物 下 沉 后 ,取 上 清 立即 离 心 ,其 后 的 沉

10、 淀 即 可 用 于 DNA提 取 。l 如 不 立 即 用 于 核 酸 提 取 ,则 需 保 存 于 -70下 . 脓 液l 脓 液 的 处 理 依 情 况 而 定 ,如 用 于 分 枝 杆 菌 (如结 核 杆 菌 )核 酸 测 定 的 标 本 ,粘 稠 的 脓 液 可 采用 痰 标 本 的 处 理 模 式 ， 先 进 行 液 化 ， 再 离 心取 沉 淀 提 取 DNA； 水 样 的 脓 液 则 直 接 离 心 ,沉 淀 用 生 理 盐 水 洗 2 3次 后 ,即 可 用 于 DNA提 取 。l 对 于 用 于 非 分 枝 杆 菌 测 定 的 脓 液 标 本 ,如 过 于粘 稠 ,则 加

11、入 适 量 生 理 盐 水 ,充 分 振 荡 后 ,静 置 ,取 上 清 立 即 离 心 ,沉 淀 用 于 DNA提 取 ;如 为 水样 ,则 按 上 述 直 接 离 心 取 沉 淀 即 可 。 l 沉 淀 标 本 的 保 存 条 件 同 样 为 -70 。 体 液l临 床 体 液 标 本 包 括 胸 水 ,腹 水 ,脑 脊液 ,尿 液 等 ,可 按 水 样 标 本 的 方 式 离心 取 沉 淀 后 ,提 取 核 酸 。 沉 淀 样 本 的保 存 同 上 。 乳 汁l 乳 汁 有 时 也 可 作 为 标 本 ， 如 乳 汁 中 HBV DNA、HCV RNA、 结 核 分 枝 杆 菌 和 布

12、鲁 氏 菌 等 的PCR检 测 。 乳 汁 中 布 鲁 菌 DNA的 提 取l 试 剂 准 备 NET缓 冲 液 : 50mmol/L NaCl, 125mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl pH7.6; 24%十 二 烷 基 硫 酸 钠 （ SDS） ; 蛋 白 酶 K; RNase。 乳 汁 中 分 枝 杆 菌 DNA的 提 取l 试 剂 准 备 裂 解 液 ： 50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫 氰 酸 胍 盐 （ GITC） , 0.3 mol/L 醋 酸 钠 。 玻 璃

13、珠 ： （ 直 径 ： 425-600um） 组 织 l 组 织 有 新 鲜 组 织 块 和 石 蜡 切 片 。 新 鲜 组 织 块 的 处理 步 聚 首 先 用 生 理 盐 水 洗 两 次 ,然 后 将 其 捣 碎 或 切碎 ， 加 入 生 理 盐 水 后 剧 烈 震 荡 混 匀 ,离 心 ， 弃 上 清 ，再 用 蛋 白 酶 K消 化 后 提 取 核 酸 。 新 鲜 组 织 最 好 是保 存 于 50%乙 醇 中 ,具 体 作 法 是 ， 先 用 生 理 盐 水 将组 织 洗 一 次 ,切 成 宽 度 小 于 1cm的 小 片 ,加 入 适 量 的生 理 盐 水 ,然 后 ,边 摇 边 加

14、 入 无 水 乙 醇 至 终 浓 度 为50%.这 样 固 定 的 组 织 标 本 室 温 下 可 保 存 数 日 ,4可 保 存 6年 。l 石 蜡 切 片 用 于 核 酸 提 取 ,需 先 用 辛 烷 或 二 甲 苯 脱 蜡 ,再 用 蛋 白 酶 K消 化 后 即 可 进 行 DNA提 取 。 临 床 标 本 的 滤 纸 上 保 存l 临 床 标 本 置 于 经 过 处 理 的 滤 纸 片 上 ， 如 靶 核 酸 为DNA， 可 室 温 保 存 数 月 至 数 年 ， 如 靶 核 酸 为 RNA，则 可 稳 定 数 周 。 l 保 存 在 滤 纸 上 的 标 本 ， 保 存 时 间 长 ，

15、 还 可 因 为 标本 中 的 PCR抑 制 物 如 血 红 蛋 白 、 酶 、 免 疫 球 蛋 白等 吸 附 于 滤 纸 上 ， 而 不 对 后 面 的 扩 增 检 测 造 成 影响 。 l 不 管 是 全 血 、 血 清 （ 浆 ） 。 还 是 尿 液 、 粪 便 、 分泌 物 等 均 可 此 种 方 法 。 临 床 标 本 中 PCR反 应 抑 制 物l 内 源 性 的 :免 疫 球 蛋 白 、 蛋 白 酶 、 血 红 素 及 其代 谢 产 物 、 白 细 胞 内 的 乳 铁 蛋 白 、 肌 红 蛋 白 、脂 类 、 粘 蛋 白 、 尿 素 、 离 子 、 胆 盐 、 多 糖 等 。 l

16、 外 源 性 的 :如 肝 素 抗 凝 剂 、 纤 维 素 和 硝 酸 纤 维素 、 过 度 UV照 射 后 的 矿 物 油 、 手 套 滑 石 粉 、标 本 容 器 或 采 样 器 材 上 含 有 的 抑 制 物 。 肝 素 的 作 用 机 理 l 肝 素 对 MLV逆 转 录 酶 和 TAQ DNA聚 合 酶 均 很 强 的 抑制 作 用 ， 如 果 临 床 标 本 为 肝 素 抗 凝 ， 则 在 核 酸 纯 化 过程 中 ， 标 本 中 的 肝 素 可 结 合 于 DNA和 RNA上 ， 尽 管肝 素 和 核 酸 本 身 都 带 正 电 荷 。l 对 标 本 进 行 煮 沸 、 凝 胶

17、过 滤 、 酸 碱 处 理 后 凝 胶 过 滤 、反 复 乙 醇 沉 淀 等 均 不 能 去 除 肝 素 的 这 种 干 扰 作 用 。l 每 g核 酸 标 本 中 加 入 0.1U的 肝 素 ,即 可 100%的 抑 制 酶活 性 。 l 在 标 本 中 加 入 肝 素 酶 I 或 13 U/g核 酸 (于 5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 2小 时 ) 可 去 除肝 素 的 抑 制 作 用 。 血 红 蛋 白 、 乳 铁 蛋 白 （ lactoferrin）l 血 红 蛋 白 和 乳 铁 蛋 白 分 别 是 红 细 胞 和 白 细 胞

18、内 的 主 要PCR抑 制 物 ,它 们 均 含 有 铁 。l 抑 制 机 制 可 能 是 ： （ 1） 与 这 些 蛋 白 释 放 铁 离 子 至PCR混 合 物 中 有 关 。 研 究 铁 的 抑 制 效 应 时 ， 发 现 其 干扰 DNA合 成 ， 而 且 胆 红 素 、 胆 盐 和 氯 化 高 铁 血 红 素（ Hemin） 等 血 红 蛋 白 衍 生 物 ， 也 是 PCR抑 制 物 。 （ 2）亚 铁 血 红 素 (Heme)可 通 过 返 馈 抑 制 调 节 DNA聚 合 酶 活性 及 协 调 红 细 胞 内 血 红 蛋 白 成 分 的 合 成 。 也 观 察 到 ，氯 化 高

19、 铁 血 红 素 通 过 直 接 作 用 于 DNA聚 合 酶 ， 与 成 为一 个 与 靶 DNA竞 争 的 抑 制 剂 和 核 苷 酸 的 非 竞 争 性 抑 制剂 。 （ 3） 由 于 靶 核 酸 DNA被 血 液 中 大 量 的 凝 血 有 机物 质 包 裹 所 致 ， 使 得 靶 DNA不 能 接 触 DNA聚 合 酶 。 血 红 蛋 白l 1%(V/V)血 液 可 完 全 抑 制 Taq酶 活 性 ， 与 Mg2+浓 度 无 关 。 Tth聚 合 酶 在 含 4%（ V/V） 血 液 的PCR反 应 混 合 液 中 可 以 进 行 扩 增 ， 加 入 1U单 链DNA结 合 蛋 白

20、 T4基 因 32蛋 白 (gp32)， Tth聚 合 酶 在 含 8%（ V/V） 血 液 情 况 下 ， 仍 可 扩 增 。因 此 ， 使 用 Tth聚 合 酶 和 gp32蛋 白 ， 可 实 现 从临 床 标 本 不 提 取 纯 化 核 酸 直 接 扩 增 靶 DNA。l 不 同 的 热 稳 定 的 DNA聚 合 酶 对 临 床 标 本 中 的 抑制 物 的 敏 感 性 不 一 样 。 IgG l IgG的 抑 制 作 用 是 由 于 其 与 单 链 DNA的相 互 作 用 ， 使 得 靶 DNA不 能 与 DNA聚合 酶 相 互 作 用 l使 用 煮 沸 作 为 标 本 处 理 方 法

21、 或 使 用PCR前 的 热 启 动 ,将 增 强 IgG对 PCR反 应的 抑 制 去 除 或 减 轻 抑 制 的 一 些 方 法lNaOH处 理 可 中 和 临 床 标 本 中 的 Taq DNA聚 合 酶 抑 制 剂 ， 但 这 种 方 法 不适 用 于 DNA含 量 低 的 标 本 ， 因 为NaOH处 理 可 使 DNA大 量 丢 失 。 去 除 或 减 轻 抑 制 的 一 些 方 法l 加 入 0.6% (wt/vol)牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 可 降低 血 液 对 Taq DNA聚 合 酶 的 抑 制 效 应 ， 既 使 在2%（ vol/vol） 血 液 存 在 下

22、 亦 可 成 功 扩 增 ， 而通 常 血 液 含 量 只 能 是 0.2%。l BSA也 可 增 加 rTth或 Taq DNA聚 合 酶 的 扩 增 能力 ， 使 其 对 粪 便 和 肉 类 标 本 中 抑 制 物 的 抵 抗 能力 分 别 提 高 10和 20倍 。l 单 链 DNA结 合 T4基 因 32蛋 白 （ gp32） 有 类 似BSA的 增 强 效 应 。 核 酸 纯 化l 核 酸 分 离 纯 化 技 术 起 源 于 二 十 世 纪 五 十 年 代 ，在 七 十 年 代 和 八 十 年 代 中 传 统 的 核 酸 沉 淀 溶 解分 离 纯 化 方 法 得 到 了 普 遍 的

23、应 用 和 推 广 。l 传 统 的 核 酸 提 取 方 法 常 涉 及 去 垢 剂 裂 解 、 蛋 白酶 处 理 、 有 机 溶 剂 提 取 及 乙 醇 沉 淀 等 步 骤 。 一 般 核 酸 提 取 试 剂 促 使 靶 核 酸 从 细胞 内 释 出 的 原 理l 靶 核 酸 可 以 与 宿 主 细 胞 整 合 ， 核 内 游 离 及 胞 浆内 各 种 构 形 存 在 于 细 胞 内 ， 如 测 定 的 是 病 原 微生 物 ,则 靶 核 酸 存 在 于 细 菌 、 病 毒 、 原 虫 或 真 菌细 胞 内 ， 如 果 上 述 细 胞 破 裂 ,则 靶 核 酸 亦 可 存 在于 细 胞 外

24、。 l 一 般 均 使 用 去 垢 剂 (如 Triton-100)裂 解 细 胞 ， 用一 种 蛋 白 裂 解 酶 (如 蛋 白 酶 K)消 化 结 合 于 核 酸 的蛋 白 质 ， 从 而 将 靶 核 酸 从 细 胞 内 释 放 出 来 。 核 酸 的 分 离 纯 化 l 核 酸 的 分 离 纯 化 就 是 要 将 蛋 白 、 脂 类 等干 扰 核 酸 扩 增 的 物 质 去 除 。 l 经 典 方 法l 硅 吸 附 法l 对 于 商 品 核 酸 提 取 试 剂 盒 ， 临 床 实 验 室在 使 用 前 ， 必 须 对 其 核 酸 提 取 纯 度 和 效率 进 行 评 价 。 DNA提 取

25、 的 经 典 方 法l即 所 谓 的 ”酚 -氯 仿 提取 法 ” RNA提 取 的 独 特 性l 临 床 标 本 及 实 验 室 环 境 中 ,存 在 大 量 对RNA具 有 强 烈 降 解 作 用 的 RNase， 而RNase较 耐 高 温 ,不 易 失 活 。l 如 何 避 免 RNase对 标 本 的 污 染 及 防 止RNase对 提 取 的 RNA的 降 解 ,是 保 证 RNA成 功 提 取 的 关 键 之 所 在 。 RNA提 取 所 用 器 皿 的 处 理l 经 高 压 灭 菌 的 一 次 性 使 用 的 塑 料 制 品 如 试 管 ,离 心 管 等基 本 上 无 RNas

26、e,可 以 不 经 预 处 理 直 接 用 于 制 备 和 贮 存RNA. l 实 验 室 用 的 普 通 玻 璃 器 皿 经 常 有 RNase污 染 ,使 用 前 必须 于 180 干 烤 8小 时 以 上 ,或 用 0.1%焦 碳 酸 二 乙 酯(DEPC)的 水 溶 液 浸 泡 用 于 制 备 RNA的 烧 杯 ,试 管 和 其它 用 品 。l DEPC是 RNase的 强 烈 抑 制 剂 。 灌 满 DEPC的 器 皿 于37 下 放 置 2小 时 ， 然 后 用 灭 菌 水 淋 洗 数 次 ， 并 于100 干 烤 15分 钟 ， 最 后 高 压 蒸 汽 下 15分 钟 。 上 述

27、 处理 可 除 去 器 皿 上 痕 量 的 DEPC,以 防 DEPC通 过 羧 甲 基化 作 用 对 RNA的 嘌 呤 碱 基 进 行 修 饰 。 RNA提 取 所 用 溶 液 的 准 备 l 对 于 RNA提 取 所 需 溶 液 的 配 制 ,必 须 用 高 压 灭 菌 的 水和 RNA研 究 专 用 的 化 学 试 剂 配 制 溶 液 ,用 干 烤 过 的 药匙 称 取 试 剂 ,将 溶 液 装 入 无 RNase的 玻 璃 器 皿 。 可 能 的话 ,溶 液 均 应 用 0.1%DEPC于 37 至 少 处 理 12小 时 ,然 后于 100 加 热 15分 钟 或 高 压 蒸 汽 灭

28、 菌 15分 钟 。l 须 注 意 的 是 ,DEPC可 与 胺 类 迅 速 发 生 化 学 反 应 ,因 此 不能 用 来 处 理 含 有 Tris一 类 的 缓 冲 液 ,因 此 可 存 几 瓶 新 的 ,未 开 封 的 Tris试 剂 以 制 备 无 RNase的 溶 液 。 RNA提 取 中 RNase 污 染 的 控 制l 实 验 操 作 人 员 的 手 是 RNase污 染 最 主 要 的 潜 在来 源 。 l 策 略 是 ： 在 准 备 用 于 RNA纯 化 的 实 验 材 料 和 溶 液 时 ,以 及在 涉 及 RNA的 整 个 提 取 操 作 过 程 中 ,都 应 戴 一次

29、性 手 套 。 在 RNA提 取 实 验 中 ， 应 勤 换 手 套 。 RNA提 取 的 常 用 方 法 l 表 面 活 性 剂 加 蛋 白 酶 K， 氯 仿 -酚 抽 提 法 。l 胍 盐 提 取 结 合 氯 仿 -酚 抽 提 法 。l 胍 盐 提 取 结 合 玻 璃 粉 、 二 氧 化 硅 等 颗 粒 悬 浮 吸附 法 等 。 异 硫 氰 酸 胍 （ G uSCN） 结 合 氯 仿 -酚 提 取 法 核 酸 提 取 的 改 良 方 法 l 旋 转 离 心 柱 （ SPIN COLUMN） 方 法l 玻 璃 粉 吸 附 法 l 二 氧 化 硅 （ Se） 或 硅 藻 吸 附 法 l 微 量

30、 全 血 核 酸 提 取 法 ： NaI 方 法l 其 它 方 法 ： 疏 水 性 Immobilon-P膜 、 全 自动 核 酸 纯 化 仪 旋 转 离 心 柱 （ SPIN COLUMN）l 属 于 硅 吸 附 方 法 的 一 种 。 在 原 理 上 现 行 的 旋 转 离 心 柱系 统 通 常 可 分 为 三 个 部 分 ： 第 一 部 分 是 利 用 裂 解 液 促使 细 胞 破 碎 ， 使 细 胞 中 的 核 酸 释 放 出 来 ； 第 二 部 分 是把 释 放 的 核 酸 特 异 地 吸 附 在 特 定 的 硅 载 体 上 ， 当 然 这种 载 体 只 对 核 酸 有 较 强 的

31、亲 和 力 和 吸 附 力 而 对 其 它 的生 化 组 分 如 蛋 白 质 、 多 糖 、 脂 类 则 不 相 亲 和 也 不 吸 附 ；第 三 部 分 是 把 吸 附 在 特 定 载 体 上 的 核 酸 洗 脱 下 来 ， 从而 得 到 纯 化 的 核 酸 。 玻 璃 粉 吸 附 法 二 氧 化 硅 （ Se） 或 硅 藻 吸 附 法 使 用 NaI的 微 量 全 血 核 酸 提 取 法 靶 核 酸 提 取 的 质 量 l 纯 化 的 靶 核 酸 的 完 整 性 ： 可 使 用 凝 胶 电 泳 将 样本 的 核 酸 提 取 物 与 一 核 酸 标 准 比 较 测 定 。 l 核 酸 提 取

32、 的 产 率 ： 可 在 A260读 数 测 定 。l 核 酸 纯 度 ： 可 通 过 提 取 物 A260/A280比 率 判 定l 血 清 或 血 浆 中 病 原 体 核 酸 纯 化 纯 度 ： 采 用 一 种间 接 的 方 法 ， 即 使 用 已 知 病 原 体 含 量 的 溶 血 和/或 脂 血 标 本 用 待 评 价 试 剂 提 取 ， 然 后 进 行 扩增 检 测 ， 比 较 所 得 到 的 结 果 临 床 标 本 核 酸 提 取 中 可 能 存 在 的 非 源自 标 本 的 抑 制 和 干 扰 物 质 l 核 酸 提 取 中 ： 许 多 试 剂 如 乙 二 胺 四 乙 酸(EDT

33、A)、 去 垢 剂 如 十 二 烷 基 硫 酸 盐 (SDS)和chaotrope试 剂 如 异 硫 氰 酸 胍 和 盐 酸 胍 等 、 酚 、氯 仿 、 乙 醇 等 有 机 溶 剂 。 核 酸 样 本 制 备 及 扩 增 检 测 的 质 控l对 临 床 标 本 中 可 能 存 在 的 抑 制 /干 扰 物 的 质 控 措 施 l核 酸 提 取 及 扩 增 有 效 性 的 质 控 对 临 床 标 本 中 可 能 存 在 的抑 制 /干 扰 物 的 质 控 措 施l质 控 措 施 ： 采 用 内 质 控（ internal control, IC） （ 通 常 称为 内 标 ） 的 方 法 l内 标 有 两 种 ,即 竞 争 性 的 和 非 竞争 性 的 内 标 。 谢 谢 ！